内源性一氧化碳参与呼吸节律调节

生理学报 Acta Physiologica Sinica, June 25, 2007, 59 (3): 325-330http://www.actaps.com.cn

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研究论文

内源性一氧化碳参与呼吸节律调节

杨文星，张奇兰，呼海燕，刘 谨，李永波，周 华，郑 煜*

四川大学华西基础医学与法医学院生理学教研室，成都 610041

摘 要：本文旨在探讨内源性一氧化碳(carbon monoxide, CO)对呼吸节律的调节作用。采用新生Sprague-Dawley大鼠，制备离体延髓脑片标本，分别灌流CO、血红素氧合酶(heme oxygenase, HO)底物高铁血红素(hemin)和HO抑制剂ZnPP-9，观察舌下神经根呼吸样传出放电节律的变化。实验分为5组：单纯人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid, ACSF)对照组、ZnPP-9组、外源性CO组、Hemin组和ZnPP-9 + Hemin组。结果如下：在ZnPP-9组，舌下神经根节律性放电频率(dischargefrequency, DF)增快(P

Involvement of endogenous carbon monoxide in regulation of respiratory rhythmin vitro

YANG Wen-Xing, ZHANG Qi-Lan, HU Hai-Yan, LIU Jin, LI Yong-Bo, ZHOU Hua, ZHENG Yu*

Department of Physiology, West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Chengdu 610041, ChinaAbstract: The aim of the present study was to investigate the effect of endogenous carbon monoxide (CO) on respiratory rhythm. Theexperiments were carried out on the medullary slices of newborn Sprague-Dawley rats. The rhythmic discharge frequency (DF) ofhypoglossal rootlets was taken as an index of rhythmic respiratory activity. The slices of medulla oblongata were superfused withZnPP-9 (inhibitor of heme oxygenase), CO and hemin (substrate of heme oxygenase), respectively, to observe their effects on respiratoryrhythm. The preparations were divided into 5 groups: control group of artificial cerebrospinal fluid (ACSF), group of ZnPP-9, group ofexogenous CO, group of hemin and group of ZnPP-9 + hemin. The results obtained were as follows. In ZnPP-9 group, the rhythmic DFof the hypoglossal rootlets was increased (P

Key words: carbon monoxide; heme oxygenase; respiration; in vitro; newborn rat

由于一氧化碳(carbon monoxide, CO)可以与氧气竞争性地结合血红蛋白，曾长期被认为仅是一种有毒物质。然而，1949年Sjostrand[1]发现人体可产生内源性CO；1981年Meyer[2]发现CO和一氧化氮(nitric oxide, NO)可与很多酶的铁-硫中心相互作用

Received 2007-01-16 Accepted 2007-04-15

而导致酶失活；1986年，两种血红素氧合酶(hemeoxygenase, HO)在大鼠体内被发现[3]; 1987年，Brune和Ullrich[4]发现CO可以通过激活鸟苷酸环化酶(guanylyl cyclase, GC)而抑制血小板聚集。在这些研究基础上，Marks等[5]推测内源性CO可能具有一

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 30370530) and the Specialized ResearchFund for the Doctoral Program of Higher Education of China (No. [1**********]).

*

Corresponding author. Tel: +86-28-85503433; Fax: +86-28-85503204; E-mail: [email protected]

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定的生理作用。1993年，Verma等[6]采用原位杂交方法研究发现，结构型HO (HO-2) mRNA广泛分布于大鼠的大脑组织，且与可溶性GC (soluble GC,sGC) mRNA具有很高的共表达现象；他们发现在离体培养的嗅觉细胞中，HO选择性抑制剂ZnPP-9可减少内源性cGMP的产生，从而证实了内源性CO确实具有一定的生理作用。因此，CO被认为既是一种毒性气体分子，又是一种具有特定生物学活性的神经信息分子。此后，对CO的研究逐渐深入，已有报道表明，它可作为重要的神经递质或调质，参与心血管调节[7]、体温调节[8]和呼吸调节[9]。

内源性CO主要来源于HO对具有血红素(heme)基团的底物[如高铁血红素(hemin)]的催化。HO是内源性CO产生过程中的关键酶，已被发现有3种亚型，即诱导型HO-1[3]、结构型HO-2[10]和结构型HO-3[11]。Heme可在HO的催化下，生成CO、铁离子和胆绿素。三种亚型HO均可被ZnPP-9、SnPP-9和ZnDPBG等金属卟啉类物质所抑制，进而减少内源性CO的生成。

Mazza等[12]采用RT-PCR及荧光免疫染色等方法，发现延髓头端腹外侧区(rostral ventrolateralmedulla, RVLM)的C1区、前包钦格复合体(pre-Bötzinger complex, PBC)区和外侧网状核区有HO-2表达，慢性低氧可以诱导上述区域HO-1表达；在电生理实验中，他们发现SnPP-9可使离体培养的RVLM区神经元去极化，从而导致其放电频率(dischargefrequency, DF)增加[13]。根据这些资料，我们推测内源性CO可能在呼吸节律调节中发挥重要作用。

本研究采用新生Sprague-Dawley (SD)大鼠，制备离体延髓脑片标本，分别灌流ZnPP-9、CO和hemin，观察舌下神经根节律性放电活动的变化，探讨内源性CO对呼吸节律的调节作用。

1 材料与方法

1.1 延髓脑片的制备　 实验用新生SD大鼠(0~3d，雌雄不拘，由成都中医药大学实验动物中心提供)，经乙醚麻醉后，于C3~C4段颈髓平面断头。将标本迅速转移至KCl浓度为3 mmol/L的人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid, ACSF) (mmol/L): NaCl129、KCl 3、CaCl2 2、MgSO4 1、NaHCO3 21、KH2PO41、glucose 30，pH 7.40，0oC。去除颅顶皮肤及颅骨，在中脑-脑桥之间横断脑组织，小心剥离横

断面以下的脑组织，保留舌下神经根。之后迅速将标本移至切片槽内，背侧向上；刀刃向头端倾斜20°，于闩前500μm左右及闩后700 μm左右处切下延髓脑片(含舌下神经根)，片厚1 000~1500 μm。该脑片含有PBC、疑核、下橄榄核、孤束核和舌下神经核等结构。整个过程控制在5 min内。将制备好的延髓脑片，迅速转移至灌流槽中，以ACSF持续灌流(pH 7.40；29~30 oC；4~6 mL/min); 将ACSF中KCl浓度提高到7 mmol/L以获得稳定的舌下神经根放电，并调整NaCl浓度到125 mmol/L以维持渗透压平衡。脑片在该ACSF中孵育30 min后开始实验。整个实验过程中，各组ACSF均持续充以含95% O2-5% CO2的混合气体；并监测ACSF的pH值，将pH值维持在7.40。

1.2 实验分组　　实验分为5组：单纯ACSF对照组(n=8)、ZnPP-9组(n=8)、外源性CO组(n=8)、hemin组(n=8)和ZnPP-9 + hemin组(n=8)。对照组以单纯ACSF灌流脑片；ZnPP-9 (20μmol/L)组以含ZnPP-9的ACSF灌流脑片13 min；外源性CO组在ACSF灌流前15 min给予95% O2-5% CO2混合气体的同时，充以纯CO，灌流开始后停止充CO，使其CO饱和；hemin (50 μmol/L)组以含有hemin的ACSF灌流脑片8 min；ZnPP-9 + hemin (20 μmol/LZnPP-9和50 μmol/L hemin)组先以含ZnPP-9的ACSF灌流脑片5 min，再以同时含hemin和ZnPP-9的ACSF灌流8 min。所有给药组给药结束后，继续以单纯ACSF灌流脑片，洗脱药物。

1.3 数据记录　　用内含铂金丝的吸附电极负压吸引舌下神经根，将记录到的神经根自发放电信号经前置放大器放大(×100)后，输入BL-420E智能型生物信号采集和处理系统(成都泰盟科技有限公司)进行处理(时间常数τ=0.001 s，滤波F=1 kHz)，并进行记录和分析。以舌下神经根放电作为节律性呼吸活动的指标，分析呼吸频率的改变。开始灌流给药前，记录正常舌下神经根放电5 min作前对照，然后连续记录给药时和给药后的舌下神经根放电40min，总记录时间为45 min。

1.4 数据分析　　以5 min为单位，对舌下神经根DF均值进行统计学分析，所有数据均以means±SEM表示，用SPSS13.0统计软件对实验数据进行带有协变量的两因素重复测量的方差分析，P

杨文星等：内源性一氧化碳参与呼吸节律调节

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2 结果

2.1 单纯ACSF对照组舌下神经根放电情况

单纯ACSF对照组脑片舌下神经根DF为6 次/min左右(表1)，在40 min观察时间内，未见明显变化

(P>0.05)，如表1和图1所示。

2.2 ZnPP-9对舌下神经根放电的影响

ZnPP-9组脑片给予ZnPP-9后，除5、20、40min时DF无明显变化(P>0.05)外，其余各时段DF均表现为加快(P

表1. ZnPP-9、CO、hemin及ZnPP-9 + hemin灌流新生大鼠离体延髓脑片后的舌下神经根节律性放电频率

Table 1. The rhythmic discharge frequency (times/min) of hypoglossal rootlets of medullary slices in newborn rats treated with ZnPP-9, CO,hemin and ZnPP-9 + heminTime (min) 0 5 10 15 20 25 30 35 40

*

Control5.95±0.266.05±0.336.03±0.216.05±0.265.93±0.265.83±0.255.93±0.286.15±0.266.15±0.26

ZnPP-94.88±0.244.90±0.225.28±0.23*5.28±0.27*5.25±0.275.50±0.21**5.40±0.25*5.48±0.24*5.35±0.26

CO6.25±0.545.68±0.58*4.90±0.51**5.58±0.60**6.25±0.636.58±0.636.65±0.666.58±0.606.60±0.64

Hemin5.78±0.546.00±0.506.15±0.48*6.48±0.626.38±0.55*6.25±0.48*6.40±0.50**6.45±0.53*6.58±0.53*

ZnPP-9 + hemin 4.53±0.46 4.40±0.51 4.75±0.49 5.15±0.54* 5.18±0.48** 5.05±0.52* 5.10±0.45* 4.95±0.38 5.00±0.30*

P

图1.ZnPP-9、CO、hemin及ZnPP-9 + hemin组大鼠离体延髓脑片舌下神经根节律性放电的原始记录

Fig.1.Raw recording of the discharge of hypoglossal rootlets of medullary slices in ZnPP-9, CO, hemin and ZnPP-9 + hemin groups.

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时段变化率见表2。

与单纯ACSF对照组比较，ZnPP-9具有使DF加快的趋势，但是只有在给药后25 min时，DF加快有统计学意义(P

CO组脑片给予外源性CO后5、10、15 min时，舌下神经根DF减慢(P

12 min时)恢复至给药前的对照水平(表1和图1); 各时段DF变化率见表2。

与单纯ACSF对照组比较，CO组在给药后5、10、15 min时，DF减慢有统计学意义(P

2.4 Hemin对舌下神经根放电的影响

Hemin组脑片给予hemin后，除5和15 min时DF无明显变化(P>0.05)外，其余各时段DF均表现

表2. ZnPP-9、CO、hemin及ZnPP-9 + hemin灌流新生大鼠离体延髓脑片后舌下神经根节律性放电频率变化的百分率

Table 2. Rate of change in the discharge frequency of hypoglossal rootlets of medullary slices induced by superfusion of ZnPP-9, CO, heminand ZnPP-9 + hemin in newborn rats

Time (min)

[**************]

*

Control (%) 1.45±2.45 1.70±2.35 2.01±3.08−0.26±2.17−1.85±2.52 0.03±4.06 3.87±3.87 3.95±3.97

ZnPP-9 (%)

0.68±1.508.62±2.638.51±3.158.85±5.8913.71±3.93**11.34±3.6113.79±6.2210.84±5.58

CO (%)

−9.74±2.96**−21.90±3.14**−11.68±2.19**−0.51±2.32 4.94±3.24 6.26±4.21 5.11±3.01 5.20±3.11

Hemin (%)

4.83±3.377.76±2.5912.27±4.71*11.01±3.29*9.59±3.20*11.95±2.90*12.69±3.8215.35±4.24

ZnPP-9 + hemin (%) −3.30±1.86 5.48±2.63 14.52±4.10 15.41±3.51* 11.35±3.20* 14.30±3.92 13.05±6.30 15.12±6.96

P

图2.ZnPP-9、CO、hemin及ZnPP-9 + hemin对新生大鼠离体延髓脑片舌下神经根放电节律的影响

Fig.2.Effects of ZnPP-9, CO, hemin and ZnPP-9 + hemin on the rhythmic discharge of hypoglossal rootlets of medullary slices innewborn rats. DF, discharge frequency. *P

杨文星等：内源性一氧化碳参与呼吸节律调节

为加快(P

与单纯ACSF对照组比较，hemin组在给药后15~30 min期间，DF加快有统计学意义(P

2.5 ZnPP-9和hemin联合使用对舌下神经根放电的影响

在ZnPP-9 + hemin组脑片，给药后DF呈加快趋势，15~30 min和40 min时段具有统计学意义(P

与单纯ACSF对照组比较，可见给药后20和25min时DF加快(P

与ZnPP-9组比较，DF变化没有统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

虽然产生节律性呼吸活动的确切机制尚不明了，但是早已证明延髓是基本呼吸中枢的所在部位。近十多年来，许多研究资料表明RVLM的PBC在呼吸节律的发生中起关键作用[14]。舌下神经核受呼吸中枢的驱动，因而部分支配上呼吸道的舌下神经纤维具有呼吸节律性放电，通常为吸气性放电。1991年Smith等[15]首次建立了新生大鼠延髓脑片舌下神经根呼吸节律样放电记录方法，并用于呼吸节律产生和调节机制的研究。随后，该方法被广泛应用。本研究中，我们采用该方法对内源性CO在呼吸节律调节中的作用进行研究。

目前，关于内源性CO在呼吸调节中作用的研究主要集中在颈动脉体。Prabhakar等[9]发现，HO-2表达于猫和大鼠颈动脉体球细胞胞浆中；HO抑制剂ZnPP-9可增强窦神经放电，外源性CO可以抑制ZnPP-9对窦神经的兴奋效应。此外，Yang等[16]发现ZnPP-9可以增强低氧引起的呼吸兴奋，但对高碳酸血症所产生的呼吸效应作用甚微；切断双侧窦神经后，ZnPP-9即失去对低氧性呼吸效应的兴奋作用。这些资料表明，内源性CO可通过颈动脉体对呼吸产生抑制作用。

HO在中枢神经系统中分布广泛。在正常情况下，与呼吸调节密切相关的PBC[12]、舌下神经核[12]、面神经核[12,17]和孤束核[18]等区域均有HO-2阳性表达神经元；此外，低氧或氧应激可以诱导这些区域的HO-1表达[12,19]。这些资料一方面表明内源性CO可能

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参与生理性呼吸调节，另一方面也表明CO可能参与某些病理情况下的呼吸调控。Mazza和Neubauer[13]在离体培养的RVLM区神经细胞观察到，ZnPP-9可以使细胞电活动增强，因此认为内源性CO可以使呼吸节律减慢。

实验观察到， ZnPP-9灌流脑片可使舌下神经根DF增加，而外源性CO可使舌下神经根DF降低。表明CO可以使呼吸节律减慢，延髓呼吸相关神经元能够产生内源性CO，HO抑制剂ZnPP-9减少了内源性CO的产生，进而加快呼吸节律。

在本实验中， hemin灌流脑片引起舌下神经根呼吸样放电节律加快，与CO实验结果相反。Hemin是HO的底物，可以在HO的催化下生成CO、Fe3+和胆绿素。已有大量研究表明[20]，内源性CO可通过激活sGC，使cGMP含量增加而发挥舒张血管作用；然而Imai等[21]却观察到相反的现象，发现血管平滑肌细胞HO过表达可以降低NO诱导的血管舒张。Koglin和Behrends[22]对这种矛盾现象进行了进一步研究，发现其主要原因在于hemin分解产物胆绿素的作用，他们证实胆绿素是一种内源性的sGC抑制剂。因此，我们认为hemin引起脑片呼吸样放电节律加快，可能是由其分解产物胆绿素造成的。

此外，在本实验条件下，外源性CO对呼吸节律的影响会随着洗脱很快消失；而hemin和ZnPP-9的兴奋效应持续时间较长。这可能是由于三种物质的理化性质不同引起的。CO是气体分子，易于渗透脑组织，也易于被洗脱；而hemin和ZnPP-9颗粒较大，不易扩散，一经扩散也不易被洗脱。在实验中，经CO灌流的脑片，其颜色在灌流前后没有明显改变；而经hemin或ZnPP-9灌流的脑片，其颜色在灌流后有所加深。这可能是上述三种物质理化性质不同导致其作用时间长短不同的推断的佐证，但尚待证实。

目前，普遍认为PBC是产生呼吸节律的关键部

位，已有报道指出，PBC有HO-2阳性表达神经元[12]

。本实验中所用标本含有PBC，所以我们认为CO对呼吸节律的调节作用可能是通过作用于PBC实现的。本实验所用标本为较厚的延髓脑片，含有较多的神经结构；此外，吴中海等[23,24]曾报道面神经后核内侧区在呼吸节律的产生中具有重要作用。因此不能排除PBC之外的其他神经结构可能参与CO介导的呼吸节律减慢。

综上所述，延髓内源性CO对节律性呼吸活动

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具有抑制性调节作用，其作用途径和机制尚待进一步研究。

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