普通光学显微镜的使用

光学显微镜的研究

青岛中仁药业 王金雨

摘要: 光学显微镜是利用光学原理，把肉眼所不能分辨的微小物体放大成像，以供人们提取微细结构信息的光学仪器。本文主要从光学显微镜的发展历史，组成结构，分类，机械装置即使用中的常见问题和解决方法等方面对其进行介绍。从而达到对光学显微镜进一步了解的目的[1]。

关键词: 显微镜; 使用; 问题; 对策

引言：

光学显微镜是一种精密的光学仪器，已有300多年的发展史。自从有了显微镜，人们看到了过去看不到的许多微小生物和构成生物的基本单元——细胞。随着科学技术的发展，光学显微经的种类越来越多，性能也越来越高，但人们对其了解还不够，为了加深人们对光学显微镜的认识，让我们先来了解以下内容[2]。

1、光学显微镜的发展历史

早在公元前一世纪，人们就已发现通过球形透明物体去观察微小物体时，可以使其放大成像。后来逐渐对球形玻璃表面能使物体放大成像的规律有了认识。1590年，荷兰和意大利的眼镜制造者已经造出类似显微镜的放大仪器。1610年前后，意大利的伽利略和德国的开普勒在研究望远镜的同时，改变物镜和目镜之间的距离，得出合理的显微镜光路结构，当时的光学工匠遂纷纷从事显微镜的制造、推广和改进。17世纪中叶，英国的胡克和荷兰的列文胡克，都对显微镜的发展作出了卓越的贡献。1665年前后，胡克在显微镜中加入粗动和微动调焦机构、照明系统和承载标本片的工作台。这些部件经过不断改进，成为现代显微镜的基本组成部分。

1673～1677年期间，列文胡克制成单组元放大镜式的高倍显微镜，其中九台保存至今。胡克和列文胡克利用自制的显微镜，在动、植物机体微观结构的研究方面取得了杰出的成就。

19世纪，高质量消色差浸液物镜的出现，使显微镜观察微细结构的能力大为提高。1827年阿米奇第一个采用了浸液物镜。19世纪70年代，德国人阿贝奠定了显微镜成像的古典理论基础。这些都促进了显微镜制造和显微观察技术的迅速发展，并为19世纪后半叶包括科赫、巴斯德等在内的生物学家和医学家发现细菌和微生物提供了有力的工具[3]。

在显微镜本身结构发展的同时，显微观察技术也在不断创新：1850年出现了偏光显微术；1893年出现了干涉显微术；1935年荷兰物理学家泽尔尼克创造了相衬显微术，他为此在1953年获得了诺贝尔物理学奖.. 古典的光学显微镜只是光学元件和精密机械元件的组合，它以人眼作为接收器来观察放大的像。后来在显微镜中加入了摄影装置，以感光胶片作为可以记录和存储的接收器。现代又普遍采用光电元件、电视摄象管和电荷耦合器等作为显微镜的接收器，配以微型电子计算机后构成完整的图象信息采集和处理系统。

表面为曲面的玻璃或其他透明材料制成的光学透镜可以使物体放大成像，光学显微镜就是利用这一原理把微小物体放大到人眼足以观察的尺寸。近代的光学显微镜通常采用两级放大，分别由物镜和目镜完成。被观察物体位于物镜的前方，被物镜作第一级放大后成一倒立的实象，然后此实像再被目镜作第二级放大，成

一虚象，人眼看到的就是虚像。而显微镜的总放大倍率就是物镜放大倍率和目镜放大倍率的乘积。放大倍率是指直线尺寸的放大比，而不是面积比。

2、光学显微镜的组成结构

光学显微镜一般由载物台、聚光照明系统、物镜，目镜和调焦机构组成。载物台用于承放被观察的物体。利用调焦旋钮可以驱动调焦机构，使载物台作粗调和微调的升降运动，使被观察物体调焦清晰成象。它的上层可以在水平面内沿作精密移动和转动，一般都把被观察的部位调放到视场中心[4]。

2.1物镜

物镜位于被观察物体附近，是实现第一级放大的镜头。在物镜转换器上同时装着几个不同放大倍率的物镜，转动转换器就可让不同倍率的物镜进入工作光路，物镜的放大倍率通常为5～100倍。物镜是显微镜中对成象质量优劣起决定性作用的光学元件。常用的有能对两种颜色的光线校正色差的消色差物镜；质量更高的还有能对三种色光校正色差的复消色差物镜；能保证物镜的整个像面为平面，以提高视场边缘成像质量的平像场物镜。高倍物镜中多采用浸液物镜，即在物镜的下表面和标本片的上表面之间填充折射率为1.5左右的液体，它能显著的提高显微观察的分辨率。

2.2目镜

目镜是位于人眼附近实现第二级放大的镜头，镜放大倍率通常为5～20倍。按照所能看到的视场大小，目镜可分为视场较小的普通目镜，和视场较大的大视场目镜(或称广角目镜)两类。载物台和物镜两者必须能沿物镜光轴方向作相对运动以实现调焦，获得清晰的图像。用高倍物镜工作时，容许的调焦范围往往小于微米，所以显微镜必须具备极为精密的微动调焦机构。

2.3放大倍率

显微镜放大倍率的极限即有效放大倍率，显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距。分辨率和放大倍率是两个不同的但又互有联系的概念。当选用的物镜数值孔径不够大，即分辨率不够高时，显微镜不能分清物体的微细结构，此时即使过度地增大放大倍率，得到的也只能是一个轮廓虽大但细节不清的图像，称为无效放大倍率。反之如果分辨率已满足要求而放大倍率不足，则显微镜虽已具备分辨的能力，但因图像太小而仍然不能被人眼清晰视见。所以为了充分发挥显微镜的分辨能力，应使数值孔径与显微镜总放大倍率合理匹配。

2.4聚光照明系统

聚光照明系统是对显微镜成像性能有较大影响，但又是易于被使用者忽视的环节。它的功能是提供亮度足够且均匀的物面照明。聚光镜发来的光束应能保证充满物镜孔径角，否则就不能充分利用物镜所能达到的最高分辨率。为此目的，在聚光镜中设有类似照相物镜中的 ，可以调节开孔大小的可变孔径光阑，用来调节照明光束孔径，以与物镜孔径角匹配。改变照明方式，可以获得亮背景上的暗物点(称亮视场照明)或暗背景上的亮物点(称暗视场照明)等不同的观察方式，以便在不同情况下更好地发现和观察微细结构。

3、光学显微镜的分类

光学显微镜有多种分类方法：按使用目镜的数目可分为双目和单目显微镜；按图像是否有立体感可分为立体视觉和非立体视觉显微镜；按观察对像可分为生物和金相显微镜等；按光学原理可分为偏光，相衬和微差干涉对比显微镜等；按光源类型可分为普通光、荧光、红外光和激光显微镜等；按接收器类型可分为目视、摄影和电视显微镜等。常用的显微镜有双目体视显微镜、金相显微镜、偏光显微镜、紫外荧光显微镜等[5]。

3.1双目体视显微镜

双目体视显微镜是利用双通道光路，为左右两眼提供一个具有立体感的图像。它实质上是两个单镜筒显微镜并列放置，两个镜筒的光轴构成相当于人们用双目观察一个物体时所形成的视角，以此形成三维空间的立体视觉图像。双目体视显微镜在生物、医学领域广泛用于切片操作和显微外科手术；在工业中用于微小零件和集成电路的观测、装配、检查等工作。

3.2金相显微镜

金相显微镜是专门用于观察金属和矿物等不透明物体金相组织的显微镜。这些不透明物体无法在普通的透射光显微镜中观察，故金相和普通显微镜的主要差别在于前者以反射光，而后者以透射光照明[6] 。在金相显微镜中照明光束从物镜方向射到被观察物体表面，被物面反射后再返回物镜成像。这种反射照明方式也广泛用于集成电路硅片的检测工作。

3.3紫外荧光显微镜

紫外荧光显微镜是用紫外光激发荧光来进行观察的显微镜。某些标本在可见光中觉察不到结构细节，但经过染色处理，以紫外光照射时可因荧光作用而发射可见光，形成可见的图像。这类显微镜常用于生物学和医学中。

3.4电视显微镜和电荷耦合器显微镜

电视显微镜和电荷耦合器显微镜是以电视摄像靶或电荷耦合器作为接收元

件的显微镜。在显微镜的实像面处装入电视摄像靶或电荷耦合器取代人眼作为接收器，通过这些光电器件把光学图像转换成电信号的图像，然后对之进行尺寸检测、颗粒计数等工作。这类显微镜的 可以与计算机联用，这便于实现检测和信息处理的自动化，多应用于需要进行大量繁琐检测工作的场合。

3.5扫描显微镜

扫描显微镜是成像光束能相对于物面作扫描运动的显微镜 。在扫描显微镜中依靠缩小视场来保证物镜达到最高的分辨率，同时用光学或机械扫描的方法，使成像光束相对于物面在较大视场范围内进行扫描，并用信息处理技术来获得合成的大面积图像信息。这类显微镜适用于需要高分辨率的大视场图像的观测。粗准焦螺旋：大范围上下调动镜筒[7]。 细准焦螺旋：小范围上下调动镜筒。

4、显微镜的机械装置

显微镜的机械装置是显微镜的重要组成部分。其作用是固定与调节光学镜头，固定与移动标本等。主要有镜座、镜臂、载物台、镜筒、物镜转换器、与调焦装置组成。

4.1、镜座和镜臂

1、镜座 作用是支撑整个显微镜，装有反光镜，有的还装有照明光源。

2、镜臂 作用是支撑镜筒和载物台。分固定、可倾斜两种。

4.2、载物台（又称工作台、镜台）

载物台作用是安放载玻片，形状有圆形和方形两种，其中方形的面积为120mm×110mm。中心有一个通光孔，通光孔后方左右两侧各有一个安装压片夹用的小孔。分为固定式与移动式两种。有的载物台的纵横坐标上都装有游标尺，一般读数为0.1mm，游标尺可用来测定标本的大小，也可用来对被检部分做标记。

4.3、镜筒

镜筒上端放置目镜，下端连接物镜转换器。分为固定式和可调节式两种。机械筒长（从目镜管上缘到物镜转换器螺旋口下端的距离称为镜筒长度或机械筒长）不能变更的叫做固定式镜筒，能变更的叫做调节式镜筒，新式显微镜大多采用固定式镜筒，国产显微镜也大多采用固定式镜筒，国产显微镜的机械筒长通常是160mm。 安装目镜的镜筒，有单筒和双筒两种。单筒又可分为直立式和倾斜式两种，双筒则都是倾斜式的。其中双筒显微镜，两眼可同时观察以减轻眼睛的疲劳。双筒之间的距离可以调节，而且其中有一个目镜有屈光度调节（即视力调节）装置，便于两眼视力不同的观察者使用。

4.4、物镜转换器

物镜转换器固定在镜筒下端，有3—4个物镜螺旋口，物镜应按放大倍数高低顺序排列。旋转物镜转换器时，应用手指捏住旋转碟旋转，不要用手指推动物镜，因时间长容易使光轴歪斜，使成像质量边坏。

5.5、调焦装置

显微镜上装有粗准焦螺旋和细准焦螺旋。有的显微镜粗准焦螺旋与装在同一轴上，大螺旋为粗准焦螺旋，小螺旋为细准焦螺旋；有的则分开安置，位于镜臂的上端较大的一对螺旋为是粗准焦螺旋，其转动一周，镜筒上升或下降10mm。 位于粗准焦螺旋下方较小的一对螺旋为细准焦螺旋，其转动一周，镜筒升降值为0.1mm，细准焦螺旋调焦范围不小于1.8mm[8]。

2.观察显微镜时易出现的问题及对策

2.1 双眼不能很好配合

目前很多中学和中等职业学校生物学科实验使用的仍是单筒光学显微镜, 很多学生看单筒光学显微镜时, 睁一只眼闭一只眼, 或者用手遮住另一只眼, 观察显微镜相当吃力, 而且还会造成视觉疲劳。极个别学生甚至到该门课程结束时还纠正不过来。其对策是, 观察单筒显微镜时一定要严格要求学生两眼要同时睁开, 左眼观察显微镜, 右眼绘图或记录。 第一次学习显微镜使用就要严格要求学生这样做, 逐步养成习惯, 正确的姿势也就形成了。

2.2 压碎装片或永存片

少数学生观察显微镜时常将载物台上的装片或永存片压碎。这是由于眼睛在注意视野中的图像, 双手不住地转动调节轮使镜筒下降, 在镜筒下降过程中调焦, 注意力集中于视野内, 忽略了镜头与装片间的距离。 这是初学者常犯的错误。 解决的办法是, 低倍镜观察时, 眼睛要离开目镜从侧面观察物镜, 旋转转换器的转换盘, 将低倍镜头转至正下方, 旋转粗调节轮, 使物镜头缓慢下降, 至接近装片, 但不能接触装片。然后再看目镜, 旋转粗调节轮上升镜筒,在镜筒上升的过程中即可看到物像, 也不可能压碎装片[9]。高倍镜观察时, 眼睛离开目镜从侧面观察物镜, 旋转转换器的转换盘, 将高倍镜头转至正下方, 即可看到模糊的物像, 再调节微调节轮即可看清物像。 当用油镜观察时, 仍然要求眼睛离开目镜, 从侧面注视油镜头, 慢慢降下镜筒, 使油镜头浸在香柏油中, 镜头几乎与装片接触,

但不可压及装片。然后逆时针方向旋转细调节轮使镜筒慢慢上升, 在镜筒上升过程中即可看到物像。这样规范操作, 既安全(避免压碎玻片) , 又快速、 准确找到物像, 节约了观察时间。

2.3 镜片擦拭不规范

当目镜或物镜头有污物看不清楚时, 少数学生用纱布擦拭, 因纱布粗糙易损坏镜片。有的学生甚至用手直接擦拭, 在镜片上形成印迹。这样檫拭都不正确, 甚至损伤镜片。解决的办法是, 对于显微镜的光学部分(特别是镜片)只能用专用显微镜擦镜纸擦拭。檫拭动作轻柔, 用力不能过大。专用擦镜纸医药公司有售, 随时可购买到。不能用棉花、 棉布、 纱布或其它硬物擦拭。

2.4 转动物镜转换器不规范

很多学生在用高倍镜、 油镜观察时,用食指和拇指捏住物镜就旋转, 这样会损坏螺旋和造成物镜光轴不正。就是熟练使用显微镜的高年级学生也常会出现这种问题。解决的办法是: 用食指和拇指捏着转换器的转换盘, 通过缓慢旋转转换器的转换盘来转换物镜。不能直接手握物镜就旋转。2.5 目镜上出现水雾 因观察显微镜时眼睛紧贴目镜引起镜片表面形成水雾, 看不清物像。在冬季气温低, 观察显微镜时对着目镜呼吸, 也会出现这种情况。 这使很多初学显微镜使用的学生不知所措, 弄不清原因。克服办法是, 观察显微镜时, 眼睛与目镜间保持一定距离,不要紧贴目镜。 气温低时观察显微镜, 呼吸不能直接对着目镜。 如果目镜镜片上出现水雾后, 用干净的专用显微镜檫镜纸檫拭干净即可。

2.6 高倍镜下看不到物像

用高倍镜观察显微镜时, 难以找到物像。其原因是未先用低倍镜而直接用高倍镜观察, 或虽先用低倍镜但未将观察对象移到视野中央。其对策是, 先用低倍镜观察, 找到物像,并把需要观察的对象移到视野的中央, 然后旋转转换器的转换盘使高倍镜头转至正下方, 调节微调节轮即可看清物像。

2.7 油镜观察中难以找到物像

用油镜观察细菌时, 老是找不到物像。这是初次使用显微镜最易出现的问题。而且多数学生会遇到这种情况。 这种现象有三方面原因: 一是由于油镜的镜片上沾有赃物; 二是视野中光线太暗; 三是旋转细调节轮时使镜筒上升过快造成。解决的办法, 首先用擦镜纸蘸取少许二甲苯揩擦油镜镜片, 使镜头干净, 然后调节光线使视野中达到明亮程度, 从侧面注视, 慢慢降下镜筒, 使油镜浸在香柏油中, 镜头几乎与装片接触, 但不可压及装片。 然后旋转细调节轮使镜筒慢慢上升, 在镜筒上升过程中即可看到物像。如果没有看到物像, 重复上述操作, 直到看见物像[10]。

历史上显微镜的发明和显微镜的每一次创新都给人类的认知带来了飞跃式的发展；给人类的生活带来了空前的拓展。在提倡科技创新的今天，显微镜的使用已经成为中学生的一项基本技能，掌握结构，科学使用，良好维护，使之我们探索未来世界的一个窗口。

参考文献：

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[2] 傅雅静,郭丽洁,高建,崔泽实. 虚拟显微镜技术及其在医学领域的应用[J]解剖科学进展, 2007,(03).

[3] 梁玉. 医用光学生物显微镜的修理与调整[J]医疗卫生装备, 1995,(02).

[4] 尹军. 生物显微镜常见故障排除及其保养[J]医疗装备, 1999,(08).

[5] 曾顺良. 实验教学中学生使用显微镜存在问题的分析及对策[J]. 检验医学教育, 2006,(02).

[6] 林和,陈寅山. 浅谈高校生物显微镜的使用与维护保养[J]. 现代仪器, 2005,(04).

[7] 黄贤仪, 龚建福, 陈晓霞. 重视实验教学 提高教学质量[J]. 新疆医科大学学报, 2003,(02)

[8] 孙洁. 实验准备工作的几点体会[J]. 临沂医学专科学校学报, 2005,(02)

[9] 曾令奎,温建荣. 普通光学显微镜使用易出现的问题及其对策[J]. 科技信息(科学教研), 2007,(21).

[10] 王超. 显微镜使用方法的启蒙教学[J]. 生物学教学, 2007,(11).