氨基酸类物质的紫外

氨基酸类物质的分子荧光光谱分析

一 实验目的

1. 掌握分子荧光和紫外－可见分光光度法的分析原理，了解两者的区别与联系 2．熟悉分子荧光与紫外－可见分光光度计的结构及特点，掌握其使用方法。 3．掌握使用分子荧光和紫外吸收光谱标准曲线法定量测定物质含量的方法。 4. 了解物质分子的组成、结构等对荧光光谱和紫外吸收光谱的影响。

5. 了解分子荧光光谱与紫外－可见分光光度法在定量分析、分子结构分析以及应用范围方面各有哪些特点。

二 实验原理

荧光物质分子吸收了特定频率辐射能量后，由基态跃迁至第一电子激发态（或更高激发态）的任一振动能级，在溶液中这种激发态分子与溶剂分子发生碰撞，以热的形式损失部分能量后，而回到第一电子激发态的最低振动能级（无辐射跃迁）。然后再以辐射形式去活化跃迁到电子基态的任一振动能级，便产生荧光。如图1。

1. 吸收、荧光、磷光能级图

由于无辐射跃迁的几率大，因此分子荧光波长常常比激发光长。激发光源的波长通常是在紫外区，荧光也可能在紫外区，但更多是在可见区。相对于基态和激发态两个最低振动能

图

级之间的跃迁所产生的荧光称为共振荧光，此时吸收光谱与荧光光谱重叠。

荧光的产生是由于物质在吸收了激发光部分能量后发射的波长相同或波长较长的光，因此，根据Lambert-Beer 定律，溶液的荧光强度F 与该溶液吸光的强度以及荧光物质的荧光效率φ(量子产率) 成正比。在稀溶液中：

F ＝2.3K φεb cI0＝2.3K φAI 0 ε—荧光物质的吸光系数

b—液层厚度 I0—入射光强度

K—检测效率（由仪器决定）

C －是样品浓度

当激发光强度一定，且浓度很小时，荧光强度与荧光物质浓度成正比。即F=Kc。此关系只限于极稀溶液，对于较浓的溶液，其吸光度超过0.05时，使荧光物质分子之间以及荧光物质分子同溶剂分子之间的碰撞增加，导致无辐射去活增加而发生自熄灭。

任何荧光物质都具有激发光谱和发射光谱。并且，由于处于基态和激发态的振动能级几乎具有相同的间隔，分子和轨道的对称性都没有改变，荧光化合物的发射光谱和激发光谱形式呈大同小异的“镜像对称”关系。

同一荧光物质的分子荧光光谱曲线的波长范围不因它的激发波长值的改变而位移。由于这一荧光特性，如果固定荧光最大发射波长，然后改变激发波长，从激发光谱中确定最大激发波长。反之，固定最大激发光波波长值，测定不同发射波长时的荧光强度，既得荧光发射光谱曲线和最大荧光发射波长值。

物质是否发生荧光取决于分子的结构。分子必须具有吸收光量子的结构和有一定的荧光量子效率。因此，荧光和物质结构的关系是令人发生兴趣的问题。由于能强烈发射荧光的物质几乎都是通过π→π跃迁过程吸收辐射，因此具有共轭双键、平面结构和稠环结构的

*

π-电子共轭体系的分子有利于发射荧光。在芳香化合物的芳香环上进行不同基团的取代，

对荧光强度和光谱都将产生影响。

三. 实验仪器和试剂

仪器：F-4600分子荧光光度计（FL-SPECTOROPHOTOMET ），50ml 试管，100-1000μL 移液枪。（仪器参数：EX SLIT:2.5nm,EM SLIE 5.0nm, 扫描范围240nm-450nm ） 试剂：不同浓度苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、去离子水

四. 实验步骤

A. 绘制苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸溶液的荧光光谱曲线

1. 打开荧光光度计和计算机，预热，对荧光光度计进行仪器初始化。

2. 选择测量参数。依次在不同的激发波长下扫描发射光谱，通过叠加的谱图确定物质的荧光发射峰。最后确定最大发射波长值。

3. 在确定的最大发射波长下做激发光谱，测量物质的最大激发波长值。 4．记录苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的发射光谱和激发光谱，对比它们的谱图。 B. 绘制标准酪氨酸溶液标准曲线，测量待测样的浓度 1. 配制酪氨酸系列标准溶液，待用。

2. 将仪器软件界面选择到定量测定的状态下，根据A 中测得的酪氨酸水溶液的最大发射波

长和最大激发波长，设定定量测定的参数。 3. 绘制标准曲线。

4．在同样条件下，测量待测样的荧光强度，通过标准曲线，计算待测样浓度。 五. 数据处理与讨论 （一）. 数据处理 1. 不同氨基酸荧光吸收光谱

[**************]0

B

[1**********]

由实验数据可得，色氨酸的最大发射波长为348.8nm ，酪氨酸的最大发射波长为303.6nm ，苯丙氨酸的最大发射波长为281.6nm. 色氨酸的荧光强度最弱，酪氨酸和苯丙氨酸发的荧光

强度相近，相对较强。

2. 不同氨基酸荧光激发光谱

2000

B

[1**********]

由实验数据可得，色氨酸的最大激发波长为276.74nm ，酪氨酸的最大激发波长为274.2nm ， 苯丙氨酸的最大激发波长为256.4nm. 色氨酸的荧光强度最弱（约为684），苯丙氨酸（约为3206），酪氨酸（约为3311）的荧光强度相对较强。

酪氨酸结构式，色氨酸结构式，苯丙氨酸结构式

。

三个氨基酸均为芳香取代基氨基酸，芳香族化合物苯环上的不同取代基对该化合物的荧光强度和荧光光谱有很大的影响。给电子基团，如-OH 、-OR 、-CN 、-NH2 、 -NR2等，使荧光增强。因为产生了p-π共轭作用，增强了π电子共轭程度，使最低激发单重态与基态之间的跃迁几率增大。吸电子基团，如-COOH 、-NO 、-C =O 、卤素等，会减弱甚至会猝灭荧光。

色氨酸中共轭双键使电子密度降低，故荧光强度低，酪氨酸中-OH 取代基存在使荧光增强，苯丙氨酸除氨基酸固定基团外无其他取代基，故三种氨基酸的荧光强度应为酪氨酸>苯丙氨酸>色氨酸，其中激发光谱和发射光谱原理类似，只是产生荧光的光谱波长不同。

3. 标准络氨酸数据处理

由已知浓度的络氨酸溶液及所测得的荧光强度有

表一：标准络氨酸工作曲线数据

拟合得：荧光强度=9061.69*C+142.29 由测得的未知酪氨酸溶液荧光强度为

3059

故可求得未知溶液的浓度为0.322mg/100ml，与理论配制时的浓度0.32mg/100ml基本吻合，故实验较为准确。 六．思考题：

1. 从方法原理、特点以及仪器的结构三方面比较分子荧光分析法和紫外吸收光谱法的异同点。

方法原理：紫外吸收光谱是分子吸收紫外辐射能后引起价电子跃迁所产生的，而分子荧光光谱是吸收了特定频率辐射能量后，由基态跃迁至第一电子激发态（或更高激发态）的任一振动能级后回到第一电子激发态的最低振动能级（无辐射跃迁）。然后再以辐射形式去活化跃迁到电子基态的任一振动能级，便产生荧光。它们一个是吸收光谱一个是发射光谱。但都是电子光谱，分子能及相似，光谱也相似。

特点：紫外是吸收光谱，分子荧光是发射光谱，紫外光谱研究200－800nm 光谱区域内物质分子对光辐射吸收的方法，而荧光则涉及对紫外辐射能量的吸收和接着再发射两个过程。

仪器：荧光光谱有两个单色器，及激发单色器和发射单色器，而紫外只有一个激发单色器。 2. 影响荧光定量分析准确性的因素有哪些？在分析过程中应该注意哪些问题？

荧光物质的环境，如溶剂、温度、溶液PH 、杂质、激发光源等，实验时要实验参数要确定实验物质的最大发射波长和最大激发波长，且所选用的溶液要适当。待测物要及时测量。

3. 解释荧光分子的最大激发波长和最大发射波长的相互关系。

最大发射波长总是大于最大激发波长。荧光是由激发光激发的，激发光的光子打到荧光物质上，经过一系列变化，激发出荧光。从能量角度看，一定有荧光一定有能力以热能及其他形式散失，故激发光光子的能量>荧光光子的能量，所以激发波长比发射波长小。 4. 列举荧光分光光度计应用于定量的方法。

固定激发波长，扫描不同浓度溶液的发射光谱，以其峰高处对应的相对荧光强度与浓度作标准曲线。在测定未知物的荧光强度在标准曲线上查找对应浓度。