细菌药敏试验

实训 细菌的药物敏感性试验

教学目标

使学生掌握细菌药物敏感性试验的操作方法，能够利用本试验方法选择敏感药物治疗兽医临床常见的细菌性传染病。

材料准备

1．器材：温箱、天平、打孔机、滤纸、无菌试管及吸管、镊子、接种环、酒精灯等。

2．试剂：蒸馏水。

3．培养基：普通琼脂平板。

4．菌种：金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的固体培养物。 5．药品：链霉素、金霉素、新霉素、红霉素等抗菌药物。

6．硫酸钡标准管：取1%~1.5%氯化钡0.5ml加1%硫酸溶液99.5ml，充分混匀即成，用前充分振荡。

方法步骤

将抗菌药物置于接种待检菌的固体培养基上，抗菌药物通过向培养基内的扩散，抑制敏感细菌的生长，从而出现抑菌环。由于药物扩散的距离越远，达到该距离的药物浓度越低，由此可根据抑菌环的大小，判定细菌对药物的敏感度。

（一）含药纸片的制备

1．滤纸片 最好选用新华1号定性滤纸，用打孔机打成直径6mm的滤纸片，放在小瓶中或平皿中，在121.3℃灭菌15min，再置100℃干燥箱内烘干备用。

2．药液的配制 用无菌蒸馏水将各药稀释成以下浓度：磺胺100mg/ml、青霉素100IU/ml、 链霉素、金霉素、新霉素、红霉素、多粘菌素1000μg/ml。

3．含药纸片的制备 将灭菌的滤纸片用无菌的镊子摊布于灭菌平皿中，按每张滤纸片饱和吸水量为0.01ml计算，50张滤纸片加入药液0.5ml。要不时翻动，使纸片充分吸收药液，浸泡1~2h后于37℃温箱中烘干备用。对青霉素、金霉素纸片的干燥宜采用低温真空干燥法，干燥后立即放入瓶中加塞，放干燥器内或置-20℃冰箱中保存。纸片的有效期一般为4~6个月。

（二）测验方法 1．钩取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌落各4~5个，分别接种于肉汤培养基中，37℃培养4~6h。

2．用灭菌生理盐水稀释培养菌液，使其浊度相当于硫酸钡标准管。装有以上两种成分的试管须相同，硫酸钡应用前需充分振动。

3．用无菌棉拭子蘸取上述肉汤培养液，在试管壁上挤压除去多余的液体，在琼脂培养基表面均匀涂抹。每种细菌分别接种1~2个琼脂平板。

4．用玻璃铅笔在平皿底部标记药物名称。一个直径9cm的平皿最多只能贴7张纸片，6张均匀的贴在距平皿边缘15mm处，一张位于中心。

5．用灭菌镊子夹取干燥含药纸片，按标记位置轻贴在已接种细菌的琼脂培养基表面，一次放好，不得移动。

6．37℃温箱中培养16~18h，观察、记录并分析结果。根据抑菌环直径的大小按实表2标准判定各种药物的敏感度。

实表1 细菌对不同抗菌药物敏感度标准

对于复方药物可通过比较各药物抑菌环直径的大小，在试验用药中选出最敏感的药物。

注意事项

1．接种菌液的浓度必须标准化，一般以细菌在琼脂平板上生长一定时间后呈融合状态为标准。如菌液浓度过大，会使抑菌环减小；浓度过小，会使抑菌环增大。

2．接种后应及时贴上含药纸片并放入37℃温箱中培养。

3．培养时间一般为16~18h，结果判定不宜过早，但培养过久，细菌可能恢复生长，使抑菌环缩小。

4．实验过程中要防止污染抗生素，否则可发生抑菌环缩小或无抑菌环现象 5．因蛋白胨可使磺胺失去作用，故磺胺类药物应采用无胨琼脂。 附：无胨琼脂的配制方法

牛肉膏或酵母浸膏 5.0g 氯化钠 5.0g 琼脂 25g 水 1000ml

将牛肉膏或酵母浸膏、氯化钠和水混合后加热溶解，测定并矫正PH为7.2~7.4，过滤后加入琼脂，煮沸使琼脂充分溶化，121.3℃高压蒸气灭菌15min，分装平皿，静置冷却即成琼脂平板。

第一天：

操作程序：

1、制备含药纸片：

（1）打孔机打出定量（20、30或50片）纸片，置于平皿内。 （2）纸片高压蒸汽灭菌器内灭菌，121.3℃高压蒸气灭菌15min。 （3）灭菌后纸片置于100℃干燥箱内烘干。 2、培养基准备

（1）营养琼脂：

①称取4.5克营养琼脂粉，加水100ML，微波炉中溶解后，置于高压蒸汽灭菌器内灭菌121.3℃高压蒸气灭菌15min。

②灭菌后取出，倒板（倒入直径90ｍｍ灭菌平皿内，厚度2－3ｍｍ），室温下静止，凝固后备用。

（2）营养肉汤

①称取营养肉汤粉定量，加水，微波炉中溶解，调节PH至7.2－7.6，分装试管（装量为试管高度1／3）高压蒸汽灭菌。

（以上操作中三处高压蒸汽灭菌可放一起完成） 3、菌种准备

（1）金黄色葡萄球菌： （2）大肠杆菌

第二天：

4．药液稀释：

（1）用无菌蒸馏水或生理盐水将各药稀释成以下浓度： 青霉素：杀革兰氏阳性球菌（实验用金黄色葡萄球菌），青霉素稀释成100IU/ml。

庆大霉素：杀革兰氏阴性菌（实验用大肠杆菌），庆大霉素稀释成1ｍｇ/ml。 环丙沙星：广谱抗菌素。环丙沙星稀释成1ｍｇ/ml。 5．本实验

（1）用无菌棉拭子蘸取上述肉汤培养液，在试管壁上挤压除去多余的液体，在琼脂培养基表面均匀涂抹。每种细菌分别接种1~2个琼脂平板。

（2）用玻璃铅笔在平皿底部标记药物名称。一个直径9cm的平皿最多只能贴7张纸片，6张均匀的贴在距平皿边缘15mm处，一张位于中心。

（3）用灭菌镊子夹取干燥含药纸片，按标记位置轻贴在已接种细菌的琼脂培养基表面，一次放好，不得移动。

（4）37℃温箱中培养16~18h，观察、记录并分析结果。根据抑菌环直径的大小按标准判定各种药物的敏感度。