土壤溶菌酶提取的实验报告

学术活动实验报告

题 目： 土壤中溶菌酶的筛选与发酵

指导老师：

小组成员：

时 期：

目 录

摘 要……………………………………………………………… 1 一：实验目的………………………………………………………… 1 二：实验原理………………………………………………………… 1

2.1什么是溶菌酶………………………………………………… 1

2.2溶菌酶的应用………………………………………………… 2

2.3实验指示菌…………………………………………………… 3 三：实验内容……………………………………………………… 3

3.1 实验器材……………………………………………………… 3

3.2 实验步骤……………………………………………………… 4 四：实验结果记录…………………………………………………… 8 五：实验心得体会…………………………………………………… 9

摘 要：土壤是微生物生活的大本营，是寻找有重要应用潜力的微生物的主要菌源。通过采用无菌操作技术，先用稀释法制备土壤的菌悬液，然后结合选择培养基用平板划线法分离出溶菌酶，通过观察和描述培养特征对菌株所属类群进行初步鉴定，对溶菌酶进行发酵。

关键词：土壤 溶菌酶 分离 纯化 细菌 无菌

一、 实验目的

1. 掌握溶菌酶的生长特性以及培养方法。

2. 掌握溶菌酶实验的基本生物技术，主要包括无菌操作技术、纯种分离技术、纯种培养技术。

3. 掌握合成培养基并选择培养基的制备方法。

4. 学习对微生物实验的中出现问题的分析解决方法。

二、 实验原理

2.1什么是溶菌酶

溶菌酶（lysozyme ）又称胞壁质酶（muramidase ）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA 、RNA 、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。

溶菌酶存在于人体的各个组织中，如心、脏、脾、肺和肾等，

其中以肾和肺中含量最高。鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中也含此酶，其中以蛋清含量最为丰富。植物中有溶菌酶， 目前已从木瓜、无花果、芜菁、大麦等植物中分离出溶菌酶，其分子量较大，约为24000～29100。

溶菌酶是很稳定的蛋白质，有较强的抗热性。蛋清溶菌酶是C 型，是已知的最耐热的酶。溶菌酶不会因为有机溶剂的处理而失活，当转移到水溶液中时，溶菌酶的活力可全部恢复。溶菌酶可被冷冻或干燥处理，且活力稳定。溶菌酶适宜pH5.3~6.4，可用于低酸性食品防腐。溶菌酶的抗菌谱较广，不仅局限于G+ 菌，对部分G­ 菌也有抑制效果。溶菌酶作为防腐剂安全性高。溶菌酶是一种天然蛋白质，1992年FAO/WTO 的食品添加剂协会已经认定溶菌酶在食品中应用是安全的。

2.2溶菌酶的应用

2.2.1医学应用

可作为一种具有杀菌作用的天然抗感染物质。有抗菌、抗病毒、止血、消肿止痛及加快组织恢复功能等作用。临床用于慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、口腔溃疡、水痘、带状疱疹和扁平疣等。也可与抗菌药物合用治疗各种细菌和病毒感染。口服和肌注均有效。口服，3～5片/次(肠溶片含10mg) ，3次/日。口含，1片/次(口含片含20mg) ，4～6次/日。外用：以1%～2%溶液滴注、涂擦或直接喷粉。肌注，50mg ～100mg/次，1～2次/日。滴眼：用2%溶液。

2.2.2食品和发酵工业

溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质，又具有一定的溶菌作用，因此可用作食品防腐剂。现已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐；还可以添入乳粉中，使牛乳人乳

化，以抑制肠道中腐败微生物的生存，同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖。此外，还能利用溶菌酶生产酵母浸膏和核酸类调味料等。

2.2.3 副作用

偶有较轻的过敏反应。氯化溶菌酶医疗效果更广，有浓痰分散、出血抑制、组织修复、消炎镇痛、抗过滤性病毒等作用，因而用氯化溶菌酶的制药有消炎消痔、治感冒、皮肤病及眼、鼻、喉等用药。

2.2.4细胞工程

溶菌酶具有破坏细菌细胞壁结构的功能，以此酶处理细菌可得到原生质体，因此，溶菌酶是基因工程、细胞工程中细胞融合操作必不可少的工具酶。

2.3 实验指示菌

金黄色葡萄球菌 (Staphyloccocus aureus ) 是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属（Staphylococcus ），有“嗜肉菌" 的别称，是革兰氏阳性菌的代表，可引起许多严重感染。所以在实验过程中一定要严谨，不要污染实验环境。

三、 实验内容

3.1 实验器材

1. 器材：培养皿、载玻片、 量筒、滴管、吸水纸、烧杯、三角瓶、酒精灯、玻璃棒、接种环、镊子、 恒温培养箱、高温灭菌锅、 无菌操作台 、 天平、滤纸、pH 试纸等 。

2. 试剂：

指示菌培养基:Luria-Bertani(LB)培养基，蛋白胨1%，酵母膏

0.5%，NaCl 1%，pH 值调至7.2-7.4，121℃灭菌20min 。

初筛培养基及菌株的保存培养基: 蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，

NaCl 1%，琼脂 1.5%-2%。pH 值调至7.2-7.4，121℃灭菌20min 。

基础培养基: 蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，NaCl 1%。pH 值调至

7.2-7.4，121℃灭菌20min 。

摇瓶发酵产酶培养基:可溶性淀粉 1.25%，牛肉膏2.5%，玉米浆

1%，Tween 0.1%，pH 值调至7.0，121℃灭菌 20min。

土壤稀液：5g 土壤研磨，加10g 无菌水，梯度稀释10-6 倍。（梯度稀释：取1ml 原液加入9 ml无菌水，反复五次，即为10-6 倍）

3.2 实验步骤

步骤一：

1. 土壤的稀释：

①研磨土壤，量取5g 土壤加入锥形瓶中贴标签；

②加入50mL 的水用报纸封口；

③土壤溶液放入恒温振荡器中震荡20分钟；

④取5个试管，分别加入 900µL的水；

⑤从锥形瓶的土壤溶液中吸取100µL的溶液滴入第一个试管中，

反复吸放几次使溶液均匀；

⑥换枪头从第一个试管中吸100µL的溶液至第二个试管中； ⑦反复吸上吸下几次，使溶液均匀再换枪头吸100µL入第三个试管中；

⑧如此直至到第五个试管, 然后给第五个管贴标签即为10 6的土壤稀释液;

2. 初筛培养基的配置（三组共作200mL ）：

①取一个大锥形瓶，用电子称称量2.08g 蛋白胨放入大锥形瓶

中；

②用小锥形瓶称量 1.03 牛肉膏；

③在瓶中加入50 ml水加热用玻璃棒搅拌溶解加入大锥形瓶中； ④称量NaCl1.99g 加入大锥形瓶，加入50ml 水摇匀后，再加100ml 水，通过分两次加水避免出现球状不溶物；

⑤配制NaOH 溶液，用EP 管不断向大锥形瓶滴加NaOH 溶液同时用PH 试纸测溶液的PH 直至溶液的PH 值到7.2~7.4，之所以要这么做是因为实验室的水是弱酸性的；

⑥加入琼脂3.97g 加热至溶解，用报纸包扎封口，贴标签；

3. 指示剂培养基的配置（三组共作200mL ）：

①用电子称取2.03g 蛋白胨加入大锥形瓶，

②用小锥形瓶称量1.01g 酵母膏加50ml 水加热用玻璃棒搅拌溶解加入大锥形瓶中，

③称2.01gNaCl 加入大锥形瓶，加入50mL 水摇匀；再加100mL 的水摇匀（多次分量加可以使物质溶解的更快）；

④用滴液管吸NaOH 溶液，搅拌测PH ，直至PH 在7.2~7.4（滴液

管保持竖直避免污染）；

⑤称量琼脂4.02g 加入搅拌；

⑤加热同时搅拌，加热至溶解，用报纸包扎封口，贴标签；

4. 高温灭菌：

⑴将两个培养基放入高温蒸汽箱中,120 ºC 灭菌约一个小时, 其中实际处于120 ºC20min ，先在锅底加水，放入培养基，盖上盖子，关闭两个排气阀，设定好时间和温度后开始加热，冷却时先旋开侧面排气阀再拨开上面的排气阀，待锅内相对气压降为零再开盖； ⑵打开无菌操作台的紫外灯，取出来培养液放入在无菌箱中稍等

约10min ，然后趁热未凝固倒入培养皿中，以培养皿表面铺一层为宜，贴标签；

⑶每组初筛和指示培养基各两个，3组共计12个，晾凉，待培养液完全凝固后倒置在工作台中以待下一步处理；

5. 土壤溶液的涂抹：

①点燃酒精灯，用滴液管区第五支EP 管中的土壤溶液200µL滴加在培养基上；

②用酒精浸湿涂抹棒后在酒精灯上烧烤消毒，打开培养基时用酒精灯火焰烧一下开启处，用涂抹棒把培养皿盖上的水蒸气刮掉作为冷却；

③用涂抹棒将滴上去的土壤溶液做同心圆涂抹，直至培养及表面无液体流动，抹得过程不要太用力以免刮破培养基，如果刮破了就绕开破损处, 这个过程很慢，要有耐心；

④按以上步骤涂抹另外三个培养基；

⑤完成后翻过来放入生化培养箱中进行培养1~2天，培养箱温度为37 ºC 左右。

⑥按1g 水:1g玉米配置一些玉米浆备用。

步骤二：

活性检测：

将培养基取出，可以看到指示培养基上长出不少一点点的金黄色菌落这就是金黄色葡萄球菌的菌落，初筛培养基上长出成斑片状白色的菌落这是能分泌溶菌酶的菌落。

找出菌落长得比较好的三组；将初筛①的菌接种到指示菌②的金黄色菌落周围；再取一些指示②的金黄色葡球菌接种到初筛②上面菌落周围。

接种时先把接种环浸酒精再在酒精灯火焰上烤消毒烧成红亮，挥几下冷却，打开培养基时用酒精灯火稍微焰烧一下开启处，然后用接种环刮一个转移菌落再在所接种目标菌落周围刮一圈就可以了，每一次接种后都要消毒接种环并记得贴上标签。

接种后再把培养基倒置放入生化培养箱中进行培养1~2天。 步骤三：

扩大培养：

将培养基取出，可以看到接种的菌落相接处金黄色菌落出现一些溶解现象。说明活性检测成功。

1. 配置发酵培养基（2组共作200mL ）：

①取250ml 容量的锥形瓶，用电子秤称取2.5g 可溶性淀粉加入锥

形瓶，

②称取5g 牛肉膏加50ml 水电炉加热溶解倒入；

③用漏斗、滤纸滤玉米浆于小锥形瓶中，再用EP 管移2000µL到目标锥形瓶中，过滤的过程很慢，要有耐心，不要有渣滓； ④用EP 管移200µL的Tween 液到目标锥形瓶中, Tween液很油滑，动作要快，Tween 液是作为添加剂，加水至200ml, 配制NaOH 溶液，不断向大锥形瓶滴加NaOH 溶液同时用PH 试纸测溶液的PH 直至溶液的PH 值到7.0。

（注意今天配的培养液和4号配的不同，是不用加琼脂的， 扎好瓶口，贴上标签）

2. 配制指示剂培养基（本组200ml ）：

①用电子称取2g 蛋白胨加入大锥形瓶；

②用小锥形瓶称量1g 酵母膏加50ml 水加热用玻璃棒搅拌溶解加入大锥形瓶中；

③称2gNaCl 加入大锥形瓶，加入50mL 水摇匀；再加100mL 的水摇匀；

④用滴液管吸NaOH 溶液，搅拌测PH ，直至PH 在7.2~7.4（滴

液管保持竖直避免污染）；

⑤加热同时搅拌，加热至溶解，用报纸包扎封口，贴标签； 注意：今天配的培养液和4号配的不同，是不用加琼脂的。

3. 高温灭菌：

将两个培养基放入高温蒸汽箱中,120 ºC 灭菌约一个小时, 其中实际处于120 ºC20min ，先在锅底加水，放入培养基，盖上盖子，关闭两个排气阀，设定好时间和温度后开始加热，冷却时先旋开侧面排气阀再拨开上面的排气阀，待锅内相对气压降为零再开盖；

打开无菌操作台的紫外灯，取出来培养液放入在无菌箱中，将培养液分装入小锥形瓶中，每瓶约40ml ，每种培养液每组2瓶，贴上标签，冷却至常温。

4. 接种：

消毒接种环挥几下冷却后挖一个目标菌落再在扩大培养液中搅拌就可以了，每接完一个要消毒接种环防止交叉感染。我们组的菌落9月4日指示培养基中1份，9月6日指示培养基中1份，9月6日初筛培养基中2份，共4瓶。

四、 实验结果记录

下图为初筛培养基中有溶酶菌细菌的菌落。

下图为指示菌培养基中的金黄色葡萄菌培养的结果。

下图为初筛培养基及菌株的保存培养基中的结果。

五、 实验心得体会

在做本次实验前, 我以为不会难做, 就像以前做生物实验一样, 做完实验, 然后两下子就将实验报告做完. 直到做完接种时, 我才知道其实并不容易做, 但学到的知识与难度成正比, 使我受益匪浅。

在做实验前, 一定要将课本上的知识吃透, 因为这是做实验的基础, 否则, 在老师讲解时就会听不懂, 这将使你在做实验时的难度加大, 浪费做实验的宝贵时间. 比如做应变片的实验, 你要清楚电桥的各种接法, 如果你不清楚, 在做实验时才去摸索, 这将使你极大地浪费时间, 使你事倍功半. 做实验时, 一定要亲力亲为, 务必要将每个步骤, 每个细节弄清楚, 弄明白, 实验后, 还要复习, 思考, 这样, 你的印象才深刻, 记得才牢固, 否则, 过后不久你就会忘得一干二净, 这还不如不做. 做实验时, 老师还会根据自己的亲身体会, 将一些课本上没有的知识教给我们, 拓宽我们的眼界, 使我们认识到这门课程在生活中的应用是那么的广泛。

通过这次溶菌酶筛选的实验, 使我学到了不少实用的知识, 更重要的是, 做实验的过程, 思考问题的方法, 这与做其他的实验是通用的, 真正使我们受益匪浅。