低温医学原理

・1・

・低温医学与生殖医学专题・

细胞低温生物学研究进展

王沛涛1, 何立群2, 舒志全2, 赵　刚2, 李　强1

(1　青岛大学医学院附属医院低温医学科, 山东青岛　266003; 　2　中国科学技术大学热科学及能源工程系低温生物医学工程研究所)

　　众所周知, 离体的人体细胞、组织和器官在常规方式下不能长期保存。为保持这些离体生命材料的生物学功能, 必须采用长期保存措施。而在生物医学研究中, 比如细胞动力学、基因、干细胞治疗等, 也希望某一阶段细胞能长期保持, 以保证有充分的时间进行研究。本文简要讨论目前为止所发现的这些因素以及相应的低温损伤机制和预防措施。其中, 包括最著名的Peter Mazur 关于低温损伤的两点假定。

1　细胞的低温保存

目前, 低温保存是最常见的长期保存方法。细胞在低温下可以长期保存的机制在于低温下细胞的新陈代谢急速减慢。保存温度越低, 新陈代谢越慢, 保存时间也就越长。比如, 各个血液中心的血液常常在-5℃下保存, 保存时间一般为1个月; 如果在-196℃下保存, 应该能保存几个世纪。

由于低温冰箱内温度恒定(-86℃

) , 而常压下液氮的沸点为-196℃, 所以这两个温度是经常采用的保存温度。

低温保存的主要优点是:①便于库存大量的细胞和组织, 便于对供者和受者的免疫性进行鉴定和配型; ②便于各医疗单位之间实施细胞及组织的长途调配; ③在移植之前, 能有足够的时间检测甚至消灭细胞及组织中的遗传疾病。

但实验发现, 低温保存过程本身也会杀伤细胞及损害组织, 这与低温保存的目的相矛盾。细胞及组织的这些损伤源于上面保存过程中的一个步骤或者它们的综合作用。低温生物学的一个极其重要的研究内容就是揭示与细胞及组织低温损伤相关的物理学和生物学规律, 尤其是那些与细胞内外水结冰相关的损伤。理解这些原理有助于建立生物物理2数学模型, 以描述低温保存过程中细胞对环境变化的反应, 从而为长期低温保存细胞和防止低温损伤研制最佳的降温程序及设备。本文回顾并讨论细胞低温损伤机制及其防范措施等基本低温生物学原理。

实际应用中, 细胞的低温保存主要包括如下步骤:①添加低温保护剂(CPA ) ; ②安全降温; ③在某一温度下长期保存; ④安全复温; ⑤取出低温保护剂。从常温到保存温度之间来回变化, 细胞内外的溶液就非常容易发生相变, 细胞外溶液的渗透压增大, 尤其是-15～-60℃[1], 对于细胞来讲是致命的, 因此低温生物学的首要任务就是确定细胞如何能安全地降温和复温。

[收稿日期]2004208217; 　[修订日期]2004212228

[基金项目]中国科学院“百人计划”、国家自然科学基金(50160106) 、安徽省自然科学基金(00047520) , 以及中国科学技术大

学生命科学院生物基地资助项目

[作者简介]王沛涛(19652) , 男, 博士, 副教授。

2　常温下细胞的渗透损伤

向水中加入溶质会降低水的冰点, 一般来说, 溶质浓度越高, 冰点就越低, 因此成功进行低温保存的第一步就是添加恰当的低温保护剂, 而且高浓度溶质对细胞有渗透性损伤, 因此要适量。自50年以前, 英国一个研究小组偶然发现甘油是精子和红细胞的有效低温保护剂以来, 虽然不断出现新的CPA , 比如乙二醇、甲醇、丙二醇及二甲亚砜(DMSO ) , 有的也更加有效, 但甘油至今仍然是有效的CPA 之一。所有这些CPA 共有的最重要特征, 就是在大多数情况下, 能够稳定渗入细胞且在浓度为1mol/L 或稍稍偏上时对细胞相对无毒。

CPA 的保护功能体现在可以降低溶质(电解质) 浓度,

从而减缓低温下细胞的收缩[2], 而保护程度则首先取决于细胞内外CPA 对溶质的摩尔比, 即CPA 的保护作用一般具有依数性。某一CPA 对一个给定细胞是否有效, 取决于细胞对该CPA 的渗透性以及CPA 的毒性。此类CPA 必须依靠渗透来保护细胞, 但降温前的渗透和复温后的清除都会带来细胞体积的变化。这种变化如果超过其自身极限就可能造成伤害[3]。

添加低温保护剂后, 细胞脱水和渗透性低温保护剂渗入的传质过程可描述为[4]:

dt

=L P A R T [(M i n -M e n ) +σ

(m s i -m e

s ](1)

i i 2dt =V -V m s (1-σ) b

-　　　

i

(1+V +A P s (m e

s -m s i 2)

s m s i )

dt

) (　　公式中, V 为细胞体积,V b 为细胞内非溶液体积, V s 为溶质的偏摩尔体积, A 为细胞表面积, t 为时间, T 为温度, R 为普适气体常数, L p 为细胞膜对水的渗透系数, P s 为细胞膜对低温保护剂渗透系数, M 为等渗重摩, m 为质量摩尔数。下标n 表示盐份, s 表示低温保护剂, 上标i 表示细胞内, e 表示细胞外, σ表示反射系数(σ=0是非选择性渗透膜的情况; 而σ=1表示只有溶剂渗透, 对所有溶质都不渗透的情况) 。

实验表明, 添加CPA 后, 细胞先脱水, 体积开始收缩, 随后CPA 渗入, 体积随之扩张。如果CPA 的浓度过高, 其体积会过度收缩以至超过细胞的忍受极限而导致损伤。同理, 在取出CPA 时如过度稀释, 细胞会过度吸水以至膨胀超过其允许上限, 也会导致损伤。最近的研究表明, 对人类精子, 甘油的负面影响主要归咎于添加和去除甘油所带来的渗透体积的变化, 而不是特定的化学反应。在这项研究中, 确定

・2・了精子体积可逆变化的区间。超过这个区间极限, 细胞就会遭受到不可逆损伤。根据细胞膜对水及CPA 渗透率, 确定了细胞体积的变化极限, 并用于研究向精子添加和从精子中去除甘油的最佳多步操作程序, 以防止渗透损伤细胞。

另一类CPA 属于非渗透性, 包括糖、聚乙烯吡硌丙酮

(PV P ) 、羟乙基淀粉(H ES ) 、聚乙二醇(PEG ) 及葡聚糖。大

多数情况下, 其本身不具有保护作用, 但通常会增强渗透性

CPA 的保护作用, 或者降低渗透性CPA 的浓度。这些非渗

透性CPA 有助于加速溶液的玻璃化, 稳定蛋白质和细胞膜, 以及防止进一步的结冰。

3　降温过程中细胞的损伤3. 1　降温过程中的损伤

在降温过程中, 当温度降至-5℃左右时, 细胞及其周围递质还未冻结, 都处于过冷状态, 在-5～-15℃之间, 细胞外溶液开始结冰(自然结冰或人工种晶结冰) , 如果假定细胞膜阻止了冰晶生长进入细胞, 则细胞内没有结冰, 仍处于过冷状态。此时细胞内部水的化学势增大, 水开始渗出细胞, 然后在细胞外结冰, 随后细胞的反应则取决于降温速率。如果冷却过快, 细胞就没有充足的时间通过渗出水来维持内外溶液的渗透压平衡, 使细胞内溶液过冷, 最终细胞内开始结冰(简称胞内冰, IIF ) 而使细胞内外达到渗透压平衡[6]。根据实验数据和理论推导,Muldrew 等[7]提出了胞内冷冻损伤的渗透撕裂假定和模型, 认为降温过程中水穿过细胞膜后引发了细胞内结冰。Diller 等[8]研制了新型的显微技术, 用以观察降温过程中细胞行为, 以及胞内结冰温度和动力过程。最近, 在各向异相成核理论、热力学以及实验结果基础上, Toner 等[9]提出一个IIF 模型, 以描述胞内冰形成概率与降温速率、温度以及细胞低温生物学性质之间的关系。低温保护剂对水的传输、成核结晶以及冰晶生长都有影响, 因而降温过程中细胞的反应会因添加低温保护剂而有所变化。

Karlsson 等[10]考虑了存在CPA 时IIF 模型, 以预测胞内冰

的形成和生长过程(为降温速率、温度和CPA 浓度的函数) 。

如果降温速率很慢, 细胞就有充分的时间脱水, 细胞内部溶液浓度就逐渐升高, 过冷度开始消失, 胞内冰就不容易产生。然而如果降温过慢, 在到达共晶温度(所有成分均结晶) 之前, 细胞就会因长期处在高浓度溶液(主要为电解质) 环境之下过度收缩而造成细胞损伤。Lovelock [11]推断, 溶液浓度增加及细胞脱水对细胞膜的类脂蛋白化合物有不良影响, 即其功能减弱以及类脂和磷脂的流失增加, 使电解质能够通过细胞膜而进入细胞, 直至细胞膨胀破裂。Levit [12]推测细胞质丢失水分会使蛋白恰好进入某一位置, 使得原本因距离太远、氢键结构太牢固而不能形成的一些化学键有形成的机会。但复温过程会破坏这些新化学键, 使之开解和变性。Karow 等[13]认为, 呈晶格排列的束缚水对于细胞完整性来讲是必不可少的, 但慢速降温使束缚水在降温过程中因参与结冰而离开蛋白质, 造成细胞损伤。

Mazur 等[14]对慢速降温下溶液浓度变化带来的细胞损

伤, 即“溶液效应”, 进行了归纳。指出慢速降温下细胞在高浓度溶液下如暴露时间过长“, 溶液效应”会得到强化。他同时也指出, 超渗应力也会导致非渗透性溶质(即电解质) 的流入或流出。当细胞返回到等渗环境时, 细胞膨胀后的体积会超过其等渗体积从而溶解。Meryman [15]指出, 慢速降温会导致细胞体积小于其临界体积。随着细胞外部渗透压增大, 细胞体积会缩小, 但内部受压的细胞质抵制后续缩小变形的趋势也逐步增大。这势必导致细胞膜两侧的静压增大, 从而使细胞膜破坏。有关这方面的研究, 其他人也相继提出了有价值的理论[16,17]。

总的来讲, 降温过快或过慢, 都能杀死细胞。Mazur 对细胞的这一类低温损伤总结出的两点假定至今仍然是低温生物学的基础:(a ) 在慢的降温速率下, 低温损伤源于“溶液

效应”

(即高溶液/溶质浓度下, 细胞严重脱水) ; (b ) 快速降温下, 低温损伤源于致命的胞内冰[14]。对于特定细胞, 必然存在一个具有最高细胞回收率的最佳降温速率。该降温速率慢得足以防止胞内冰, 同时也快得足以使“溶液效应”最小, 即细胞成活率与降温速率之间呈倒“U ”形曲线关系。

这里, 降温速率过高或过低是相对于细胞膜的渗水性而言的, 与细胞的类型有关。不同细胞, 细胞膜对水的渗透率有很大的差异, 这导致了不同细胞对应的最佳降温速率有所不同。细胞膜对水的渗透性是一个很重要的参数, 其测量方法也成为低温生物学中的一个重要课题。有作者研制和提出了确定细胞膜水通透性的仪器和模型[18,19]。Devireddy 等[20]研制了一个新的差示扫描量热法(DSC ) 来确定降温过程中细胞的渗透性。差示扫描量热法是在程序控温下测量输入样品和参比物的功率差与温度关系的一类技术。记录的热谱图称之为DSC 曲线,DSC 曲线中出现的热量变化峰或基线突变对应于样品的转变温度。与其他热分析手段相比,DSC 对热效应的响应更快、更灵敏、峰的分辨率更好, 更有利于定量分析。

3. 2　防止低温损伤的玻璃化方法

上面所讨论的快速降温容易胞内冰生成, 但如果采用超快速降温(>106℃/min ) 或使用高浓度CPA , 细胞质将形成玻璃态而不是胞内冰。然而, 超快速降温在技术上有一定难度。在慢速降温中有效改善降温损伤的几种CPA 也可以用来促进玻璃化, 但所需的浓度太高(4～8mol/L ) , 对细胞、组织来讲毒性太大。最近, 美国高大勇教授和他的课题组发现了微波与不同浓度防冻剂相互作用对水溶液的玻璃化具有显著促进作用[21]。目前, 他们正在研制一种新型单模微波腔, 以实现在CPA 浓度较低和慢降温速率条件下的玻璃化降温方法。

4　贮存时间和复温损伤4. 1　贮存损伤

低温保存样品的贮存温度为-70℃或-70℃以下。人们不禁要关心, 细胞在冷冻状态下能完好保存多长时间。当温度在-120℃以下时, 此问题大概没什么实际意义; 当温

・3・

度为-196℃时, 此问题绝对无实际意义。在-196℃, 在小于地质时间的尺度内不存在热驱动的(生化) 反应。所能发生的是宇宙辐射直接损伤的缓慢积累过程, 但这需要贮存几个世纪才能明显体现出来。

4. 2　复温损伤

经历了零下降温过程的细胞在复温过程中同样要面临危险。与降温过程一样, 复温过程对细胞的存活也会构成威胁, 其结果取决于前面降温过程是否诱发产生了胞内冰或者细胞脱水。如果有胞内冰产生, 快速复温能防止冰晶长大

(即反玻璃化) , 可以挽救一些细胞。即便慢速降温过程中无

胞内冰形成, 细胞对复温速率的响应也取决于冷冻条件和细胞类型, 很难找出最好的答案。对于精子, 以前报道了很多经验方法, 其复温速率也不一样。这些复温方法包括使用空

气、温水(5～37℃) , 放在衣袋里甚至研究人员的手里等。Mahadevan [22]做了一项比较全面的研究, 复温速率为9. 2～2140. 0℃/min 。使用衣袋、手、空气(5,20或37℃) 或水浴(5,20,37,55或75℃) 等方法, 降温均采用从+5～-80℃

的标准降温过程(降温速率10. 0℃/min ) 。结果表明, 复温速率最快的2例(1837. 0和2140. 0℃/min ) 与其他12个复温速率的方案在细胞活性上具有明显差别, 但从活性和体外染色上看, 在20或35℃空气中以较慢的速率复温是最好的。Mahadevan 也考察了降温速率和复温速率之间的关系。结果显示, 缓慢复温对于缓慢降温的样品是最理想的; 但是对于快速降温的样品来说, 复温速率的影响不大。这大概由于在快速降温过程中细胞早已在复温前被胞内冰杀死。

5　冰点以上低温区的“冷冲击”

降温过程中, 有的细胞在冰点以上也会被杀死。比如, 各类精子的低温保存都要进行预冷。预冷温度区间为体温或收集样品温度(统称为环境温度) 至+5℃, 并以较低的降温速率降温。总的来讲, 这样做的原因是一些物种的精子在这个温度区间对温度的变化比较敏感, 骤冷(高的降温速率) 经常会使细胞产生不可逆损伤。这一现象称为“冷冲击”或寒伤”。不同种类的精子对“冷冲击”的敏感性不一样。公牛、公羊、公猪和牧马的精子对“冷冲击”相当敏感, 狗和猪的次之, 兔子和人的精子相对来讲不敏感[22]。人的精子抵御冷冲击”的能力对研究人类精子的降温方法具有特殊的重要性。这也是不同物种细胞类型低温生物学差异的一个重要范例, 同时也说明, 根据研究家畜得到的降温方法, 直接应用于其他物种, 不可能产生最佳低温保存效果。目前“冷冲, 击”的机制还不清楚。

6　其他低温损伤机制

在低温生物学中, 细胞常常简化为由细胞膜和细胞质构成的系统, 而细胞低温保存是否成功主要看细胞膜是否破坏, 其模型细胞一般取红细胞。但对于其他细胞, 比如粒细胞, 采用这个模型就过于简单, 因为细胞内部的膜结构以及细胞器等, 对于细胞活性也非常重要。这些内部结构在低温

保存过程中的变化, 目前还知之甚少[23]。如果细胞膜没破而细胞内的膜结构或者细胞器受到损伤, 则细胞也会失去活性, 因此进一步考察这些内结构经历低温保存后的情况是非常必要的。目前, 用于此研究的模型细胞采用精子。这是由于精子具备两个能清晰界定和观测的特性:活性和顶体反应现象。低温生物学中, 顶体反应一个令人感兴趣的地方是它包括了细胞膜的融合。目前一个逐渐升温的观点是细胞膜的融合是低温细胞损伤的主要原因[24], 观测降温过程对该过程的影响可以为此项研究提供一个实验模型。精子如果功能完好无损, 它就应该能到达受精地点, 接触卵细胞, 能激发并进行顶体反应, 穿过卵外面的夹层, 再同卵细胞膜融合。冷冻能够干预或消减其中的一个或若干步骤。尽管流动的精子不见得具有完整的功能, 但不能流动的精子或正经历细胞损伤的精子几乎肯定功能丧失(在独立受精环境中) 。最后, 在估计影响细胞存活的关键性参数时, 各个方面的生物功能指标都需要检查。

尽管不同类型细胞或不同哺乳类物种同种细胞的低温生物学性质千差万别, 但对它们进行低温保存必须遵循一定的原则, 这包括:①细胞必须在没有或极少胞内冰的情况下降温。②复温过程中, 保证细胞内不发生再结晶或反玻璃化, 即便有小的胞内冰, 在复温过程中也不能使其长大。③即使上面条件满足了, 大多数细胞也难以成活, 除非含有足够的低温保护剂。这些低温保护剂要在冷冻前添加, 复温后清除, 同时还要保证不超过细胞的渗透允许极限, 浓度也不能高到有毒的程度。

随着对细胞低温损伤机制认识的逐步加深, 在低温生物学研究领域内, 不断涌现出各种物理模型和数学公式, 以更好地确定细胞在保存过程中对环境变化的响应以及预测最佳低温保存条件等[6,9]。这些模型的预测能力已经被来自植物、哺乳动物胚胎等各种细胞类型的数据所证实[3,6,7,9]。应用这些模型确定具体细胞的低温保存方法时, 首先需要确定细胞的一系列低温生物学特性, 包括:①细胞体积和表面积, 连同细胞内非活性体积; ②细胞膜对水及低温保护剂的渗透性, 连同细胞对低温保护剂的反射系数, 及其随温度的变化; ③不同温度下的细胞体积可逆变化范围; ④胞内结冰温度; ⑤动力学及热力学异相成核参数等。很多细胞的这些参数目前才刚刚开始展开研究。这些特性参数的确定以及低温损伤机制和低温保护剂的低温保存机制是低温生物学的基础课题。另外, 多细胞系统的低温损伤和低温保存的机制和模型, 比如组织和器官[25], 以及新型低温保护剂的机制, 比如防冻蛋白及细胞凋亡抑制剂等也是研究焦点[26]。

[关键词]　细胞; 低温保存; 生物学; 综述[中图分类号]　R318. 52　　[文献标识码]　A [文章编号]　100820341(2005) 0120001204

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(本文编辑　马伟平)

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