蛋白类药物生产

蛋白类药物生产工艺

蛋白质类药物是生化药物中非常活跃的一个领域，目前的生化产品主要是从动物脏器或组织包括人的血液中分离而得。20世纪70年代后，人们开始应用基因工程技术生产一些蛋白质药物，已实现工业化生产的产品如胰岛素、干扰素、白细胞介素、生长素、EPO、tPA、TNF等，现正从微生物和动物细胞的表达转向基因动植物发展。

第一节 主要蛋白质类药物的制备

蛋白质类药物主要包括蛋白质类激素、蛋白质细胞生长调节因子、血浆蛋白质类、黏蛋白、胶原蛋白及蛋白酶抑制剂等，其作用方式包括对机体各系统和细胞生长的调节、被动免疫、替代疗法等。

一、蛋白质激素类

蛋白质类激素主要包括垂体蛋白质激素、促性腺激素和其他蛋白质激素。其中垂体蛋白质激素包括 生长素(GH)、催乳激素(PRL)、促甲状腺素(TSH)、促卵泡激素(FSH)等。促性腺激素包括人绒毛膜促性腺激素(HCG)、血清促性腺激素( SGH )等。其他蛋白质激素包括胰岛素、胰抗脂肝素、尿抑胃素等。

(一) 生长素(growthhormone，GH)

生长素是动物脑垂体前叶外侧的特异分泌细胞分泌的一种促进生长的蛋白质激素，具有调节生长与发育的功能，对多种人类疾病有很好的疗效。

人生长素（human growth hormone，hGH）由一条191个氨基酸的多肽构成的一链多肽的球形蛋白质，分子中含两条二硫键，分子量为21700，等电点4.9，沉降系数S20，W 2.179，其活性不需要整个分子结构，N端1～134氨基酸为活性所必需，C端的肽链起到保护作用，其化学结构与催乳素近似，故生长素有弱催乳素作用，而催乳素有弱生长素作用。生长素包含大小两个环，以亲水球蛋白的形式存在。不同种类动物的生长素，其化学结构与免疫 264

性质等都有较大差别。生长素的生产工艺有传统的方法和基因工程技术方法。

1．生长素的传统生产方法

传统方法是从脑垂体前叶分离纯化，其生产工艺见图11-1所示。

提取 分级沉淀 传统的工艺过程如下:

① 材料获取 处死动物，立即解剖，取出脑垂体，冰上速冻，-20℃冷冻保存。

② 预处理 脑垂体使用前，用蒸馏水冲洗数次，解冻，剥离前后叶。

③ 匀浆 取动物垂体前叶，分割成小块，加水，用硫酸铵调pH至5.5，臵组织捣碎机中匀浆。

④提取 对匀浆以水抽提，10 000rpm离心30min；取沉淀，以pH 4.0的0.1mol／L硫酸铵溶液抽提，离心（同上），取沉淀，再用pH 5.5的0.25mol／L的硫酸铵溶液抽提，离心，取上清抽提液。

⑤沉淀 调节抽提液pH 7.5，加饱和硫酸铵溶液至硫酸铵浓度为lmol／L，离心，取上清液。

⑥再沉淀 对上清液再加饱和硫酸铵溶液至1.8mol／L，离心，得沉淀。

⑦除盐 将沉淀溶于少量蒸馏水中，对蒸馏水进行透析，得透析内液。

⑧等电点沉淀 将所得透析内液用HCL或NaOH分别依次于pH 4.0和pH 4.9进行等 265

电点沉淀以除去杂蛋白，离心、取上清液。

⑨盐析 调上清液pH为4.0，加饱和硫酸铵溶液至浓度为1.25mol／L盐析，离心，得沉淀物。

⑩除盐 将沉淀物溶于少量蒸馏水中，对含0.1mol／L氯化钠的Tris-HCL (pH 8.5) 缓冲溶液进行透析，得透析内液。

⑩凝胶过滤 透析内液上Sephades G-75凝胶柱，用含0.1 mol／L氯化钠的50mmol／L Tris-HCL (pH 8.5 )缓冲溶液进行洗脱，分步收集，活性GH存在于第Ⅱ峰中。

⑩透析 将活性峰部分对6.5mmol／L的硼砂-盐酸(pH 8.7)缓冲溶液进行透析，得透析内液。

⑩层析 将透析内液上DEAE-C(DE-52)柱，用含0～0.3mol／L氯化钠的6.5mmol／L硼砂-盐酸 ( pH 8.0 ) 缓冲溶液进行梯度洗脱，合并活性峰，脱盐，冻干得GH。

2．人生长素的基因工程法

hGH的种属特异性很强，动物生长激素不能用于人，所以开始时hGH的惟一来源是从人尸体的脑垂体中取得，来源困难，价格昂贵，应用受到限制。目前已利用基因工程技术生产出hGH，美国的Genentech公司利用枯草杆菌系统表达的hGH产量高达1.5g/L，这也是第一代重组人生长激素，商品名称为Protropin.

生产路线如图11-2所示。

（1）工艺过程如下：

266 图11-2 利用基因工程菌生产生长素的工艺路线（）

① 工程菌的构建 利用基因工程技术构建高效分泌型基因工程菌株，在生长激素的N-端增加分泌信号肽序列，使表达合成的重组人生长激素结构和天然人生长激素完全一致。

② 菌种繁殖 采用M9培养基，添加CAA(酪蛋白氨基酸)，调节pH 至7．0，臵于摇床上，30℃，进行菌种培养繁殖。

③发酵 培养基同菌种繁殖培养基，种子培养过夜，开始进行发酵，时间一般为16~18h，温度为37℃，pH7.0~7.5，溶解氧不能低于20%。

④补料发酵 在发酵进行5~7 h后，需要适量补充葡萄糖、酵母浸出物、氮源、CAA、无机盐和微量无素，如PO43-、Fe2- 、Co2- 等离子，通过添加补料，可使菌体生长的对数期延，发酵菌体产量增加了一倍。其余的发酵条件与上述条件相同，菌体生长至稳定期放罐。。

⑤离心 将发酵菌体进行冻融破碎，按一定比例，加入预冷的由10 mmol/L Tris和1mmol/L EDTA组成的缓冲溶液（pH 7.5），80rpm搅拌1h，离心，收集上清液。

⑥粗提 在上清液中加入硫酸铵至饱和浓度45%，4℃放臵2h，10000rpm离心30min，收集沉淀。

⑦脱盐 沉淀用10 mmol/L Tris和1mmol/LEDTA组成的pH值为8.0的缓冲溶液溶解，用Sephadex -G25脱盐。

⑧纯化 采用Phenyl-Sepharose，DEAE-Sepharose进行色谱，再加入固体硫酸铵达到饱和浓度45%，沉淀2h，离心，收集沉淀，溶解沉淀，再通过sephacryl S-11HR及DEAE-Sepharose进行纯化，得到人生长激素原料药半成品.。

（2）质量检验：质量必须符合2005年版二部附录规定。

目前，人和动物生长素基因都已在大肠杆菌中表达成功，重组人生长激素将会得到大规模的生产，从而造福人类。

(二) 胰岛素 ( insulin )

胰岛素是胰脏中胰岛β细胞分泌的一种蛋白质激素，它是促进合成代谢的激素，在调 267

节机体糖代谢、脂肪代谢、核蛋白质代谢方面都有重要作用，是维持血糖在正常水平的主要激素之一。广泛存在于人和动物的胰脏中，正常人的胰脏约含有200万个胰岛，占胰脏总质量的1.5％。胰岛由α、β和δ三种细胞组成，其中α细胞制造胰高血糖素和胰抗脂肝素，β细胞制造胰岛素，δ细胞制造生长激素抑制因子。胰岛素在β细胞中开始时是以活性很弱的前体胰岛素原存在，进而分解为胰岛素进入血液循环，能使血糖降低，起到调节血糖作用。临床上主要用于治疗胰岛素依赖性糖尿病及糖尿病昏迷和酮症酸中毒、精神分裂症、休克等。

胰岛素由A、B两条链组成，A链含21个氨基酸残基，B链含30个氨基酸残基，两链之间由两个二硫键相连，在A链内部含有一个二硫键。不同种属动物的胰岛素分子结构大致相同，主要差别在A链二硫桥中间的第8位、9位和10位上的三个氨基酸及B链C末端的一个氨基酸上，随种属而异，但其生理功能是相同的。生产胰岛素的方法较多，有传统的方法和基因工程技术方法。

1．动物胰脏制胰岛素

由动物胰脏生产胰岛素的方法较多，目前被普遍采用的是酸醇法和锌沉淀法。现以酸醇法为例，介绍胰岛素的生产工艺。其工艺路线如图11-3所示。

提取 碱化

图11-3 酸醇法生产胰岛素的工艺路线

（1）工艺过程如下：

268

① 提取 冻胰块用刨胰机刨碎，加入2.3～2.6倍的86％～88％乙醇(质量分数)和5％草酸，在12±2℃搅拌提取3h，离心。滤渣再用1倍量68％～70％乙醇和0.4％草酸提取2h，离心，合并乙醇提取液。沉淀用于回收胰岛素。

② 碱化、酸化 边搅拌提取液边加入浓氨水调pH 8.0～8.4 (12±2℃)，立即过滤，除去碱性蛋白，滤液应澄清，并及时用硫酸酸化至pH 3.6～3.8，降温至5℃，静臵4h以上，使酸性蛋白充分沉淀。

③ 减压浓缩 吸取上清液至减压浓缩锅内，下层用帆布过滤，沉淀物弃去，取上清液，30℃以下减压蒸去乙醇，浓缩至浓缩液相对密度为1.04～1.06 (约为原体积的1／10～1／9为止)。

④ 去脂、盐析 浓缩液转入去脂锅内，5min内加热至50℃后，立即用冰盐水降温至5℃，静臵3～4h，分离下层清液 (脂层用于回收胰岛素)。用盐酸调pH 2.3～2.5，于22±2℃搅拌加入27％(质量体积分数)固体氯化钠，保温静臵数小时。析出物即为胰岛素粗品。 ⑤ 精制 盐析物按干重计算，加入7倍量蒸馏水溶解，再加入3倍量的冷丙酮，用4mol／L氨水调pH 4.2～4.3，然后补加丙酮，使溶液中水和丙酮的比例为7∶3。充分搅拌后，低温5℃以下放臵过夜，次日在低温下离心分离，取上清夜，在上清夜中加入4mol／L氨水使pH 6.2～6.4，加入3.6％(体积分数)的醋酸锌溶液(浓度为20％)，再用4mol／L氨水调节pH 6.0，低温放臵过夜，次日过滤，分离沉淀。

⑥ 结晶 将沉淀用冷丙酮洗涤，得干品，再按干品质量每克加冷2％柠檬酸50mL、

6.5％醋酸锌溶液2mL、丙酮16mL，并用冰水稀释至100mL，使其充分溶解，5℃以下，用4mol／L氨水调pH 8.0，迅速过滤。滤液立即用10％柠檬酸溶液调pH 6.0，补加丙酮，使整个溶液体系保持丙酮含量为16％。慢速搅拌3～5h使结晶析出。在显微镜下观察，外形为正方形或扁斜形六面体结晶，再转入5℃左右低温室放臵3～4d，使结晶完全。离心收集结晶，并小心刷去上层灰黄色无定形沉淀，用蒸馏水或醋酸铵缓冲液洗涤，再用丙酮、乙 269

醚脱水，离心后，在五氧化二磷真空干燥箱中干燥，即得结晶胰岛素。

（2）质量检验 测定胰岛素效价，各国药典规定有家兔血糖降低法和小鼠血糖降低法。

（3）在整个生产过程中，为提高胰岛素的质量和产量，应注意以下几个方面：

① 胰脏质量是胰岛素生产中的关键，在我国是一个薄弱环节。工业生产用的原料主要是猪、牛的胰脏。不同种类和年龄的动物，其胰脏中胰岛素量有所差别，牛胰含量一般高于猪胰。采摘胰脏要注意保持腺体组织的完整，避免摘断，并且离体后要立即深冻，先在-30℃以下急冻后转入-20℃保存备用，如用液氮速冻，效果更好。在胰脏中，胰尾部分胰岛素含量较高，如单独使用可提高收率10％。

② 浓缩 浓缩工序的条件，对胰岛素收率影响很大。如采用离心薄膜蒸发器，在第一次浓缩后，浓缩液用有机溶剂去脂，再进行第二次浓缩，被浓缩溶液受热时间极短，避免了胰岛素效价的损失。

③ 产品纯度 在常规的结晶胰岛素中，除了胰岛素主成分外，还含有其他一些杂蛋白抗原成份，如胰岛素原、精氨酸胰岛素、胰多肽等。因此要对结晶胰岛素进一步纯化，胰岛素原的含量显著降低。

2．人胰岛素的制备

（1）酶促半合成法

猪与人的胰岛素差别仅是B30位上的一个氨基酸，猪的是丙氨酸，人的则是苏氨酸。利用胰蛋白酶的转酰胺作用，将猪胰岛素转化为人胰岛素B30苏氨酸(丁酰基)丁酸，通过硅胶柱层析，然后用三氟乙酸处理，断裂保护基团，再用离子交换层析纯化，得到高纯度人胰岛素。

（2）利用基因工程技术制备

目前，国际上生产医用重组人胰岛素( recombinant human insulin, rhI)的方法主要有3种:

1)用基因工程大肠杆菌( Escherichia coli, E.coli)分别发酵生产人胰岛素( human insulin, 270

hI)的A、B链。然后经化学再氧化法,使两条链在一定条件下重新形成二硫键,得到hI。这一方法缺点较多,目前已较少使用。

2)用基因工程E. coli发酵生产人胰岛素原( human proinsulin, hP I) ,后经加工形成h I。这种方法，E. coli系统表达量高,但缺点是不利于表达hI这样的小蛋白,产物易降解,故常采用融和蛋白形式将hPI连接在一个较大的蛋白质后,表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活性的hI。

3)通过基因工程酵母菌发酵生产hP I,经后加工形成hI。酵母系统下游后加工比细菌表达系统简单,但缺点是生产慢,生产周期长,且重组蛋白分泌量少(1～50 mg/L) ,产量低。

工艺生产过程见图11-4。

① 菌种

RRhP I/pQE-40 E.coli M15菌株

② 培养基

培养基组成为：5g/L 胰蛋白胨,2g/L谷氨酸,7g/L酵母浸膏,0.5 g/L硫酸铵, 2.5 g/L葡萄糖, 2.7 g/L甘油,100mg/L 氨苄青霉素, 50mg/L卡那霉素, pH 7.2。

③ 一次发酵

将10 ml经过活化的RRhP I/ pQE-40 E.coliM15转移至100 ml培养基中进行培养, 活化菌种。

④ 发酵罐培养

将一次发酵液转移至含有1.5 L 培养基的发酵罐中进行发酵罐培养(转速为300 r/min,通气量为1∶1. 5～1∶1.8) ,一段时间后加入一定量新鲜的培养基并用NaOH 调节pH。在对数生长中期加入0.5mmol /L IPTG并升温诱导RRhPI表达4 h,转速随即调为400～500 r /min,增大通气量至1∶1.8～1∶2.0,继续培养一段时间后,收集菌体。

⑤ 包涵体的收集和洗涤

271

将收集的湿菌体冻存于-20℃,然后悬浮于缓冲液A(50 mmol/L Tris-HCl, 0. 5 mmol/L EDTA,50 mmol/L NaCl, 5%甘油, 0.1～0.5 mmol/LDTT,pH7.9) ( 5～6 ml/g湿菌)中,加入溶菌酶( 5 mg/g湿菌体) ,室温或37℃振荡2 h。冰浴超声10 s×30次,其间每次间隔20 s,功率为200W。10℃条件下1000 g离心5 min去除细胞碎片。上清液中的包涵体( Inclusion body, IB)在4 ℃条件下27000 g离心15 min收集,然后用含2 mol/L 尿素的缓冲液A充分悬浮,室温静臵30 min后4 ℃条件下17000 g离心15 min,收集沉淀。沉淀再用含2%脱氧胆酸钠的缓冲液A充分悬浮, 4 ℃条件下17000 g离心15min,收集沉淀。最后沉淀用10 mmol/L Tris-HCl,pH

7.3洗涤两次(4℃,17000 g离心15 min ) 。

⑥ RRhPI的初步纯化

将收集的IB用含有0.1%～0.3%β-巯基乙醇的缓冲液B( 30 mmol/L Tris-HCl, 8 mol/L尿素, pH 8.0)溶解,上于已用缓冲液B平衡的DEAE-Sepharose FF柱,用合适的氯化钠梯度洗脱,收集含RRhPI的洗脱液。

⑦ RRhPI的重组复性

将初步纯化后的RRhPI通过Sephadex G-25脱尿素,转换缓冲液为不同pH的50 mmol/L Gly-NaOH重组液,或含有适量GSSG的Gly-NaOH缓冲液中,使蛋白终浓度为0.1～0.6 mg/ml,收集趋于正确折叠的RRhPI单体组分,加入适量GSH 和GSSG,4℃放臵24 h。

⑧ 酶切转化

向RRhPI复性液中加入一定量的胰蛋白酶和羧肽酶, 37℃酶切一段时间,然后用0.1 mol/L ZnCl2 终止反应并沉淀生成的hI。

⑨ hI的纯化

将0.6g IB分别用含0.1%, 0.2%, 0.3%β-巯基乙醇的30 mmol/L Tris-HCl, 8 mol/L尿素, pH8.0 溶解,进行DEAE-Sepharose FF 离子交换层析,然后将收集得到的RRhPI组分通过Sephadex G-25脱尿素以使RRhPI复性。

272

图11-4 利用基因工程菌生产人胰岛素的工艺路线（仿自李晓红，2007）

二、

蛋白质类细胞生长调节因子

蛋白质类细胞生长调节因子包括干扰素（IF）α、β，γ、白细胞介素1-18 (IL)，神经生长因子（NGF）、肝细胞生长因子(HGF)，血小板衍生的生长因子(PDGF)，肿瘤坏死因子(TNF)，集落刺激因子(CSF)，组织纤溶酶原激活因子(t-PA)，促红细胞生成素(EPO)，骨发生蛋白(BMP)等。

(一) 干扰素（Interferon ,IFN）

干扰素指由干扰素诱生剂诱导有关生物细胞所产生的一类高活性、多功能的诱生蛋白质。这类诱生蛋白质从细胞中产生和释放之后，作用于相应的其它同种生物细胞，并使其获得抗病毒和抗肿瘤等多方面的“免疫力”，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节活性的作用，是人体防御系统的重要组成。人干扰素根据其来源细胞不同，分为白细胞干扰素(IFN-α)、类淋巴细胞干扰素(IFN-α与IFN-β的混合物)、成纤维细胞干扰素(IFN-β)、T细胞干扰素 (IFN-γ)等几类。按其抗原性的不同，分为α型、β型和γ型三种，同一型别，根据氨基酸序列的差异，又分为许多亚型，如常用的IFN-α包括IFN-αⅡa、IFN-αIb和IFN-αⅡb等亚型。干扰素具有沉降率低，不能透析，可被胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶破坏，不被DNase和RNase水解破坏等特性。

干扰素的生产方法有传统的体外诱生法和基因工程法。

1．传统的体外诱生法

传统的方法是通过体外诱生的方法获得干扰素。干扰素具有高度的种属特异性，临床使用的干扰素都用人的细胞制备，α-干扰素用人血白细胞或淋巴细胞制备；β-干扰素用人成纤维细胞制备。目前我国已完善了利用血库血大量制备人血细胞干扰素的方法，达到106U

273

／mg蛋白的水平。其工艺路线见图11-5。

图11-5 诱生法生产干扰素的工艺路线

（1）工艺过程如下：

① 分离灰黄层 取新鲜血液400mL/份，加入ACD抗凝剂，离心，分离出血浆，小心抽取灰黄层。每份血可抽取13～15mL，放臵4℃冰箱中过夜。

② 氯化铵处理 每份灰黄层加入30mL缓冲盐水，再加入9倍体积量的0.83％冷氯化铵，混匀，4℃放臵10min，4℃离心(8000 r/min) 20min。弃上清液，加入适量缓冲盐水，收集沉淀细胞，制备悬浮液，重复上次处理，溶解残存的红细胞。取沉淀的白细胞悬于培养液中，冰浴保存，取样作活细胞计数。

③ 启动诱生 于白细胞悬浮液加入白细胞干扰素，使其浓度为100μg／mL，37℃水浴搅拌培养2h。

④ 正式诱生 启动后的白细胞加入仙台病毒(在10天龄鸡胚中培养48～72h，收获尿囊液)使其最后浓度为100～150血凝单位／mL，在37℃搅拌培养过夜。仙台病毒诱导人白细胞产生。

⑤ 收集 将培养物离心(2500 r/min) 30min，吸取上清液即得粗制干扰素。

⑥ 纯化 在粗制干扰素中加入硫氰化钾到0.5mol／L，用盐酸调pH为3.5，离心，得

274

沉淀l。沉淀1加入原体积1／5量的冷乙醇( 94％)，离心，得上清液1。上清液1用盐酸调节pH 5.5，离心弃去沉淀，再调至pH 5.8，离心，得上清液2和沉淀2。沉淀2加入原体积1／50量的甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 2)溶解，得IFNl。上清液2用NaOH调节pH值至8.0，离心，弃上清液，得沉淀3。沉淀3加原体积1／50量的0.lmol／L PBS和0. 5mol／L硫氰化钾(pH 8)溶解，pH值降至5.2，离心，得上清液3和沉淀4。 沉淀4加原体积1／25000量pH 为8.0的0.1mol／L PBS溶解，调至pH为7～7.5，对PBS ( pH 7.3)透析，过夜，离心，收集上清液，检测，得IFN-β。调节上清液3 pH值为3.0，离心，得沉淀5。沉淀5加入原体积1／5000量的pH 8.0，0.1mol／L PBS，加NaOH调节pH 7～7.5，对PBS ( pH7.3)透析过夜，离心，收集上清液，检测，得IFN-α。

（2）质量检验 我国用微量板染色的病变抑制法测定。国际上规定，能保护50%细胞免受病毒攻击的浓度即为一个IFN活性单位。

该法特点是一次纯化量大，回收率高于60％；经济，简便，易于普及，效价可达1.2×108U／mL，比活2.2×106 U／mg(蛋白)。IFN-α中干扰素含量占回收干扰素的82％，比活也比较高。

2．基因工程法

随着生物技术的发展，运用基因工程技术，已能在人体外大规模地生产人干扰素即基因工程干扰素。

目前，编码干扰素的基因已能在大肠杆菌、酵母菌和哺乳动物细胞中得到表达。α、β、γ三型基因工程干扰素都已研制成功，并投放市场，用于治疗的病种达20多种。我国卫生部已批准生产的干扰素品种有IFN-αlb、IFN-αⅡa、IFN-αⅡb和IFN-r四种。目前，人们在利用蛋白质工程技术研制活性更高，更适于临床应用的干扰素类似物和干扰素杂合体等各种新型干扰素。生产技术路线如图11-6所示。

275

图11-6 利用基因工程生产干扰素的工艺路线

① 基因工程菌的构建

首先从产生干扰素的白细胞中提取干扰素mRNA，对其进行分级分离。通过蟾蜍卵母细胞找出活性最高的mRNA，并用此mRNA合成cDNA。将cDNA与含四环素和氨苄抗性基因的质粒pBR322重组，转化大肠杆菌K12，得到重组子质粒。对每个重组子用粗提的干扰素mRNA进行杂交，把得到的杂交阳性克隆中的重组质粒DNA放到无细胞合成系统中进行翻译。对翻译体系的产物进行干扰素活性检测。再将干扰素的cDNA转入大肠杆菌表达载体中，转化大肠杆菌在特定条件下进行高效表达。其生产流程如图11-7所示。

图11-7 构建干扰素工程菌的一般流程

② 工程菌的发酵

a.种子制备 将构建的基因工程菌传代后于-70℃下甘油管中保存。如构建的人干扰素-αⅡb基因工程菌SW-IFN-aⅡb／E.coli-DHSa。质粒用PL启动子，含氨苄西林抗性基因。使用时进行活化。

b.种子罐培养 将菌种按1％种量接种到种子培养基，种子培养基的配方：1％蛋白胨、

276

0.5％酵母提取物、0.5％NaCl；30℃摇床培养10h，作为发酵罐种子使用。

c.发酵罐培养 发酵培养基的配方：1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.01％NH4Cl、0.05％NaCl、0.6％Na2HP04、0.001％CaCl2、0.3％KH2P04、0.01％MgS04、0.4％葡萄糖、50mg／mL氨苄西林、少量防泡剂。用15 L发酵罐进行发酵，发酵培养基的装量为10 L，pH 6.8，搅拌500 r/min，通风比为1：1／(m3·min)，溶氧为50％。30℃发酵8h，然后在42℃诱导2～3h完成发酵。同时每隔不同时间取2mL发酵液，在10 000 r/min离心除去上清液，称量菌体湿重。

在整个发酵过程中，要注意：（1）不同发酵阶段培养基的成分有差异；（2）培养液中要有足够的溶解氧，不同的培养阶段需要的溶解氧量也不同，通常通过增大搅拌速度，增加空气流量或者通入纯氧来满足条件；（3）发酵过程中在不同的阶段应控制不同的pH，发酵后期要降低pH，减少干扰素的水解；（4）要控制适当的温度，既要保证菌体细胞膜的完整和细胞中酶的活性，又要有利于提高干扰素的产量。

③ 产物的提取与纯化

a.提取 发酵结束后，冷却，离心(4000 r/min)，30min，收集沉淀，得湿菌体。取湿菌体悬浮于20mmol／L 的磷酸缓冲液(pH 7.0)中，冰浴中进行超声破碎，释放干扰素蛋白。4000 r/min离心30min，得沉淀，用含8mol／L尿素、20mmol磷酸缓冲液(pH 7.0)、0.5mmol／L二巯基苏糖醇溶液，室温搅拌抽提2h，然后15000 r/min离心30min。取上清液，用20mmol／L磷酸缓冲液(pH 7.0)稀释至尿素浓度为0.5mol／L，加二巯基苏糖醇至0.1mmol／L，4℃搅拌15h，15000 r/min离心30min，除去不溶物。上清液经截流量为104相对分子质量的中空纤维超滤器浓缩，将浓缩的人干扰素αⅡb溶液经过SephadexG-50分离，层析柱(2cm×l00cm)先用20mmol／L磷酸缓冲液(pH 7.0)平衡，上柱后用同一缓冲液洗脱分离，收集人干扰素αⅡb部分，经SDS-PAGE检查。

b．纯化 将Sephadex G-50柱分离的人干扰素αⅡb组分，再经DE-52柱(2cm×50cm) 277

纯化，人干扰素αⅡb组分上柱后用含0.05mol／L、0.1mol／L、0.15mol／L NaCl的20mmol／L磷酸缓冲液(pH 7．0)分别洗涤，收集含人干扰素αⅡb的洗脱液。全过程蛋白质回收率为20％～25％，产品不含杂蛋白、DNA及热原质。干扰素αⅡb含量符合要求。

3．干扰素质量检验

基因工程干扰素半成品和成品均应作检测，包括干扰素效价、蛋白质含量及比活性、纯度测定 、相对分子质量、残余外源性DNA含量、残余血清IgG含量、残余抗生素活性 、干扰素效价测定、无菌试验、热原质试验。

成品检测：①物理性状 冻干制品外观应为白色或微黄色疏松体，加入注射水后，不得含有肉眼可见的不溶物；②鉴别试验 应用EIASA或中和试验鉴定,结果为阳性；③水分测定 用卡氏法，水分含量应低于3％。半成品也要进行无菌试验、热原质试验、干扰素效价；④安全试验 取体重350～400g豚鼠3只，每只腹侧皮下注射剂量为人每千克体重临床使用最大量的3倍，观察7天，若豚鼠局部无红肿、坏死、总体重不下降，则说明成品合格。

(二) 人红细胞生成素( rhEPO)

1．结构与性质

红细胞生成素(EPO)是一种糖蛋白，是调节红系祖细胞，对红细胞生成有特异刺激作用的细胞因子，在胎儿体内由肾脏及肝脏产生，在成人体内主要由肾脏分泌，在病理状态下，与多种贫血尤其与终末期肾脏疾病贫血密切相关。红细胞生成素有两种，天然人红细胞生成素和重组人红细胞生成素。天然人红细胞生成素是以人的尿、血等为原料，经生物化学方法纯化得到。重组人红细胞生成素是以重组DNA技术生产的红细胞生成素，将人红细胞生成素的基因连接到表达载体上，转化CHO细胞，从细胞培养上清夜中纯化红细胞生成素。两种人红细胞生成素具有相同的体内体外活性，根据其糖基的不同，可以分为rhEPO-α和rhEPO-β两种。

278

2．生产工艺

图11-8 利用基因工程菌生产人红细胞生成素的工艺路线

工艺路线如图11-8所示。

① 克隆并筛选人红细胞生成素基因 获得人红细胞生成素基因的方式有两种，一种提取人胚胎mRNA，逆转录合成cDNA文库，筛选文库，得到人红细胞生成素基因，也可以通过筛选人胚胎基因组文库获得。另一种是提取胚胎染色体DNA，通过PCR扩增获得基因片段，再体外拼接。

② 构建红细胞生成素基因表达载体 与编码红细胞生成素基因片段相连的表达载体有pDSVL、pSV2 和pD11。以构建携带编码人红细胞生成素基因的核苷酸序列（prEP）的质粒为例进行说明。从人胚胎中提取总RNA，逆转录合成cDNA, 进行文库筛选，得到人红细胞生成素基因，将该基因与载体在连接体系中过夜, 加入T4 DNA连接酶。挑取单菌落接种于5mL培养基，37℃过夜。

③ 建立红细胞生成素表达的细胞株 将重组质粒导入哺乳动物细胞，经筛选得到所需要的细胞系，冻存备用。

④ 重组细胞株的培养 将冻存的细胞株取出，37℃水浴解冻，离心，弃去冻存液。采用转瓶培养细胞，将解冻的细胞株接种于适量的DMEM培养基，37℃、CO2培养箱中培

279

养，连续传代三次。采用消化酶将细胞消化，使细胞浓度为2.5×106个/mL，接种。采用生物反应器培养重组细胞株，采用DMEM培养基，加含小牛血清，控制条件pH 7.0、搅拌速度小于50 r/min, 37℃、DO为50％～80％，使细胞贴壁；细胞贴壁后提高转速80～100 r/min，培养10d；更换无血清培养基在进行灌流培养，在此过程中，连续收获培养液，在4℃～8℃保存。

⑤ 红细胞生成素的分离纯化 采用三步法纯化红细胞生成素，将培养液通过滤膜过滤，上CM-Sephrose亲和色谱柱，CM柱预先用Na-HAc-异丙醇活化，20mmol/L Tris-HCL平衡缓冲液平衡，然后用0～2mol/L Tris洗脱液洗脱，收集洗脱峰，10mmol/L Tris透析液中透析过夜。透析过程中，透析液的体积为蛋白液体积的15倍，换液4次，0.22um滤膜过滤。活性组分上平衡过的DEAE离子交换柱，0～1mol/L NaCL-HCL洗脱液洗脱，收集活性洗脱峰，再上10％乙腈平衡的RP-HPLC柱，10％～70％的乙腈洗脱液洗脱，收集活性洗脱峰，再用20mmol/L柠檬酸盐缓冲液平衡凝胶柱，并进行洗脱，收集活性洗脱峰，即为红细胞生成素。

⑥ 红细胞生成素的活性检测 红细胞生成素的活性可以通过放射免疫分析和体内生物活性分析，体内生物活性的测定可以采用网织红细胞计数法。

在生产过程中，重组细胞株的培养必须要注意是无菌条件、温度37℃、气体交换可靠、pH稳定7.0～7.2、葡萄糖是必不可少的碳源，另外采用生物反应器时要能及时添加培养液保证连续培养、载体要有足够的表面积，使得细胞株得以高密度、高表达连续培养。

（三）白细胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)

白细胞介素(interleukin，IL) 由白细胞或其他体细胞产生的又在白细胞间起调节作用和介导作用的一类细胞因子，是淋巴因子家族的一员。目前已有IL-1～18。许多白细胞介素不仅介导白细胞的相互作用，还参与其他细胞如造血干细胞、血管内皮细胞、纤维母细胞、神经细胞、成骨细胞和破骨细胞等的相互作用。IL-2主要由T细胞或T细胞系产生，脾脏、 280

淋巴结和扁桃腺中的T细胞受到刺激后都能产生IL-2，人和动物某些T细胞白血病细胞系或肿瘤细胞在有丝分裂原、钙离子载体(如 A23187) 或PMA刺激下可产生高水平的IL-2。

白细胞介素的生产方法有传统的体外诱生法和基因工程法。

1. 白细胞介素-2的传统生产方法

IL-2是由辅助T细胞经抗原或有丝分裂原等刺激，在巨噬细胞或单核细胞分泌的IL-1参与下，产生并分泌的含133个氨基酸的糖蛋白，分子量为15420。在pH为2～9范围内稳定，56℃ 1h内仍具有活性。临床上主要用于治疗一些免疫功能不全及癌症的综合治疗。白细胞介素-2的传统生产方法是通过诱生的方法获得。工艺路线如图11-9所示。

图11-9 诱生法生产白细胞介素-2的工艺路线

① 诱生 用加入鸡瘟病毒和PHA的培养液培养人外周血白细胞，这两种物质起到联合刺激的作用，37℃培养。

② 除变性蛋白 用6mol／L HCl调节pH2.0～2.5，再用6mol／L NaOH调回到pH7.2～

7.4，离心除去变性杂蛋白。

③ 硫酸铵分级沉淀 取上述离心后的培养上清液，加饱和硫酸铵至35％饱和度，4℃静臵24h，离心弃去沉淀。上清液补加固体硫酸铵至85％饱和度，4℃静臵24h，离心，收集沉淀。

④ 透析 将沉淀溶于pH 6.5、10mmol／L PBS中(内含2％正丁醇和0.15mol/L NaCL)。

281

对pH 6.5、10mmol／L PBS透析24h(更换5次透析外液)。

⑤ 蓝色琼脂糖层析 将上述透析内液通过Sepharose4B层析柱，用PBS洗去不吸附的蛋白，再用含0.4mol／L NaCl的PBS洗涤亲和柱，最后用含1.0mol／L NaCL的PBS解吸IL-2活性组分。

⑥ 凝胶层析 将解吸的IL-2活性组分经分子量为6000的PEG浓缩，再上ACA44U1-trogel层析柱。柱用含0.1％PEG、2％正丁醇和pH7.6的0.5mol／L甘氨酸的0.2mol/L Tris-HCL洗脱，得IL-2。

2．基因工程IL-2的制备

目前国内用酵母、动物细胞培养和用大肠杆菌基因重组的IL-2都已批准生产，并用于临床。重组IL-2的获得过程中，已成功地利用大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞来表达重组人IL-2，但在大量生产重组IL-2中主要是使用大肠杆菌。

① 基因工程菌的构建

从ConA激活的人白血病T细胞株提取高活性IL-2的mRNA作为模板，逆转录单链cDNA，经末端脱氧核苷酸转移酶催化，在cDNA末端连接若干dCMP残基，再以寡聚(dG)12～18为引物，利用DNA聚合酶I成双链cDNA，经蔗糖密度梯度离心法分离出此cDNA片段。通过GC加尾法将此cDNA片段插入到pBR322质粒的PstI位点，用重组质粒转化大肠杆菌K12株X1776，得到IL-2的cDNA文库。利用mRNA杂交试验筛选IL-2 cDNA文库得到含IL-2 cDNA质粒的菌株。已有一些携带人突变型白细胞介素2 ( IL-2) 的质粒，如pPIC9K等。

② 基因工程菌的发酵

将IL-2 工程菌接种于含氨苄青霉素的2 mL YPD 培养基中, 过夜培养, 以1 %接种入含100 mL BMGY的500 mL 三角瓶。30℃ 300 r/ min 培养至OD600 = 3～6 (大约16～18 h)。弃上清液并将菌体细胞沉淀悬浮在1/ 5 到1/ 10 原初始培养液体积的BMMY培养基中,0.5 % 282

到5 %甲醇诱导。在此过程中优化表达条件, 如通气状况、诱导时间（表达量随时间延长逐渐增加,培养48 h 达到高峰值）、初始pH 值、甲醇终浓度（目的蛋白量在甲醇浓度为1%时达到最高）等。外源蛋白在甲醇酵母中的表达分2步, 即菌体生长和蛋白诱导表达。先在以甘油为碳源的培养基上培养菌体, 达到一定OD 值后, 离心, 弃去上清液, 菌体悬浮于以甲醇为碳源的培养基中诱导表达, 每隔24 h 加1次甲醇, 以弥补甲醇的损失。

③ IL-2的分离

IL-2基因工程菌经发酵培养和诱导表达后，发酵液离心，收集菌体。菌体悬浮于PBS溶液中，超声破碎，离心沉淀，用PBS洗3次，尽量去除杂蛋白及核酸，离心粗制包涵体，包涵体主要含由IL-2单体分子聚合而成的多聚体，不溶于水，且其中的重组IL-2无生物活性。

④ 蛋白溶解

包涵体经常出现不溶解现象，使用高性能分散机，瞬间打开分子间的化学键，有利于变性剂继续打开蛋白质分子间和分子内的化学键，使蛋白完全溶解。可用6mol／L盐酸胍或8mol／L脲或尿素使包涵体变性解聚成单分子(变性后仍无生物学活性)。

⑤ IL-2的复性

采用50μmol/L CuSO4的含有PBS的溶液与IL-2粗品以1：50体积混合后, 臵室温过夜。。也可利用空气氧化，或还原型谷胱甘肽复性，恢复IL-2二硫键和正常分子结构，获得生物学活性。

⑥ 提高IL-2的复性率

在复性过程中,只有60%～70%的IL-2 能正确配对,另有30%～40%的IL-2 则会形成错配体和二聚体,收集生产过程中经高效液相色谱洗脱下来的错配体和二聚体（色谱峰的左部分）进行重新氧化复性,可以使IL-2的回收率提高20%以上。

⑦IL-2的纯化

283

用7mol／L尿素溶解IL-2包涵体，得到上清液，上清液经过SephadexG-100凝胶过滤和分子量为650的蛋白质纯化系统DEAE离子交换层析，得均一的IL-2，纯度高达98％，比活性达4.3×106U／mg蛋白，回收率为30.8％。进一步纯化重组IL-2是利用IL-2的疏水性，经超滤浓缩后利用反相高效液相层析(RP-HPLC)和较高浓度的乙腈(60％)的流动相进行梯度洗脱，从而得到高纯度的IL-2；也可以通过受体亲和层析一步纯化，可得到纯度为95％以上的IL-2。

3．质量检验

IL-2生物活性用3H-TdR掺入法测定。

三、血浆蛋白类

血浆蛋白质类包括白蛋白(Alb)、纤维蛋白溶酶原、血浆纤维结合蛋白(FN)、免疫丙种球蛋白，抗淋巴细胞免疫球蛋白，Veil，s病免疫球蛋白，抗-D免疫球蛋白，抗-HBs免疫球蛋白，抗血友病球蛋白，纤维蛋白原(Fg)，抗凝血酶Ⅲ，凝血因子Ⅷ，凝血因子Ⅸ等。不同物种间的血浆蛋白质存在着种属差异，虽然动物血与人血的蛋白质结构非常相似，但不能用于人体。

（一）白蛋白

（1）结构和性质

白蛋白又称清蛋白，是人血浆中含量最高的蛋白质，约占总蛋白的55％，对人没有抗原性。白蛋白为单链，由584个氨基酸残基组成，N-末端是天冬氨酸，C-末端为亮氨酸，相对分子质量为65000，pI值为4.7，沉降系数S20,w 4.6，电泳迁移率5.92。可溶于水和半饱和的硫酸铵溶液中，一般在饱和度为60％以上的硫酸铵析出沉淀。对酸较稳定，受热后聚合变性，但仍较其它血浆蛋白质耐热。在白蛋白溶液中加入氯化钠或脂肪酸的盐，能提高蛋白的热稳定性，利用这种性质，可使白蛋白与其它蛋白质分离。

从人血浆中分离的白蛋白有两种制品：一种是从健康人血浆中分离制得的，称人血清 284

白蛋白；另一种是从健康产妇胎盘血中分离制得的，称胎盘血白蛋白。

同种白蛋白制品无抗原性，主要功能是维持血浆胶体渗透压。在临床上用于失血性休克、严重烧伤、低蛋白血症等的治疗。

（2）生产工艺

工艺路线如图11-10所示。

工艺流程：

① 络合 将人血浆放入不锈钢夹层反应罐内，开启搅拌器，碳酸氢钠溶液调节pH 8.6，加入等体积的2％利凡诺溶液，充分搅拌，静臵2～4h，分离上清液与络合沉淀。

② 解离 沉淀加无菌蒸馏水稀释，0.5mol／L HCL调节pH值至弱酸性，加入0.15％～0.2％氯化钠，不断搅拌进行解离。充分解离后，65℃恒温1h，立即用自来水夹层循环冷却。将解离液进行离心，分离液用不锈钢压滤器澄清过滤。

③ 超滤 澄清滤液用超滤器浓缩。

④ 热处理 浓缩液在60℃恒温处理10h，灭活病毒。

⑤ 除菌 以不锈钢压滤器过滤，通过Sartoltis冷灭菌系统除菌。

⑥ 分装 白蛋白含量及全项检查合格后，用自动定量灌注器进行分瓶灌装或冷冻干燥得白蛋白成品。本品分为10％与25％两种蛋白浓度规格。

（3）质量检验 性状呈淡黄色略带黏稠状的澄明液体或白色疏松物体(冻干品)，pH

6.6～7.2；冻干制剂水分含量不超过1％；其纯度为白蛋白含量应占蛋白含量的95％以上；残余硫酸铵含量应不超过0.01％(g／mL)。其它无菌试验、安全试验、毒性试验、热原试验均应符合卫生部白蛋白制造及检定

人血浆供应有限，血液来源中各种传染病病源较多,来自人源血浆的白蛋白在纯化过程

285

中难免将病毒带入最终产品，利用基因重组技术生产白蛋白则可避免病毒感染。重组人血清白蛋白成为一种趋势。

（二）人血丙种免疫球蛋白

（1）结构与性质

人血丙种球蛋白即免疫球蛋白 ( Ig )，是一类主要存在于血浆中、具有抗体活性的糖蛋白，其抗体成分存在于β和r球蛋白部分。具有被动免疫作用。免疫球蛋白约占血浆蛋白总量的20％，除存在于血浆中外，也少量地存在于其他组织液、外分泌液和淋巴细胞的表面。

免疫球蛋白具有被动免疫、被动-自动免疫以及非特异性。在临床上可用于预防流行性疾病如病毒性肝炎、脊髓灰质炎、风疹、水痘和丙种球蛋白缺乏症。

（2）生产流程

生产流程线如图11-11所示。

（3）生产工艺

① 络合 人血浆放入不锈钢夹层反应罐内，开启搅拌器，碳酸钠溶液调节pH 8.6，加入等体积2 ％利凡诺溶液，充分搅拌，静臵2～4h，分离上清液与络合沉淀。

② 盐析 取上清部分，在不锈钢反应罐中开启搅拌器，并以lmol／L盐酸调pH 7.0，加23％结晶硫酸铵，充分搅拌后沉淀静臵4h以上。

③ 离心 吸去清液，将下部混浊液泵入离心机中离心，得沉淀。

④ 溶解 将沉淀用适量无热原蒸馏水稀释溶解。

⑤ 层析 通过DEAE-Sepharose CL-6B柱层析。

⑥ 除菌 收集层析液，再通过Sartolis冷灭菌系统除菌。

286

⑦ 分装 丙种球蛋含量及全项检查合格后，分装，即得人血丙种球蛋白成品。分装的产品内含适宜的防腐剂。有蛋白浓度5％与10％两种规格。

（3）人血丙种球蛋白的质量检验 性状呈无色或淡褐色的澄明液体，微带乳光但不应含有异物或凝结的沉淀，pH 6.6～7.4；制品中丙种球蛋白含量应占蛋白质含量的95％以上；在57℃加热4h不出现结冻现象或絮状物；防腐剂含量、固体总量、残余硫酸铵含量及无菌试验、防腐剂试验、安全试验、热原试验应符合规格。

第二节 多肽类药物生产工艺

多肽类药物也是生化药物中非常活跃的一个领域，1953年人工合成了第一个有生物活性的多肽——催产素，1965年中国科学家首次人工合了牛胰岛素结晶。20世纪70年代，神经肽和肠胃道激素的研究进入高潮，并随着生物技术的发展，开拓了多肽药物的新领域——细胞生长因子，由于细胞生长调节因子具有高活性、低免疫原性和人体可耐受剂量大等特点，其生产和应用研究发展得十分迅速，现已发现的细胞生长调节因子近100种，据预测21世纪生化药物的发展将由细胞生长调节因子独领风骚。

一、 多肽类药物的分类

多肽类药物是以多肽激素和多肽细胞生长调节因子为主的一大类内源性活性成分，主要有多肽激素、多肽类细胞生长调节因子和含有多肽成分的组织制剂。已应用于临床的多肽激素药物达20种以上，如催产素(9肽)、加压素(9肽)、促皮质素ACTH(39肽)、胰高血糖素(29肽)、降钙素(32肽)等。

细胞生长调节因子常称为生长因子(growth factor)，是在体内和体外对效应细胞的生长、增殖和分化起调控作用的一类物质，包括细胞生长抑制因子和细胞生长刺激因子。已发现的细胞生长因子大多是多肽或蛋白质。如神经生长因子(NGF)、表皮生长因子(EGF)、集落细胞刺激因子(CSF)、红细胞生成素(EPO)以及淋巴细胞生长因子：白介素-1、白介素-2、白介素-3。许多生长因子在靶细胞上有特异性受体，它们不是细胞生长的营养成分，而是一 287

类分泌性、可溶性介质，仅微量就具有较强的生物活性。

1．多肽激素类

多肽激素主要包括垂体多肽激素、下丘脑多肽激素、甲状腺多肽激素、胰岛多肽激素、肠胃道多肽激素和胸腺多肽激素等。

(1) 垂体多肽激素 促皮质素(ACTH)，促黑激素(MSH)，脂肪水解激素(LPH)、 催产素(OT)等。

(2) 下丘脑多肽激素 促甲状腺激素释放激素(TRH)，生长素抑制激素(GRIF)，促性腺激素释放激素(LHRH)等。

(3) 甲状腺多肽激素 甲状旁腺激素(PTH)，降钙素(CT)等。

(4) 胰岛多肽激素 胰高血糖素，胰解痉多肽。

(5) 肠胃道多肽激素 胃泌素，肠泌素，肠血管活性肽(VIP)，抑胃肽(GIP)，缓激肽，SP物质等。

(6) 胸腺多肽激素 胸腺素，胸腺肽，胸腺血清因子等。

2．多肽类细胞生长调节因子

如表皮生长因子(EGF)，转移因子(TF)，心钠素(ANP)等。

3. 含有多肽成分的生化药物

谷胱甘肽，眼生素，血活素，氨肽素，蜂毒，蛇毒，胚胎素，助应素，花粉提取物，肝水解物等。

二、多肽类药物的制备

多肽类药物的生产方法主要有：生化提取法、微生物发酵法和利用基因工程构建工程菌生产。20世纪70年代以后，人们利用基因工程技术生产了许多重要的多肽，已实现工业化生产的产品有胰岛素、干扰素、白细胞介素、生长素等，现正逐步由生化提取法转变为采用转基因动、植物细胞发酵法生产。

288

(一) 多肽激素类

1.胸腺激素（thymushormones）

胸腺是一个激素分泌器官，对免疫功能有多方面的影响，如某些免疫缺陷病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤以及老年性退化性病变都与胸腺功能的减退及血中胸腺激素水平的降低有关。胸腺依赖性的淋巴细胞群——T细胞直接参与机体有关免疫反应。胸腺对T细胞发育的控制，主要是通过胸腺所产生的一系列胸腺激素促使T细胞的前身细胞——前T细胞分化、增殖、成熟为T细胞的各种功能亚群，由此控制、调节免疫反应的质与量。目前，国内外关于胸腺激素的制剂已有多种，其中一些重要的胸腺激素制剂如胸腺素组分5，是一族酸性多肽，分子量为1000～15000；胸腺素α1是28个氨基酸残基的多肽，分子量3108，pI=4.2。胸腺激素制剂的生物学功能与调节免疫功能有关。

下面介绍其中的胸腺素的生产：

（1）结构与性质

胸腺素是由几十种多肽组成的混合物，相对分子质量在1万以下，等电点在3.5～9.5之间；具有免疫活性；胸腺素对热稳定，短时间内加热至80℃，其生物活性不降低。

临床用于以下方面：（1）原发性和继发性免疫缺陷病，如反复上呼吸道感染等；（2）自身免疫病，如肝炎、肾病、红斑狼疮、类风湿关节炎、重症肌无力等；（3）变态反应性疾病，如支气管哮喘等；（4）细胞免疫功能减退的中年人和老年人疾病，并可抗衰老；（5）肿瘤的辅助治疗。

（2）生产工艺

1966年Goldstein等首次报道从小牛胸腺中提取了部分纯化的胸腺素(thymosin)，1972年进一步纯化分离得到一组具有免疫活性的多肽，称胸腺素F5（即从小牛胸腺提取得到的第5种组分），在胸腺激素的制剂中，F5的理论基础和临床应用的研究最多。1977年Goldstein等从F5中分离出胸腺素α1为含有28个氨基酸残基的肽，其活性比F5高。下面是提取法生 289

产胸腺素。工艺路线如图11-12所示。

图11-12 胸腺素生产的工艺路线

工艺过程如下：

① 预处理 将新鲜或冷冻胸腺除脂肪，绞碎。

② 提取 用生理盐水洗涤胸腺2次，再加入3倍量的生理盐水，于组织捣碎机中制成匀浆，14000×g离心，得提取液。

③ 除去杂蛋白 将提取液80℃加热15min，沉淀对热不稳定部分，1500×g离心，取上清液。

④ 丙酮沉淀 上清液冷至4℃，加入5倍体积的冷丙酮（-10℃），过滤，收集沉淀，干燥得丙酮粉。

⑤ 盐析 将丙酮粉溶于pH 7.0磷酸盐缓冲溶液中，加硫酸铵至饱和度为0.25，离心去除沉淀，再用乙酸将上清液调pH值为4.0，加硫酸铵至饱和度为0.50进行盐析，收集盐析物。

⑥ 纯化 将盐析物溶于pH 7.2的10mmol／L Tris-HCl缓冲液中，上DEAE-Sephadex A50 凝胶柱(118 cm ×100 cm) 收集主峰，经Sephadex G-25 脱盐，溶解在0.12 mol/ L的乙腈溶液中，上PepMap C18柱(118 cm ×100 cm) 进行磷酸梯度层析，收集主峰，冷冻干燥得胸腺素(组分5)。

⑦ 活力检测 采用E-玫瑰花环形成试验，按全量法花环形成试验进行，然后按常规固定染色、镜检200个淋巴细胞，每个淋巴细胞3个或3个以上红细胞为一个E-玫瑰花结。E-玫瑰花结升高百分数不得低于10％；相对分子质量15 000以下。

2．肠胃道激素

290

以SP 物质为例说明其生产：

（1）结构与性质

SP物质是以猪、牛等为原料提取或化学合成的由11个氨基酸组成的多肽，其N端第一位氨基酸为精氨酸。呈淡黄色的粉末，易吸潮，溶于水、甲醇、乙醇，不溶于乙醚。酸性条件下稳定，碱性条件下易逐步失活。

国内外对SP的研究十分活跃，SP具有多种生理和药理作用，可以降低血压扩张血管、增加兔心血冠脉灌流量、镇静、止痛等作用。现研究将SP制成脑素软膏和将其添加到化妆品中制成止痒宁露水。

（2）生产工艺

采用提取法获得SP。SP能在乙醇中溶解，而其它的蛋白质、大肽段在高浓度的乙醇中沉淀析出，SP又在乙醚的溶解度极小从而析出，利用此性质可以提取SP物质，工艺路线如图11-13所示。

图11-13 SP物质生产的工艺路线

工艺流程如下：

① 预处理 处死动物，立即取脑，速冻，-20℃保存备用。用蒸馏水冲洗数次，绞肉机中绞碎制成脑浆。

② 水浸提 将脑浆移入不锈钢锅中，加3倍量的水，搅拌浸提2h，离心（10000r/min），

291

30min,收集上清液。

③ 沉淀 将上清液臵于搪瓷罐中，边搅拌边加入2倍量的乙醇（95％），静臵1h，过滤，弃去沉淀，收集滤液。

④ 盐析 将滤液臵于搪瓷罐中，加入硫酸氨，盐析，过夜，过滤，收集盐析物。 ⑤ 溶解 将上述盐析物臵于不锈钢桶中，边搅拌边加入5倍量的冰醋酸，搅拌4h，离心，得滤液，滤渣再加入冰醋酸，过滤，得滤液，混合两次所得滤液。

⑥ 乙醇沉淀 将上述滤液臵于搪瓷罐中，加入2倍体积的无水乙醇，搅拌均匀，静臵4h，过滤，弃去沉淀，收集滤液。

⑦ 乙醚沉淀 将滤液臵于搪瓷罐中，加入4倍量的乙醚，-4℃过夜，过滤，收集沉淀，沉淀物用乙醚洗涤数次，低温真空干燥，得SP精品。

此法的提取率4％～5％。

3．垂体多肽激素

垂体包括腺垂体和神经垂体，可分泌多种激素。下面介绍促皮质素(Adrenocorticotropic hormone，ACTH)的生产：

（1）结构与性质

促皮质素是一种从腺垂体前叶提取的多肽激素，由39个氨基酸组成，种属差异表现在第25～33位上，易溶于水，等电点为6，在干燥和酸性溶液中较稳定，在碱性溶液中易失活；溶于70％的丙酮和乙醇中。

促皮质素能维持肾上腺皮质的正常功能，促进皮质激素的合成和分泌，所以临床上可将其作为诊断垂体和肾上腺功能的药物，还用于胶原病、过敏症等。

(２) 生产工艺

ACTH生产有两种方法，一种是CMC提取法，效价不低于45U/㎎；另一种是酸丙酮法，效价不高于3U/㎎。CMC提取法的工艺流程如图11-14所示。

292

图11-14 ACTH生产的工艺路线

工艺过程如下：

① 预处理 将新鲜猪脑垂体投入丙酮中，浸泡24 h后更换新丙酮，重复3次以上，至垂体变硬为止，剥离垂体，取前叶，臵不锈钢锅中干燥，磨碎，过40目筛，得垂体前叶干粉，含水量低于6％。

② 提取 加垂体前叶干粉20倍的加0.5mol／L醋酸，硫酸调节pH 2.0～2.4，70～75℃保温10min，速冷至-20℃以下，加入用0. 5mol／L醋酸浸泡过夜的硅硅藻土（200g）过滤，滤渣再按上法处理后过滤，合并滤液，冷藏保存。

③ 吸附 调提取液pH为3.1，加40mL聚山梨醇80和投料量20％的CMC(2.2mg当量)，3℃搅拌使其吸附12h，过滤。

④ 解吸 用0.15mol／L的盐酸解吸吸附CMC，收集解吸液，再通过717阴离子交换树脂，过滤，收集洗脱液，调节pH 3.1。

⑤ 二次吸附 加入聚山梨醇和CMC对洗脱液进行二次吸附，1～5℃搅拌使其吸附12h，过滤，收集CMC。

⑥ 二次洗脱 用0.1mol／L醋酸、蒸馏水、0.01mol／L醋酸铵(pH 4.6) 、0.1mol／L醋酸铵(pH 6.7)对CMC依次洗涤，然后用0.15mol／L盐酸解吸。解吸液再通过717阴离子交换树脂及732阳离子交换树脂，收集洗脱液，调节pH 3.1。

⑦ 干燥 冷冻干燥洗脱液，得ACTH，效价在45U／mg以上。

ACTH冻干制剂有每瓶25U、50U两种规格。还可制成促皮质素锌注射液，为长效制剂。合成的促皮质素类似物有促皮质18肽、24肽、25肽及28肽等。

（３）检验方法

ACTH粗品为1U/mg以上，用小白鼠胸腺萎缩法测定；ACTH精品为45U/ mg以上，

293

用去垂体大白鼠的肾上腺维生素C降低法测定。在进行效价测定时均有自己的标准品，不能互相取代。

在生产中，要求CMC的交换容量要大，并采用二氯醋酸和二氯丙醇为交联剂，避免其胶化；CMC可以再生，通过蒸馏水、盐酸、乙醇多次洗涤、干燥可重复利用。

4. 甲状腺多肽激素

甲状腺多肽激素的生产以降钙素(calcitontion，CT)为例:

（1）结构与性质

降钙素是一种调节血钙浓度的多肽激素，由甲状腺内的滤泡旁细胞（C细胞）合成和分泌，由32个氨基酸残基组成的单链多肽，可减低血浆中钙、磷浓度，抑制钙、磷的吸收。降钙素溶于水和碱性溶液，不溶于丙酮、乙醇、乙醚等有机溶剂，难溶于有机酸临床上用于治疗高血钙症、变形性骨炎、高磷酸盐血症，还可作为某些恶性肿瘤病的诊断用药，是重要的生化药物之一。

（2）生产工艺

降钙素的生产有提取法，化学合成法和基因工程法。提取法生产降钙素的原料主要有猪甲状腺和鲑、鳗的心脏或心包膜等，工艺路线如图11-15所示。

脱脂

提取 沉淀 抽提 醋酸-水 图11-15 降钙素的生产工艺路线

工艺过程如下：

① 预处理 猪甲状腺经脱脂后绞碎，匀浆。

② 提取 加入4倍量的提取溶剂，丙酮∶乙醇为：0.lmol／L的盐酸（3∶1∶1），加亚硫酸氢钠（1g／mL），4℃搅拌8h以上，离心，取上清液，用NaOH调pH为3，加5倍

294

量冷丙酮，沉淀。

③ 抽提 加入0.lmol／L盐酸溶解沉淀，过滤，取上清夜。

④ 盐析 在上清液中加入异戊醇-醋酸-水(20∶32∶48)的混合液，搅匀，加热至50℃，用硅藻土作助滤剂过滤，收集沉淀。

⑤ 浸提 将沉淀溶于0.3mol／L氯化钠溶液，用盐酸调节pH为2.5，离心，收集离心液。

⑥ 吸附、解析 将离心液用10倍水稀释后，通过CMC(5×50cm)柱，柱先用0.02mol／L醋酸盐缓冲液(pH 4.5)平衡。收集含有降钙素的溶液。

⑦ 干燥 冻干制得降钙素粉末，含量为3.6U／mg。

生物活性测定：按照英国药典（1988年版），用含0.25％白蛋白的生理盐水（经加热灭活）溶解PCT第I、II峰终产品，最终浓度为1μg/μl。选用雄性大白鼠，静脉注射后1h从内眦和心内穿刺取血。血样品的血清钙值采用原子吸收光谱法测定，对照采用从猪甲状腺中提取的MRC标准品。第一次国际卫生组织专业会议确定的降钙素标准品为猪200U／mg、鲑2700U／mg。

20世纪90年代末，中国开始了基因工程降钙素的研究，目前常用的表达系统主要有大肠杆菌、乳酸杆菌、毕赤酵母、昆虫杆状病毒和植物，存在的主要问题是降钙素的表达系统C-末端不能直接酰胺化致使其活性相对不高。

（二）多肽类细胞生长调节因子

1. 转移因子(TF)

（1）结构与性质

转移因子是一种致敏T淋巴细胞中提取，与迟发型超敏反应有关的一种可溶、不耐热、超滤的淋巴因子。它只传递细胞免疫信息，无体液免疫作用，由多核苷酸、多肽组成，无种属特异性，相对分子量小于10KD，不被RNase、DNase、溶菌酶等破坏。不耐热，在56℃ 295

时，30min就失活。耐低温，-20℃保存2年不失活。

TF在临床上已用于治疗乙型肝炎、气管炎、流脑等某些免疫性疾病，用于恶性肿瘤的辅助治疗。

（2）生产工艺

TF的生产原料一般采用正常人血液、脾和扁桃体等，目前正开发利用牛、羊、猪等动物的细胞和组织代替人体的细胞和组织，如人脾转移因子，牛睥转移因子，胎盘转移因子，极大地降低了TF的成本。传统的生产方法通过透析、柱层析，这些方法操作简单，但周期长，不适合工业化大规模的生产，新的生产工艺是加入一种合适的絮凝剂，从而缩短周期，可以大规模进行生产。

工艺路线如图11-16所示。

工艺过程如下：

① 预处理 取新鲜健康、未经免疫的猪脾脏，去脂肪、筋膜等杂质，清水清洗数次。 ② 研磨 将脾脏切细，加入2倍量无菌生理盐水，低温下用胶体磨研磨，使细胞破裂。

③ 提取 将细胞匀浆装入无菌生理盐水瓶中，-30℃下冷冻。37℃下用自来水解融。重复2～3次。

④ 去杂质 在匀浆中加入等体积的生理盐水，搅拌均匀加入助滤剂，用微空过滤器过滤，截流分子质量为5000，滤液中再加入一定配比的絮乳剂和助滤剂，过滤。

⑤ 超滤 将上述滤液通过0.8µm滤膜后，再用截流分子质量为10000的超滤器超滤，获得TF。

2. 表皮细胞生长因子(EGF)

1959年Cohen等发现小鼠颌下腺提取物能使新生小鼠提前开眼和门齿早萌的活性物

296

质，1962年从中提取出能直接刺激表皮的生长和角化的多肽，命名为表皮生长因子。

（1）结构与性质

表皮生长因子是一种低分子量、对热稳定和难透析的多肽，不易被胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶消化。目前已基本明确小鼠EGF(mEGF)和人的EGF(hEGF)的分子结构，活性部分为单链多肽，二硫键为其生物活性所必需，活性中心位于48～53个氨残基之间。mEGF和hEGF相比，理化特性及氨基酸序列极其相似，但不完全相同。EGF分子量为6.05KD，等电点pH 4.6，hEGF分子量为6.2KD，等电点pH 4.5，在pH 9.5的聚丙烯酰胺凝胶电泳中，hEGF的泳动速度略快于mEGF；pH 2.3时两者电泳速度相同。它是耐热、不能透析的水溶性单链多肽，没有α螺旋，有25％β螺旋，是个较稳定的蛋白质，在-20℃可长期保存。消光系数(E1%，280nm)为30.9，沉降常数1.25S。

EGF能促进细胞的增殖，其增殖刺激作用不限于上皮细胞，而是广谱的；能增加体内物质的转运和糖代谢如K+、脱氧葡萄糖等的输送作用；能激活磷脂酶A，可以增加前列腺素的合成和释放；能促进磷脂酰肌醇的代谢； EGF能促进伤口愈合，临床应用于口腔科的溃疡、糜烂、烫伤、烧伤等的治疗等。

（2）生产工艺

EGF在体内的分布是不均一的，雄鼠颌下腺的mEGF含量比雌鼠多。相同部位，小鼠的EGF含量高于人的含量。提取颌下腺EGF的工艺路线如图11-17所示。

图11-17 EGF的生产工路艺线

工艺过程：

① 预处理 取颌下腺，除脂肪和筋膜，以绞肉机绞碎。

② 提取 在颌下腺糜中加入0.05mol／L的HAc溶液，充分搅拌，离心，取上清夜。 297

③ 吸附、洗脱 第一次通过CMC吸附，pH 3.9的缓冲液洗去杂蛋白，用pH7.0的缓冲溶液洗脱；第二次通过DEAE吸附，以pH7.0的缓冲液洗杂蛋白，用0.2mol／L的 HCL和NaCL洗脱。

④ 冻干 将洗脱液冻干得冻干粉。

⑤ 精制 将冻干粉溶解上Sephadex G75柱，收集流出液，得表皮生长因子精品，冻干保存。

（3）生物活性的测定

采用3H-TdR标记同位素法或者结晶紫比色法测定。体外培养EGF 30h后，再加入

3H-TdR培养18 h, 然后用生理盐水淋洗细胞并收集于醋酸纤维膜上烤干, 测定其放射性活度。

该法生产EGF简单、纯度高。也可以人尿为原料，采用McAb亲和层析、乙醇分级沉淀相结合的方法，但产量低。我国应用DNA重组技术已将hEGF基因嵌入大肠杆菌中并表达成功，制得基因工程药物hEGF，结构与功能同天然药物完全一致。生产工艺简易、高效，已达世界水平。

（三）谷胱甘肽（GSH）

（1）结构与性质

谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成的活性三肽，分子量307.2，氮量13.67，硫量10.44，旋光度α =21.3（27℃，2％水溶液）。广泛存在于动物肝脏、血液、酵母和小麦胚芽中，各种蔬菜等植物组织中也有少量分布，是最主要的非蛋白巯基化合物，分为还原型(GSH)和氧化型(GSHG)两种，在生物体内大量存在并起主要作用的是还原型谷胱甘肽(GSH)。

谷胱甘肽具有重要的生物学功能，可以保护生物体内蛋白质巯基从而维护了蛋白质的正常生物活性；同时它又是多种酶的辅酶和辅基；可以清除自由基，减毒，参与氨基酸的 298

吸收与转运、促进铁质吸收及维持红细胞膜的完整性，维持DNA的生物合成，细胞的生长及细胞免疫等多种功能。

目前，人工已研制开发出了谷胱甘肽药物，广泛应用于临床，利用其巯基以螯合重金属、氟化物、芥子气等毒素，还用于肝脏疾病、肿瘤、溶血性疾病以及角膜炎、辐射防护、白内障疾病等的辅助治疗，此外，谷胱甘肽作为生物活性添加剂及抗氧化剂，在食品和化妆品领域中的应用也越来越广。

（2）生产工艺

谷胱甘肽的生产方法主要有溶剂萃取法、化学合成法、微生物发酵法和酶合成法等4种，其中发酵法是生产谷胱甘肽最具潜力的方法，目前即以酵母发酵法生产为主。生产路线如图11-18所示。

工艺过程如下：

Ⅰ. 菌种活化

将酵母斜面菌种接种到250mL装有合成培养基的三角瓶中，臵于摇床培养24h，28～30℃，然后转接到3000mL装有合成培养基的三角瓶中，臵于28～30℃的摇床上培养24h。

Ⅱ. 菌种扩大培养

299

将上述培养液转到300L装有合成培养基的种母罐中，30～32℃的条件下培养24h，再将300L种母罐的培养液转接到3000L种母罐中，30～32℃的条件下培养24h，再将3000L种母罐的培养液转接到7000L种母罐中，30～32℃的条件下培养24h。

Ⅲ. 发酵培养

① 发酵 将以上7000L种母罐的培养液转接到50 000L装有发酵培养基的发酵罐中，在30～32℃的条件下培养39h，即得发酵培养液。

② 收集酵母菌体 将发酵培养液3000r/min离心, 收集酵母菌体，臵冰箱过夜。

③ 提取 将过夜的酵母菌体臵于不锈钢锅中，加水，密闭，煮沸10min，速冷，过滤，收集滤液。

④ 沉淀 将滤液臵于不锈钢锅中，边搅拌边加0.5mol/L硫酸调节pH。加热至40℃时，边搅拌边加入氧化亚铜的水浊液，静臵20min，过滤，用0.5mol/L硫酸和蒸馏水洗涤，收集谷胱甘肽铜盐沉淀。

⑤ 提纯 将上述沉淀臵于不锈钢锅中，用硫化氢分解铜盐，过滤，通入氮气，除去滤液中的硫化氢，得无硫化氢的谷胱甘肽液体，加入溶液体积10倍量的冷丙酮以沉淀。另一种纯化方法是离子交换法，可以采用732阳离子交换树脂洗脱获得纯化的GSH。

⑥ 干燥 将沉淀臵于干燥器中干燥，得成品。

谷胱甘肽作为一种生物药物，应用前景广阔，市场需求量日渐增大，为提高发酵法生产谷胱甘肽的产量，还需解决以下几方面的问题：(1)选育谷胱甘肽高产菌株，提高谷胱甘肽合成酶系的表达水平，并使之在胞外大量积累；(2) 谷胱甘肽的合成需要ATP参与，而在反应体系中直接添加ATP是经济上所不允许的，构建一个高效的ATP再生系统，提高谷胱甘肽生物合成系统的运行效率与经济性；(3)充分发挥固定化细胞技术的潜力，实现谷胱甘肽的连续生产。

思 考 题

300

1. 简述基因工程技术生产人生长素最新研究进展。

2. 论述白细胞介素-2的生产方法。

2. 简述多肽类药物的分类及其主要的生产方法。

3. 谷胱甘肽的性质有哪些？有哪些生产方法？

4. 简述利用基因工程法生产干扰素的工艺流程。

5. 血浆蛋白类蛋白包括哪些？举例说明其中一种蛋白的工艺路线。

6. 在制备胰岛素时,为提高胰岛素的质量和产量，应注意几个方面的环节?

参 考 文 献

1．郭勇. 生物制药技术.北京：中国轻工业出版社，2000.1

2．辛秀兰. 现代生物制药工艺学.北京：化学工业出版社，2006.8

3．梁世中. 生物制药理论与实践.北京：化学工业出版社，2005.6

4．齐香君. 现代生物制药工艺学.北京：化学工业出版社，2004.1

5．吴梧桐. 生物制药工艺学. 北京：中国医药科技出版社，2005.8

6．元英进等. 现代生物制药工艺学.北京：化学工业出版社，2004.7

7．陈来同等. 生物化学产品制备技术.北京：科学技术文献出版社，2004.1

8. 李元，陈松森,王渭池主编.基因工程药物.北京：化学工业出版社，2007.7

9.易巧，宋小双，朱祥伟，刘堰。毕赤酵母工程菌表达人白细胞介素-2突变体发酵条件的优化。西南大学学报(自然科学版), 2008，（01）：85-90

10．许旭云,徐金宝。提高重组人白细胞介素-2 得率的研究。中国生化药物杂志，2005，26

（2）：111-112

11．李晓红，朱惠玲，余蓉，李红霞。重组人胰岛素制备工艺。四川大学学报(工程科学版)，

2007，39（4）：79-83

12．任玉莹，范泉水，邱薇，等。基因工程犬干扰素α的制备及纯化工艺。生物技术通讯 301

2009．01

2

302