石油降解菌
石油烃降解微生物研究进展
白洁,张竹圆,周方
(中国海洋大学 环境科学与工程学院 山东 青岛 266100)
摘要:石油降解菌是一类具有分解矿化石油烃能力的微生物,在石油污染的生物修复中具有重要作用。国内外学者通过添加不同底物对石油降解菌进行分离和驯化,得到高效降解菌株,对石油降解菌的降解机理以及降解影响因素进行了研究,并进行了初步的应用。本文就石油污染物生物降解方面的研究成果进行了综述及展望。
关键词:石油降解菌,生物修复,降解机理
Abstract: petroleum degrading bacteria is a category of microorganism which is capable of decomposing and mineralizing 石油烃, thus plays an important role in the restoration of petroleum pollution. Scholars home and abroad have made petroleum degrading bacteria undergo 分离and acclimation by adding different 底物and got highly efficient 降解菌株. At the same time they have conducted research in 石油降解菌的降解机理and the factors influencing 降解, and made primary studies on its application. This thesis provides an overview and prospect of the research findings in the area of石油污染物生物降解.
Keywords: petroleum degrading bacteria;Bio-renediation;
随着经济和社会的迅速发展,石油及其制品被广泛地应用于国民经济的各个领域和人类的日常生活中,而且使用量与日俱增。在石油产量激增的同时,石油在开发、储存、运输、加工和应用过程中的泄露和排放对环境的污染也日趋严重。鉴于石油污染危害的严重性,世界各国纷纷研制和开发出了一系列石油污染治理的技术,主要包括物理、化学、生物等方法。生物修复是新近发展起来的一项净化环境的低投资、高效益、便于应用、发展潜力较大的新型技术[1]。由于微生物降解法原理是利用微生物将烃降解成对环境无害的产物CO 2和H 2O ,具有安全、效果好、费用低、处理彻底、无二次污染等优点,成为一种经济效益和环境效益俱佳的、解决复杂环境污染问题的最有效的手段[2]。
对石油降解菌的研究,国内外侧重点有所不同。国外主要研究微生物对原油和芳烃的降解效率, 以及微生物对芳烃物质的降解机制;国内主要研究石油降解菌的筛选以及降解菌对原油的降解效率, 并利用降解菌对石油污染的土壤进行模拟性修复试验[6]。因此将对石油降解菌的研究进行及时总结具有极其重要的意义。
1 石油降解微生物的种类和分离方法
国外在20世纪40年代就开展了细菌降解油污的研究[3],我国这方面的研究始于20世纪70年代末期[4]。已知降解石油的微生物共有70属200余种。细菌有28个属,霉菌30个属,酵母12个属。能够降解石油烃的细菌有假单胞菌属(Pseudomonas ) 、弧菌属(Vibrio )、不动杆菌属(Acinetobacter )、黄杆菌属(Flavobacterium )、气单胞菌属(Aeromonas )、无色杆菌属(Achromobacter )、产碱杆菌属(Alcaligenes )、肠杆菌科(Enterobacteriaceae ) 、棒杆菌属(Coryhebacterium )、节杆菌属(Arthrobacter )、芽孢杆菌属(Bacillus )、葡萄球菌属(Staphylococcus )、微球菌属(Micrococcus )、乳杆菌属(Lactobacillus )、诺卡氏菌属(Nocardia )等;酵母菌有假丝酵母属(Candida )、红酵母菌属(Rhodotorula )、毕赤氏酵母菌属(Pichia )
等;霉菌有青霉属(Penicillium )、曲霉属(Apergillus )、镰孢霉属(Fusarium )等[5]。
石油降解菌一般从受石油污染的土壤、水中进行分离并筛选,为了进一步的应用,还要进行驯化。根据研究目的与要求不同,在筛选时往往控制不同的条件从而得到不同功能的菌落。以烷烃为底物筛选出的菌落,对烷烃的去除效率会较高,由于烷烃相对于芳烃较易分解,且大部分的石油降解菌对烷烃的降解效果均较好,因此专门以烷烃为底物进行的研究不多见,郑金秀[7]以烷烃为底物培养出分属于不同菌属的菌落,其中不动细菌菌属的菌株降解率为69%,芽孢杆菌属的菌株降解率为71%,假单胞菌属的降解率可达73%;以环烷烃为底物,得到不动细菌菌属与芽孢杆菌属的菌株,石油降解率均为67%。两种底物研究降解时间均为48h 。由于芳香烃及多环芳烃降解难度大,且其危害比较大,对降解芳烃的研究比较多。王春明[8]获得4株多环芳烃降解菌株,分别为微杆菌、纤维化纤维菌、鳌球菌及鞘脂菌。陈春云[9]分离得到24株以多环芳烃菲为唯一碳源和能源生长的菌株,其中有3株高效菌株,16d 效率分别可高达91.5%、83.37%、90%。研究最多的是直接以原油为底物进行筛选。目前此类报道已经很多,而且培育出了很多高效降解菌,大部分效率在30%以上,有些甚至都已超过70%。阮志勇[10]培育的一株以原油为碳源的菌株降解率可达78%,鉴定为友好戈登氏菌。
以上报道的微生物只能在30℃左右降解石油, 在低温下其新陈代谢会降低, 从而失去降解石油污染物的活性。1992年在俄罗斯的冻土层地带32 m深的土层中发现了嗜冷菌[11], 1997年在加拿大北部和阿拉斯加州的寒冷地层中, 均探测到能适应低温状态的微生物[12]。2002年,Anne Gunn Rike [13]等人从北极土壤中筛选出能降解石油烃的土著嗜油菌。2005年,NamioKunihiro [14]筛选出两种可在低温状态下降解姥鲛烷(2、6、10、14-四甲基十五烷) 的菌株, 其中有一种菌可在10~20℃下降解姥鲛烷,另一种可在10~30℃下降解姥鲛烷。2007年刘芳明[15]等对极地海洋石油烃污染物的生物降解进行了综述。
2 石油降解菌降解机理研究
2.1石油烃在微生物表面的吸附及在微生物细胞膜的运输
石油烃在水中的溶解度很小,且容易吸附在土壤颗粒上,很难直接被微生物利用。环境中存在的表面活性剂对石油烃具有一定的增溶和分散作用,为微生物吸附石油烃做了贡献。微生物还通过自身的适应性机制来提高对的利用率。对此目前存在两种解释,一种是特异性附着机制微生物通过菌毛或细胞膜的脂类和蛋白使细胞形成疏水表面而附着于水中的油滴上另外一种是烃类乳化机制微生物通过释放出乳化剂将油滴乳化成小颗粒,增大油滴的表面积,有利于微生物的直接接触和利用[21]。Zhang 和Miller [22]研究发现假单胞菌属(Pseudomonas ) 对污染物的降解能力还与它们产生的表面活性物质的疏水性有关,疏水性越强,降解污染物的速度越快。
石油烃在微生物细胞膜的运输是微生物降解的重要环节之一,但关于石油烃如何通过细胞膜目前还不很清楚。现在的跨膜运输理论主要存在被动运输和主动运输两种。Bateman J N.
[23]和Speer B. 等认为萘是通过被动运输的方式进入微生物体内的,不存在转运蛋白。而
Whiteman B E.和Luekong D R发现Pseudomonas aeruginosa菌和Pseudomonas fluorescens菌在吸收萘的过程中存在主动运输[24]。也有研究表明,微生物自身产生的生物表面活性剂也能使微生物细胞膜结构发生改变,从而引起污染物通过细胞膜的机会大大增加。Carrilo C. 与Terurl J A.等发现有些表面活性剂能够集合排列在微生物细胞膜的表面,有的甚至还可以镶嵌在细胞膜中,从而在细胞膜表面形成类似通道的孔状结构,使更容易通过细胞膜进入细胞体内[25]。
2.2石油烃类的微生物降解途径
微生物对石油的降解作用存在选择性, 优先消耗碳链长度中等(C10—C24) 的n-链烷烃类分子,其规律为:小于C10的直链烷烃>C10—C24或更长的直链烷烃>单环芳烃>环烷烃>多环芳烃, 同种类型的烃类中分子量越大, 降解越慢[26]。
通常认为饱和烃在微生物作用下,直链烷烃首先被氧化成醇,醇在脱氢酶的作用下被氧化为相应的醛,然后通过醛脱氢酶的作用氧化成脂肪酸;氧化途径有单末端氧化、双末端氧化和次末端氧化[27]。在转化为相应的脂肪酸后,一种转化形式为直接经历随后的 β- 氧化序列,即形成羧基并脱落 2 个碳原子;另一种转化形式为脂肪酸先经历ω-羟基化形成ω-羟基脂肪酸,然后在非专一羟基酶的参与下被氧化为二羧基酸,最后再经历 β- 氧化序列
[28]。脂肪酸通过β-氧化降解成乙酰辅酶A ,后者进入三羧酸循环,分解成 CO 2 和 H 2O 并释放出能量,或进入其他生化过程[29]。
微生物对支链烷烃的降解机理基本上与直链烷烃一致。相对于正构烷烃,支链的存在会增加微生物氧化降解的阻力,主要氧化分解的部位是在直链上发生的,而且靠近侧链的一端较难发生氧化反应。带支链烷烃的降解可以通过 α- 氧化、ω- 氧化或 β- 碱基去除途径进行[30]。总的说来,含有支链结构的烃类降解速度慢于相同碳数的直链烃类,这是因为烷烃的支链降低了分解速率[31]。
环烷烃在石油馏份中占有较大比例,它的生物降解原理和链烷烃的亚末端氧化相似。首先经混合功能的氧化酶(羟化酶) 氧化产生环烷醇,然后脱氢得酮,进一步氧化得到酯,或直接开环生成脂肪酸。真菌和细菌降解石油烃类化合物可形成具有不同的立体化学构型的中间产物。真菌将石油烃类化合物降解成反式二醇,而细菌几乎总是将之降解成顺式二醇(许多反式二醇是潜在的致癌物,顺式二醇则无毒性) [32]。
现已在细菌、真菌和藻类中发现可降解多环芳烃的微生物[33]。真菌产生的过氧化物酶能将多环芳烃降解为醌的衍生物[34]。细菌可通过多种代谢方式对多环芳烃进行降解, 以多环芳烃作为碳源, 将其转化为二氧化碳和水; 也可通过共代谢作用, 对其进行降解[35]。陈春云[9]分离得到24株以多环芳烃菲为唯一碳源和能源生长的菌株,其中有3株高效菌株,16d 效率分别可高达91.5%、83.37%、90%。
2 影响微生物降解石油污染物的因素
微生物在降解石油污染物的过程会受到营养元素、表面活性剂、O 2通量、温度、pH 值等外界因素的影响。其中, 营养元素对降解率的影响较大,尤其是N 、P 元素[16-17]。何良菊等
[17]专门对石油烃微生物降解的营养平衡进行了研究,表明氮、磷营养物质的缺乏直接限制了石油烃的微生物降解, 但添加过量反而有抑制作用, 因而存在一个经济合理的添加量及添加比例,实验表明氮磷比在5∶1~6∶1比较适宜,, 无机氮源比有机氮源好,硝酸盐形式的氮比铵态的氮更合适。而国内有其他研究却更倾向于氮磷比为1:1,且最佳氮源为氯化铵,最佳磷源为磷酸氢二钾和磷酸二氢钾[6]。两种研究得出的结果不一致。
表面活性剂是影响降解效率的又一重要因素。表面活性剂对石油烃具有一定的增溶和分散作用,从而对石油降解菌的降解效率有重要作用,而有研究则指出表面活性剂对微生物存在一定毒害作用。刘庆新等[18]通过研究,表明表面活性剂的加量多少对石油烃降解菌的影响比较复杂:加少量的表面活性剂会促进石油烃降解菌的生长,但随着表面活性剂加量的增加, 菌量反而减少,证实了上述论断。
在自然环境中,大多数的石油烃类是在好氧条件下被降解的,但是微生物对石油烃的降解在有氧及缺氧两种情况下都会进行,最近有研究表明厌氧降解对饱和烃及芳香烃有着极为重要的作用[19]。
能降解石油的微生物有嗜冷菌、嗜热菌和嗜中温菌,因此在温度低于0℃和在70℃左右
的环境中均有能降解石油的微生物,大多数石油降解菌属嗜中温菌,最适温度在30℃上下,温度过高过低都会对降解效率产生抑制。
普遍认为石油降解菌是产酸菌,且适宜生长于中碱性环境中[19]。刘庆新[18]等研究得最佳pH 值为8.0,而其文章中也指出与一般认为的7.0不符。而Stapleton [20]等发现在pH 2.0的一处土样中,萘和甲苯仍然被降解为CO 2和H 2O 。
4生物降解石油烃污染物的应用
利用生物降解石油烃类污染物最早见于20 世纪 80 年代末美国在 Exxon Vadez 油轮石油泄露的生物修复项目中,该项目在短时间内清除了污染,治理了环境,是生物修复成功应用的开端,同时也开创了生物修复在治理海洋污染中的应用[36]。20世纪90年代以来,生物修复技术在石油污染治理方面逐渐成为核心,取得了理论突破和重要成果[37]。国内学者也做了大量工作,但主要为石油污染土壤和地下水的生物修复研究[38],对海洋石油污染的生物修复研究相对较少,而且研究工作也大多停留在实验室模拟实验的水平上。闫毓霞[39] 利用土著微生物对胜利油田含油污泥进行修复实验;黄廷林等[40]对黄土地区石油污染土壤进行了室内模拟生物修复研究。
石油降解菌在实际应用中存在着很多问题,集中表现在投加高效石油降解菌来处理污染时:投加菌面临与土著微生物的竞争作用;投加菌需要适应新的生长环境; 投加菌要经受环境污染物的毒性影响。这些压力使接种的外源微生物的存活率很低或者活性较弱, 限制了它的实际应用。
5 展望
石油降解菌降解石油烃类污染物具有物理、化学方法所不具备的优点,它高效、经济、安全、无二次污染,在机械装置无法清除的薄油层而且化学药剂被限制使用时,生物法处理溢油的优越性便更加显著,具有广阔的研究及应用前景。目前国内外对石油降解菌的研究呈现出一定特点:
(1) 对一般性降解菌研究多,对极端环境下的石油降解微生物研究少,尤其是对低温、耐盐的石油降解菌。中国北方的大部分湿地,盐碱程度比较高,常年气温(尤其冬季)气温较低,而无论是来源海上还是来源于石油化工的污染都比较严重。在这种条件下的石油降解菌研究具有很广阔的前景。
(2) 对石油降解菌的研究多而应用少。对石油降解菌的所有研究到最终肯定要归结到实际应用中去,目前国内很多学者都对石油降解菌的单纯研究感兴趣,同时出现了大量的重复研究。国外已有成功应用先例,证明石油降解菌可以用来修复实际污染,国内仍止步不前,难于踏出实际应用的第一步。
随着大量学者的不断研究,对石油降解菌的认识肯定会不断深化,其应用也会逐渐成熟起来。
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