免疫组化技术(原理.分类.步骤及主要试剂.设备准备)
免疫组化技术
原理
抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。
众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原 - 一抗 - 二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
分类（常用）
1、免疫荧光方法
最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。
2、免疫酶标方法
免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种标记方法，目前在病理诊断中广为使用的当属PAP法（过氧化物酶-抗过氧化物酶）、ABC法（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物）、SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶）、即用型二步法（聚合物链接）等。
3、免疫胶体金技术
免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。
4、免疫铁蛋白法
5、放射免疫自显影法
标本
1、组织标本：石蜡切片（病理切片和组织芯片）、冰冻切片
2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片
操作步骤
①石蜡切片制作
1、固定：取组织，用PBS冲洗，放入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液内固定12h
2、脱水：倒去固定液，用蒸馏水冲洗3次，再用50%酒精冲洗2次，用酒精逐级脱水，70%酒精1天，80%酒精过夜，95%酒精3h，无水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各2h
3、透明：1:1无水酒精二甲苯45min，二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ）各30min
4、包埋：（恒温箱内进行）浸入石蜡，1:1二甲苯石蜡（58℃）45min，石蜡（Ⅰ）、（Ⅱ）、（Ⅲ）共2.5h，用石蜡（Ⅲ）包埋组织
5、切片：包埋后的组织块经修整后，用切片机切成5-7μm，的石蜡带
6、贴片：将组织石蜡块在50℃温水中展片，然后用处理干净的载玻片捞片，组织带可黏在载玻片上
（洗片：1%HCl浸泡过夜、蒸馏水冲洗、95%酒精浸泡2h后擦干 → 涂胶：防脱剂多聚赖氨酸）
7、烤片：68℃恒温箱内烤片2h
②SP三步法
1、脱蜡：脱蜡前应将组织芯片在室温中放臵60min，或60℃恒温箱中烘烤20min，后用二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ）浸泡，共25min
2、水化：无水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各2min，下行至95%、80%、70%酒精（Ⅰ）（Ⅱ）各2min
3、PBS冲洗2-3次，每次5min
4、阻断：3%H2O2去离子水（或80%甲醇）孵育10min，以灭活内源性过氧化物酶活性
5、PBS冲洗2-3次，每次5min
6、抗原修复：臵0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0）中用煮沸（95℃，15-20min），自然冷却20min以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温
7、PBS冲洗2-3次，每次5min
8、封闭：滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育20min，甩去多余液体
9、滴加Ⅰ抗50μl，室温静臵1h，或者37℃1h，或者4℃过夜（需在37℃复温45min）
10、PBS冲洗2-3次，每次5min
11、滴加辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗40～50μl，室温静臵1h，或37℃1h
12、PBS冲洗2-3次，每次5min
13、滴加SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室温或37℃孵育30min-1h
14、PBS冲洗2-3次，每次5min
15、显色：DAB显色5-10min，在显微镜下掌握染色程度（胞浆呈棕色者判定为阳性细胞）
（显色剂的配臵：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B，摇匀，再加1滴显色剂C，摇匀）
（A：DAB B：H2O2 C：磷酸缓冲液）
16、自来水冲洗10分钟终止反应
17、复染：苏木精复染2min，盐酸酒精分化
18、自来水冲洗10-15min
19、常规脱水、透明、封片（用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上）、镜检
试剂、设备：
1、PBS：0.01M磷酸盐缓冲液 (pH7.4)
配制 -- 取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4•12H2O 3.63g或Na2HPO4 1.44g， KH2PO4 0.24g，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至
7.4，加水定容至1L，常温保存备用。
2、固定液：4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液(pH7.4)
配制 – a.0.1M磷酸盐缓冲液：取A液400ml与B液80ml混合后，调pH于7.4，再定容至500ml
A液：0.1mol/L Na2HPO4（Na2HPO4•12H2O 35.8g加水定容至1000ml）
B液：0.1mol/L NaH2PO4（NaH2PO4•2H2O 15.6g加水定容至1000ml）
b.4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液：取20g多聚甲醛溶于500ml 0.1M磷酸盐缓冲液中，加热并搅拌约2-3h后溶解
3、梯度酒精：100%、95%、80%、70%、50%
4、二甲苯
5、包埋剂：石蜡
6、防脱剂：多聚赖氨酸（PLL5g+蒸馏水1000ml）、APES（3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷）
7、抗原修复液：0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0），或0.01M柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）
配制 -- 取A液8ml与B液42ml混合后加水至400ml，调pH于6.0，再定容至500ml
A液：0.1mol/L 柠檬酸（C6H8O7•H2O 21.01g加水定容至1000ml）
B液：0.1mol/L 柠檬酸钠（Na3C6H5O7•2H2O 29.41g加水定容至1000ml）
8、SP超敏免疫组化试剂盒（包括试剂A、B、C、D）
试剂A -- 阻断剂：3%甲醇-H2O2溶液（30%H2O2和80%甲醇溶液配制）
试剂B -- 封闭液：正常非免疫动物血清
试剂C -- 二抗（辣根过氧化物酶标记）
试剂D -- SP（链霉亲和素-过氧化物酶）
9、一抗（特异结合底物）
10、显色剂：DAB试剂盒、苏木素染液
11、封固液：中性树胶，或50%缓冲甘油，或液体石蜡等
12、恒温箱（水浴锅）、冰箱、切片机、载玻片和盖玻片、高压锅或微波炉、染色缸、显微镜、计算机图像分析系统
附：EDTA（乙二胺四乙酸）：即依地酸钠钙，是钙离子络合剂、洗涤剂、血液抗凝剂
常用固定液
1、醛类固定剂：作用是使组织之间相互交联，将抗原保存在原位。
（1）3%中性甲醛固定液液：30%甲醛10ml, 0.01mol/L PH 7.4 PBS 90ml
（2）24%多聚甲醛缓冲液：40g多聚甲醛溶于0.1mol/L PBS 500ml，加热 搅拌（注意不要沸腾）至溶液清亮后，室温下冷却后加PBS，使总容量为1000ml
（3）戊二醛－多聚甲醛缓冲液：在上述溶液中加入1％的戊二醛
（4）Bouin液：40％甲醛250ml，冰醋酸50ml,饱和苦味酸750ml.
（5）PLP液 (过碘酸－赖氨酸－多聚甲醛固定液)
2、丙酮及醇类固定剂：原理是使组织中的蛋白质和糖类沉淀
（1）AAA液：纯酒精85ml，冰醋酸5ml，浓甲醛10ml
（2）Clzrke液：纯酒精95ml，冰醋酸5ml 多用于冰冻切片的后固定
（3）Carnoy液：纯酒精60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml，多用于癌基因蛋白，抗癌基因蛋白等抗原的固定保存
（4）丙酮：常用于冰冻切片和细胞涂片的后固定，用前在4℃冰箱预冷，切片在冷丙酮中固定5～10min
3、其他固定剂
（1）Zenker液：适合免疫球蛋白抗原的检测
（2）四氯化锇液：是电镜研究中所必需的固定液
抗原修复
用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片，原因：a.福尔马林固定时，组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成了醛键，使得不少抗原决定簇被封闭；b. 甲醛的聚合作用，使蛋白质分子间相互交联形成大分子网络，也导致了抗原决定簇被掩盖，这就使得相当部分的抗原不能与抗体很好是进行反应。
①抗原热修复
（1）高压热修复：在沸水中加入0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片臵于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，臵入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
（2）煮沸热修复：电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10-15分钟。
（3）微波热修复：在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。
②酶消化法：常用0.1%胰蛋白酶、0.4%胃蛋白酶液、皂素（Saponin）。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5-30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。