酵母双杂交技术

酵母双交常杂技术规

．双杂一系统交原及应用理范

蛋白质之围间互作的很是多反应机分制子平水的核心作动，DN如合成、A录激活、蛋转 质翻白、蛋白质译位和信定号转导等所的有的反应的成都完涉及蛋白到复质合的体作用而。 随着酵母杂双统系成的和完熟，善在其白质互作蛋究研的中用越来越广应泛酵。双母杂交系统 是于转录基子因典的型构结征所特建的立它，利用了母的转录因酵子AG4基L产因物该蛋白 ，拥有个典型的转两录子结构因DN域结合A结构域（ B）D与转录活结激构（域 A ）。D前者 结合AL1启G子区的动DNA列序，者则激后活转录Fie（ls dadnS nog19，98）。Feldsi和 oSg分n 构建了别有含含有码编GL4 DAA结合结N域（构AL4BGD）GA和L转录激活结4构（AL4ADG序 列）载的体。我们所要将究的研的目因基分装别载这到个两质载体粒，两个中构域序列则结 别与分基因的OFR行进融合当。入转应酵相母菌后，株在若酵母内达表的同不蛋发白生互，则作 将使ALG4BD和G-LA4-D相互A近靠合结，再一进步与上游活序激列结，合活激应相报告基因 （eroptrg nee）的表。达

特 点 与 优 点母酵双交系统的杂主要的应用是快速最、直接析分知已白之蛋间相的作互用分及离新 与已知的白蛋作用配体及的其编基因码。酵双杂母交系检统测白之间蛋的相作用互具以有下 优： （点1）用信号是作在融基因合表达， 后在胞内细建转录因重的子用作给而出， 的省了去 化蛋纯质白的琐繁骤步。（2）检测 活在细内进胞行， 可在以定程度上一表细胞代内的真实情 况 （3。 检）的测结可果是以因表基产达物的积效应，累 因而可检存在测于白质蛋之间的微弱的 或暂的相互时作用 。（）4酵母双交系杂可采用不同统组织、官器细胞类、和分型化期时 料材建构 DNcA文 库 ，能析分胞细浆、细核及胞膜结蛋合等多白种不同细亚胞部及位功的 能蛋白 局 限。性和 在的问存 题酵双杂交系母统分是析白-蛋蛋白相互间用作有的和效快的方法，速 有多方的应用，面但仍 在一存局限些性。 1）（双 杂系交统分析蛋白的间相作互定用位细于核胞， 内而多蛋

许白间

的互作相用依于翻赖后译工加糖如基、化硫键形成等， 这二反些在应内无核进行法 另外。有些白蛋正的确叠和功折有赖能于他其非酵母白的蛋助， 这辅制限某些细了胞外蛋白和 细胞受体膜白等的研究蛋 。（2）母双酵交杂系的统一重要的问题是"个阳性"假由。于某些白 蛋本具身激有活转录能或在功母中酵达时表挥发转激活作用，录 DNA 使合结结构杂域交蛋白在 特异激活无构域的情况下可激结活转录。另外某蛋白表些含有对面种蛋白多质的亲低和

力 域，区 与能其蛋他形白成定的稳合物复， 从引而报告起基的表因达，产 "假阳性"结果。

生二．母酵双杂所交需株菌及粒载质体菌株

：H109A、Y87(1用于maitng)质 ：p粒GKBT 7NAD-DBV ecotr(bait )GpBK7T-3 C5notrloV ecotr pGATD7T- ControlV ecto rGpDTA7A DV ecort(pr ey p)BKGT-7am ConLrtolV e tocr

Clonng iectvrs

oFusino DA/baNi AtD/lbrary Ai/DTan-tige DNA-nDBp/35 DNA-DBlam/niC

Eitppoec -yMc A HA c-HMyc -Mcc

Yeyast sleetcoinT PR1LEU L2E2UTR 1 TPRP1

Bateciral slection ekanamcyniam piicllni maiciplli kanamynci nkaanycim

npGKB7T GpATD7 pGDAT7T p-GBT7K53 -GBpKT7-Lm

a

三酵母．杂双交所培需养基及剂试

.13培养基的配置 酵

母基培本基 养YD: P2g0/ PeptLno, 1eg/L Y0aetse xtrac, t%2 Dxtreos(egluosce)(20g /)L ,02g/L A ga r(of rlapteson y)，加l dHd 2 至 1O，L调节PH 到值6 5.（实际操作中以不用调试可）,21 115 钟。分 iTs ：p葡萄应糖先成 配0%4母的液，与培基分养灭菌开，培养待温基度降 55至°C 左 时 另外右计加量。否则，入养基培中的萄糖葡易碳化使其颜变色。 Y褐DA(PYD + Paednine:)0 .% a2dnenei ehimsluate f高温 灭 菌 后 保 存。 1LY DP 培养 基中 加 1m5 L.02 a%enine hdmeiusfale(硫t酸腺嘌)，终呤度 0.浓03%0。合后 1混12C1 5 钟。分S 营D缺陷养培养基型： 不同类型 的SD营养缺 型培陷基养针不同对的验目实的：

D/-TrS；pSD/Leu；-DS-T/p/r-Lue-/is/HAd-e，SD/-Tr/-pLe/uHis/--Ad/X- eα-Gl SDa/–Tr/pX --Gaα；lD/S–H s/i– rTpX/-α Gal；SD-/ –dAe– /rpTX-/ α-aG

l

.7 6gYeast ni troge bansew thioutam ni oacid （sNB： 无Y氨酸氮源基 ， 2）dex%rose t(lugcso) ，e 02g Agar (f ro lptes onlya ，850 ml d)H2d O，01 ml0 灭菌保的存 0×Dr1poout oluStoin。调 PH节 到 5.8（实值操际作中可不调做试。）112C15 分 钟 。ipTs：gl coseu、Drpout Soloutoi n 及X-al g应先别分配 40%和成 0 倍1的母液，培与养分基开灭 菌待培养基，温度降至55° C左 时右外计量加入。

另3.2

相试剂的关置

• 10X配D rooput(D O)Solution 数多常用 的D O从可C LONTEH C公司到买。或 者以可结合下营养成面列分中表标的浓明 度，己配自制 1 X D0 O溶。 液0X1O 溶D中含有除一种或少数液种之几的其他所有下外面列的营举养分。成10XDO 溶液 可过经高灭菌，4℃保压一年以上存由。于整在个验实程过，依中据同的实不目的，不验缺同陷 培型基养的耗量不消致一，常用的通多最的是 SD-/rT；pD/S-eLuS；/-TDp/rL-e/uHi-/-sdeA 所以。在进行，实前验 0 X1DO 溶液的 备准时，要事需计算好实先用量，验免避造不成要的 必费浪。

1 L0X1D rpout (oOD )Sluotin o置所需氨配酸基用量下： 如• 20 0mg •20 0mg• 002 m • g30 mg 0 •00 3mg• 2 00 g •m 00 m5g• 2 000 mg• 300 m g• 20 m0 • 1g005 m • 1g00 mg •0200 m 1Lga deinn eemhsuiflate arinige HCnl hstidiine ClH omonhdyrta esi

olueice lynisneH lC mehitnino pehnyealaline ntrhonieenty osirneur cilava ilne eLucin erTyptphoa 腺嘌n 精呤氨酸 氨组酸异亮 酸氨赖氨 酸甲硫 氨 苯酸丙酸氨苏氨酸 氨酪酸尿嘧啶 缬氨酸 亮酸氨色氨酸 溶解于L1 dH2d中，1O1C 251分灭菌保存。钟

例

如如果要配：置01X L–ueDO Slouitno则需,要在上13述氨基酸种中减亮氨酸少即。可T isp氨:基酸体/粉末较难溶于ddH2O，可晶直高压灭菌接后分充震，荡此，氨时酸基体/粉末晶即 充分溶解可。

•

10 TE ×bufer： 0f1.M rTsiH-lC10 ，m METDA，p H75。12.C 151钟灭菌保存。 • 分10×iAL： c 1 醋酸锂M需调， 节H p值至7 .。5112C 1 5分灭钟保存菌 。 1.1וT /LEAicS lutiono ：10 ×ET ubffe 10r ×iALc dd2 HO •EGP/iLAc solutino ：P E3G35(00%5，单配独置，121C 15分钟菌灭保存。 )0× T1E ubffre1 0 ×LAc i8lm1 l m1l m.11m l.11m 7l.ml

8

Tis p 1：.1× ETL/icAS lution 和o EPGL/Ai socltion 制u备母感酵态及转化操作时应现配现受用，不 要配置成混溶液存放。 •合母酵 flter-lifi显色反应t： Z buferf： Na2 HPO4 • H27O NaH2 OP • H4 O2 KlC 61.1g/ 5.L5 g0/ L0.7 g/5

LMg

OS4 7•2 OH0 .426 /gLp 调至7H0高压灭菌.，可室温后存一年以放。 上Z ufber/Xf-βg-las oltuio（n色显液）/ 100ml .27 ml 1.607 lmZ b fuefr me-rcpatetohnol Xa-βgal- tocs ksloutino（2 0g/ml）

•m -βX -ag： l-5溴-4氯-3-吲哚---β D半糖苷。乳(即通所说的常X- gla 。)格相对便价，要检验宜酵母 半乳的苷酶糖活必须性破细除胞壁 。• -Xa-gla ：5-溴4--氯3-吲-哚-a -D 半糖苷。价格昂乳，可以在贵涂的平板布上接检验酵直母的体乳半糖苷 活酶性 T。psi： -X/aβ-gal用 MF 溶解D，浓度 为2mg/m0。l2-0℃光避保。存 对于 Xa-g-al 板平1L， 陷缺培基养中却冷 55℃至后加入 1ml X--gaa（l2mg0/l）m倒再平。 板者每或块冷后却的10 c/15mm 平板c上 1涂0ul/200u0 X-a-gall（2gm/ml） 。于对X- -galβ采， 用常的通filter -ifl t法检方验后（详面述 。

）．酵母四双杂实验交技术

.41酵母菌的 菌株活、保存化显色及反应

酵母菌株的保藏和养：培酵 母株可菌于含 25以%甘的 YP油 培养D中保基藏在-07，℃若温始终度持在-55保℃以下， 至可以保藏 少 1以年。 转上化后的母酵菌应保在藏应的 SD 培对基内，以养终保持始择选力。 压 酵母油甘种的菌备： 制.a 无操菌，作从板上平刮下一个母酵单隆克。b. 1.5 m无菌ElP中，管用200 –05 0 lPY培养D基或宜的SD适养基重悬培落。菌剧 烈荡， 震全完分细散胞加入50%的。油甘体等积，使油终浓度甘2为5% c。.盖紧 盖，再子次匀EP混管。7-0包℃藏。 母甘油菌酵复的苏 ：.a挑取 少冻量的存甘油在Y菌D或相P应S的D平板划线上。b 3.0培养C～5天，3直到落菌径直2为m以上。将这些作m为“工菌作”平

板。c. 平板将用封口封膜，好C可保藏2个月以上。每41过2～个月新重从存的冻油甘菌中 划板平。d .甘菌油一可般反复冻被有融几限次而不响影细。如胞没有活果化来出，可是因能为 母酵细沉胞淀E在管底部P。则时可此E将P管置于冰解上后冻，震荡混匀并重新线。 划酵母 的菌过夜培养： .a “工从菌”作板平上取新的鲜≤4周(，23mm)-隆克用实验。于每5ml培养基接一种个较大 的克隆直(2–3-mm)径 ；菌落较若或者小使了用多更培的基养可以，根据实需验求 多个取克隆（扩大如养培mtangib用at时i，有时于文库浓由度过，b高it单克a隆培养 浓度法达无对pre到y浓的覆度盖要时求。） Tpis：挑后应充分地剧烈振斑培养荡，以彻基分散底聚团酵的母细。胞 b 3.C培0养611～8时，小23–0702r m。p于对大数多的菌，株养培物达到将生的长平 期(O台6D0 > 1.05 ) T。ips：不酵母同株系的生速长率不同。同在时些转化子一，中生长速率会还到受融 蛋白的合影响另。，大多数株外在系S培养基中的D加倍间要时比YPD中在。 c长. 如果需对数要生期的培长物，养移足转够过夜的养培到新物的培养鲜基，使中OD060 = .2–0.0。330C培养35小～，时230–50 2pr。m于对大数的菌多株，D6O0可达到0.40～ 0. 6 T。ip s：在这活化个骤中通步使常用YD或P者YDPA因为在。种较这的短活化时间， 下质粒的丢并失不显明 。 氮破酵母液菌后，-Xβ-alg 显方法：色 1 选取在.平板新上生长的鲜母酵菌落行显进色应。 反长时间过长生酵的可母能会响激 2. 3. 影报告活基的因能。力 选合择大小的滤纸适在，纸上做滤相好应的标后记，水将其用匀均润湿，刚以湿滤 纸为益浸 用。头枪牙签或取刮少菌量落（无菌操）作均，匀布涂滤在上。纸菌需均匀涂开要较，

多细的聚集在胞起可能会导一细胞裂解致不分。 充ips:T 意设立注阳性、性对照阴 。4.

.

5

没滤浸于纸氮中液，时间大10于，s次大数于次。每次在1纸恢滤复室温状态到后再，浸没液氮。通 过液的反氮冻融使复胞壁细裂破。 制配色显（液 ZuffebrX-/gl asluotoni ） 向滤。纸上添加显液色室温（或。30C）避光应反，意注察观显结果色通。常8小时 内的以显结果色认为被是靠的可

。.

6

4.2 酵母感态受的制备1.

挑酵母取单克（≤隆 4周，2-m3m至装有） 3m lPYD A培基养 的1ml5离心 管中充分 震，荡散。分2 .3°0C 20-3520 /mrn i培养 h8 3.。 将 5μl 液转移菌至有 装05lm YDPA培 养基的 52 0m 三l瓶角。中 . 340 C°23 0-50r/2mi 培养 n16-20，使h液 菌D6O00达 .1500-3 之间. 5.。7 00g室 温心 5离im n集收体菌。6 重悬沉淀.并将其转，至有装 10ml Y0DAP 养基培三角瓶的继代培养中 7。.30 ° 2C0-325r0m/i n培 3养5-

h（OD00 6 =.040–.5。 8. 7）0g 0温离心室 5mi n收菌集体。 .9 用 60m 无l菌dd H 2O 菌体对淀沉行进重悬此步重复（一次果效更好）。 01 .70g0室 温离 心mi5n收 集体菌。 11 用 .3ml 1.1 ×ET/iAcL oSltuin 对菌o体淀进沉行重悬 。12 将重悬液分.于两装 个.1ml 5的离心中（每管 1.5管ml） 13.。高 速心 离51 。s14. 弃清上，管沉淀用每600 μ 1.l1T×E/LAc iSoulitno进行重悬 。T pis：母酵受感态配置不后能长期放，通存都要求在常进行酵细胞转母化现配现用前，不 能加油将甘其放置70－° C行进存。

保

43 .量大法转酵化母

. 1将无一菌1 0l m心离置于冰上预管，并冷此加依入以试剂下：ds cDN A 已（过柱纯） 化20μ pGAlD7-Tec （0R5 .μ/μgl）2. .3 4 .5 .6 7..8. 9 .0.111 .12. Her irng esTts eCarierrD N（已变A性 ）加酵入母感态细受胞 60μl0，轻柔混匀。6 μl 2 0 μl

加入

2.m5 PlGELi/cA缓冲液， 柔轻混。 30°匀C 温 培浴养 5m4n，每i1 5mn 混i匀一。 次入 1加06μl 的DSO，M24 C °温培浴养2 0im，n 每01mni 混匀次一。700g ，室离心温 5imn。 弃上，清加 入3l YPDm Pul lsiqiu deMdim 悬浮沉淀u细。 3胞0°C 轻柔振荡 培养90 min 70。g，室0离心 温m5i。 用 n03l maNC Sollutoni（.09）%悬浮胞细 将悬浮液。以 51 μl0皿/布涂于18 022- 0个1 50m m的 DS/-eLu培 养平板。 30上 C °培至 3-4d养 斑后显收集，菌斑

。

Tips:酵母大量转化法

主要针文库对建，构其转强调化转效率和化纳性。容一 ba般t 重组i体 载转不建化议法此化转其。中 PD PlYs u体培养基液购专于CL OTNEHC公司

。44 .母酵的速快化法

转1. 2 .3 4. 挑.单菌于 落3lm 2 ×YPA D培养中基，3° C 2000/mrin 培至菌浓养为 2× 1度0 8elc/mll 约 1（h8。 ）用无的 菌.15lm 心管收集菌离液次两每次 ，m1l120，00r/in，m温常心离 03s。 2 mgml /arricre DNA 性，变01°0 Cm5in，置冰上用备。 在菌依此加中入 ：0%5PEG3 53 1M0 Lic 2Ag/ml m.SScar rier NDA 粒质DNA （ 约1u）g 每加种一后均吸要混匀。 5打. .6 . 724 ° C浴水 -12.h。 12000/rmin离 心 min1吸，上清弃沉淀中加 ，050l μdd2 O，H打吸匀均10，0lμ 涂皿 3。° C0 养 2-培3 显斑d。 40μ2 l43μl5 0μl3 μ6

Tipsl:2 m/ml g.SS carire rDN（A鱼鲑单链精DNA 建议）置时配量分小，装在转化并时好算样加时间 沸水 煮5min 使充其变性。分

4.5

aiBt 体载构建的

aiBt 体的载构参建见子克分隆部，需要注意的分在选是合择的酶切位适点载装，需要时考 虑序列翻的译确精性要，避免译翻过程中的移突码变。

4

6. aBi t的自激活检 1.测 转化将入p BGT7 K质空和 粒aBit重 质粒的 组AH01“9钓饵菌株”置以于下养培上

生长基 SD。–Tr/p/Xα-G-l SDa–H/i/–Tsr/Xpα--GalS /–DAed/Trp/–-αX-aG 2l.结果分 析 ：） 钓饵1白蛋无激自性则显活转化子显示白且色不在 S/D–isH–/rpT

或 S/DA–d/–Tre p平皿 生上。 2）长钓 饵白有蛋自激活性则示转化子显显蓝且色 S在D/–is/H–rTp 和 DS/Ad–/–erpT平 皿 上均生长。

4.有7 Bai 的毒性检t测

1. 过比较转通入化DA-BDN钓饵/粒质转与化入D空ANB-质D粒的 HA190菌在液株体培养 中基的生长率速， 可判断以DN-AB/钓饵蛋D白是否有毒性， 常有含有毒D通N-BD/ 钓饵蛋A白的AH109菌株长生率往往速会著显降低。2. . 4. 3种接单克隆（2– 3mm于5）0 l mSD/–Trp/an （K0 2μgml/液）体培基中养。 03 °C 250–270 /mirn夜过培养（162– 4h。）检测培 养基的DO00 6若OD6，00 远于0.8小则说明。NADB-D钓可能存在毒饵性。若O D600≥ 0.，8则明说该重组载并不妨碍体母酵的长生，也就没是有毒性可，以继进续行

.5 6.7. 8

.

amitgn作。 工60 g0，温室离心 m5i。 弃上n。清将 淀沉悬重5 ml于SD/－ rTp体培液基养，中血球 数计测定其浓度， 度浓该≥1 × 1应0 ecllsml/。可 将钓该菌饵株A与D合融文宿主库进行菌amtng。i

9

4.8

Mati gn1

.2. 3 .4. 5.6. 7.8. 9. 取 一文库管置于菌室水浴温解溶。 将毒性测中检 5的l mAH019（钓）饵液（菌1×≥09 c1leslml/）与 1lm 的Y 17（8文库 ）液菌≥2（×17 cel0sl/l）置m 于L2 的无菌角三中进瓶结行。 加入 合45m l×Y2DA/PKna5（ μ0g/l）m体培养液基，轻的混柔。 匀用分1lm ×2YDA/PKan50 （gμml）/储存对文库离的心清洗管次。 30° C 两035-0r/ mn i柔轻过培夜养2（–02 h）4 M。tangi2 h 后，0取一滴m tangi菌液在相差显 微镜（40×）0下检生测状长。态若存在 结体合（yzoge） t则，继需培续 养4h以 上。若有没继续进则后续操作。行 mati将n g合混液转移至菌1 00lm无 菌心离中，管100 0g 离 心01in。同m，时次每用 50m l0.×YPD5/KAa（50 μg/nl）清洗mma tig 用n过的的角瓶三用清，洗重悬液沉。淀1 000g 心离1 0mn，i并用 01l m0.5Y×DP/AKan（05μ g/ml）悬重沉淀估。测细胞和培 养的总基积体。 将ma itg 混合液涂n于 S布/D–Ae/dHi–s–Leu//–Tp/rXα−Ga-。

l

4. Mat9in g效率测定

的aMitgn效的率检测要将m需tang后i的混合菌液按110:00，10:100，0:1001和 :110倍数的进行 稀释然，后每将梯度的稀液释据依10μ 0 /l皿1（00-mm）量的别涂分布于以下三种养培基 S：/–LDe，u D/S–Tp， rS/DL–u/e–Tp。 显r后统计其斑长情况，斑 根公式进行据推导演算到结果得

cf。u/l mon SD/–Lue= v ibiaitl yofY 871

pratnr

e

fc/mu on lD/–TSpr= ivailityb f oH109 Apraner tfu/cml o nS/–DLeu–/Tr p v=aibiilty f diplooids

c

f/ml uof iploidd s 1×0 0= %D pilod icf/umlof lmitinigpar tern