蛙内脏石蜡切片实验资料

实践一 蛙内脏石蜡切片

(一) 实验目的：制作实验动物的组织切片并染色，掌握动物组织制片技术

(二) 实验准备：

1. 用具 小标本瓶，指管，眼科镊子，蜡杯，载玻片，毛笔，蜡铲，刀片，量筒（10）毫升，漏，滴管，酒精灯，小木块，切片木框，切片盒，吸水纸，标签纸，切片刀，熔蜡箱，展片台，真空泵，解剖针。

2. 实验材料 蛙肝、蛙心、蛙肺。

3. 器皿的清洗

（1） 指管的清洗：切片所用的载玻片必须洗得很干净，否则切片容易脱落。新的载玻片用洗液浸泡半天取出，用自来水冲洗后，用纱布擦干净，放入盒内备用。擦拭时应捏住玻片两端的边缘操作，手指勿与玻片的表面接触，以免手指上的脂肪沾污玻片。

（2） 盖玻片的擦洗：新的盖片可放入95%酒精内浸泡数十分钟，或用洗液浸泡。注意盖片要一片片投入，使盖片的二面都接触到液体，浸泡后，水冲洗干净后再放入95%酒精中浸泡，然后用干净白布擦拭。擦拭时应注意，手指不能接触玻面，应以左手拇指和食指夹持盖片，右持布趁酒精未干时，一一擦拭之。

4. 实验需用药品及其配制

50%、70%、80%、90%、95%、100%的酒精， 二甲苯， 甘油蛋白， 固定液， 石蜡。

（1） 各种浓度酒精配制

实验室常以95%酒精来配制各种低浓度的酒精，因100%纯酒精系由95%酒精再蒸馏而成，价格昂贵，一般不用于稀释。配制方法：

配70%酒精时，可取95%酒精70毫升再加入蒸馏水25毫升即得。一般遵照以下原则：无论用任何浓度的酒精稀释时，即稀释多大浓度就取多少毫升的酒精，然后用蒸馏水加至该酒精原有浓度即可。

（2） 固定液的配制

（3） 甘油蛋白 取鸡蛋的蛋白加入等量的甘油搅拌混合，至均匀为止。加入约为1%量的麝香草酚小块，借以防止微生物的侵入和腐败。放入冰箱备用。

(三) 实验步骤：

1. 取材与固定：

将蛙内脏剪成长条(一般厚度不超过0．5厘米) 投入预先配好的固定液中(10％福尔马林，Bouin 氏固定液等) ，使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。

2. 脱水透明：

一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。

3. 浸蜡包埋：

将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器(如折叠一小纸盒) ，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。冷却凝固成块即成。包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。

包埋注意事项

（1）一般实质性脏器的组织及肿瘤组织应把最大切面朝下包埋；食管、胃、肠等组

织须将管壁横断面朝下包埋，若在同一蜡块中包埋数块管壁组织时，应平行横埋

且黏膜面（内膜）的方向应一致，以便切片及观察。

（2）同一蜡块包埋多个组织块时，组织的性质应相同，方向要一致，不能把大小、

厚薄差别悬殊的组织包埋在一起，组织块间的距离不能太大。

（3）包埋（尤其在室温较低的情况下）操作应迅速，防止组织块变凉、蜡液凝结及

出现气泡，组织块与蜡液不能很好凝固定在一起，导致组织与蜡分离。

4. 切片与贴片：

将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，一般为8微米厚。切下的薄片往

往皱折，要放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。

（1） 切片前的准备

1) 修切蜡块：切片前应先修块，即切去组织周围过多的石蜡，一般留下约2mm 宽

度的蜡边为宜。注意蜡块不能留得太窄，在切片时易损坏组织；蜡边不能留得

太多，否则影响展片。室温过高时，可将修好的蜡块放到冷水中冷却一定时间。

2) 切片用品准备

i.

ii.

iii.

iv. 切片刀：预先磨好切片刀备用或切片前更换新的一次性切片。 载物片：载物片经清洁液、95%乙醇处理后备用。 展片仪：接通电源，调整温度。 其他用品：准备好毛笔、记号笔、镊子、冰块等。

（2） 切片制作过程

1) 将切片刀装在刀架上，后将蜡块装在切片机固定装置上。调整蜡块与刀至合适

位置（刀刃与蜡块切面呈5°夹角），为得到完整的切片，防止组织出现刀纹裂

缝，应将组织硬脆难切的部分放在上端。

2) 左手执毛笔，右手旋转切片机旋转轮。先粗切标本，直到暴露出组织最大切面，

再连续旋转切出蜡带，左手持毛笔将蜡片带下端轻轻托起，右手用镊子夹起蜡

带上端，轻置于干净滤纸上备用。

3) 在干燥洁净的载玻璃中央滴一滴蛋白质—明胶，用小拇指抹匀，再滴三滴蒸馏

水于其上，用镊子夹起蜡带上端使其光面朝下贴于载玻璃上，调整，轻轻用镊

子拉平。将载玻片置于展平仪上展平，注意温度。对于展片困难的切片经30%

的乙醇初展。贴上标签，注明材料和制片人。

4) 烤箱60℃左右烘烤切片。

（3） 切片的注意事项

1) 切片质量的好坏，与技术熟练程度和切片机、切片刀的好坏有关外。

2) 切片机的各个零件和螺丝应旋紧，否则将会产生震动。

3) 在摇动切片机时，用力要求均匀一致，不宜过重过猛，否则造成切片厚薄不均。

或空洞现象。

4) 在夏季切片时可用冰块冷却切片刀和组织块，减少切片刀与组织块在切片过程

中产生的热时，使石蜡保持合适的硬度以利于切片，减少切片的褶皱。

5. 脱蜡染色：

常用HE 染色，以增加组织细胞结构各部分的色彩差异，利于观察。苏木精(Hematoxylin，H) 是一种碱性染料，可将细胞核和细胞内核糖体染成蓝紫色，被碱性染料染色的结构具有嗜碱性。伊红(Eosin，E) 是一种酸性染料，能将细胞质染成红色或淡红色，被酸性染料染色的结构具有嗜酸性。染色前，须用二甲苯脱去切片

中的石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，最后入蒸馏水，就可染色。

基本步骤如下：二甲苯×2（脱蜡）→酒精+二甲苯（1:1）→100%酒精×2→90% 酒精→80%→70%→50%→30%→水→苏木精染色→水→50%→70%→90%→0.5%伊红(95%酒精配制) →95%→100%×2→二甲苯:酒精(1:1)→二甲苯×2→树胶封片

6. 脱水透明：

染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明。

7. 封固：

将已透明的切片滴上加拿大树胶，盖上盖玻片封固。待树胶略干后，贴上标笺，切片标本就可使用

(四)

说明： 图1：人肝切片示:门管区（PA ）、中央静脉（CV ）、血管(Ve)。

图2：人肝门管区结构示:小叶间静脉(IV)、小叶间胆管(IBD)、小叶间动脉(IA)。 图3：肝小叶结构示:中央静脉(CV)、肝索(HC)。

图4：肝小叶结构示:肝血窦(HS)、肝索(HC)。

结构说明： 肝是人体最大的腺体，肝小叶是肝的基本结构单位，肝小叶中央有一条延其长轴走行的中央静脉(central vein)，肝细胞索和肝血窦（hepatic sinusoid）以中央静脉为中心，向周围大致呈放射状排列。 肝细胞以中央静脉为中心单行排列成板状，称为肝板。在切片中。肝板的断面成索状，称肝索(hepatic cord)，肝板之间的腔隙为肝血窦。肝血窦经肝板上的孔互相连通，形成网状结构。 在肝小叶之间是门管区, 门管区(portal area)由小叶间静脉(interlobular vein )，小叶间动脉(interlobular artery )和小叶间胆管(interlobular bile duct)构成。胃肠吸收的物质除脂质外全部经门静脉输入肝内，在肝细胞内进行合成，分解，转化和储存。

首先分辨出心内膜、心肌膜及心外膜三层结构。切片一端边缘平整，染色浅淡的为心内膜，另一端边缘凹凸不平，上皮下有许多脂肪组织与血管的为心外膜。心内膜与心外膜之间为心肌膜，可见心肌纵、横、斜三种不同的断面。高倍镜下，可见心内膜的三层分界不清楚，表面为扁平的内皮细胞，细胞核染色较淡，故清楚；内皮下层为薄层结缔组织，可见折光性强的弹性纤维；内膜下层与内皮下层分界不清，内膜下层结缔组织中的小血管、神经及心脏传导系统亦分辨不清。心肌膜很厚，由心肌纤维构成，在纵断面上可见闰盘（复习心肌纤维的结构特点）。心外膜 由间皮和疏松结缔组织构成。间皮排列较内皮密，间皮下结缔组织中含有较多的小血管、淋巴管以及脂肪细胞。

图1 犬房室交界区水平断面示意图 LA=左房，RA=右房，LV=左室，AVN=房室结，AVB=房室束，SS=房室结浅层，CS=冠状静脉窦，IVS=室间隔肌，SV=三尖瓣隔侧瓣，LTCB=左过渡细胞束，MTCB=中过渡细胞束，RTCB=右过渡细胞束，CFB=中心纤维体