小动物生物发光活体成像的条件优化与技术扩展研究

小动物生物发光活体成像的条件优化与技术扩展研究

王　豫，关　华，宋　曼，王晓迪，高　毅，周平坤

［摘要］　目的　为发掘生物发光活体成像技术的灵敏性和应用潜力，进行在体检测条件的优化和技术扩展。方法将稳定高表达荧光素酶的乳腺癌细胞（４Ｔ－１－Ｌｕｃ）和肝癌细胞（Ｈｕｈ－７－Ｌｕｃ）接种于ＢＡＬＢ／ｃ小鼠体内，通过活体成像仪进行生物发光检测灵敏度和毛发的影响分析，利用生物发光结合Ｘ线扩展活体成像技术。结果　毛发对小鼠皮下接种的肿瘤细胞的生物发光成像有干扰作用，在局部剃除毛发小鼠内体可以检测到５０个细胞的光信号值。通过建立Ｘ结合发光的检测模型，实现了既能检测发光信号值强度大小，又能比较清晰地观测到部分脏器和发光体（病变组织）的部位。结论　实现了生物发光活体成像技术的检测条件优化，建立了Ｘ线结合发光新的检测模式，为扩展小动物活体成像的应用范围奠定了基础。

［关键词］　活体成像技术；荧光素酶；生物发光；Ｘ线；癌细胞［中图分类号］　Ｒ４４５．１，Ｒ８１２

［文献标志码］　Ａ

［文章编号］　１６７４－９９６０（２０１３）０４－０２７１－０３　　　　　　　ＤＯＩ：１０．７６４４／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４－９９６０．２０１３．０４．００８

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Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎａｎｄｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｅｘｔｅｎｓｉｏｎｏｆｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｉｍａｇｉｎｇｉｎｖｉｖｏｉｎｓｍａｌｌａｎｉｍａｌｓ

ＷＡＮＧＹｕ，ＧＵＡＮＨｕａ，ＳＯＮＧＭａｎ，ＷＡＮＧＸｉａｏ－ｄｉ，ＧＡＯＹｉ，ＺＨＯＵＰｉｎｇ－ｋｕｎ

倡Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，Ｔｅｌ：０１０－６６９３１２１７，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｏｕｐｋ＠ｂｍｉ．ａｃ．ｃｎ

倡

（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＲａｄｉａｔｉｏｎＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＡｃａｄｅｍｙｏｆＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００８５０，Ｃｈｉｎａ）

［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙａｎｄｐｏｔｅｎｔｉａｌａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙｏｆｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｉｎｖｉｖｏｉｍａｇｉｎｇｔｅｃｈ－ｎｉｑｕｅａｎｄｔｏａｃｈｉｅｖｅｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｄｅｔｅｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓａｎｄｔｅｃｈｎｉｑｕｅｅｘｔｅｎｓｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ４Ｔ－１－ＬｕｃｏｒｌｉｖｅｒｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓＨｕｈ－７－Ｌｕｃ

＋

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ｍｉｃｅ．Ｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙａｎｄｅｆｆｅｃｔｏｎｔｈｅｈａｉｒｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｕｓｉｎｇｔｈｅｓｍａｌｌａｎｉｍａｌｉｎｖｉｖｏｉｍａｇｅｒｏｆｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔｓｉｇ－ｎａｌｓ．ＴｅｃｈｎｉｑｕｅｅｘｔｅｎｓｉｏｎｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｂｙｃｏｍｂｉｎｉｎｇｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｗｉｔｈＸ－ｒａｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅｈａｉｒａｓｓｈｏｗｅｄａｒｅｏｂｖｉ－ｏｕｓｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｗｉｔｈｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔｓｉｇｎａｌｓｅｍｉｔｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｉｍｐｌａｎｔｅｄｉｎＢＡＬＢ／ｃｍｉｃｅ．Ｔｈｅｌｙｌｏｃａｔｅｓｏｍｅｏｒｇａｎｓａｎｄｔｈｅｏｒｉｇｉｎｏｆｏｐｔｉｃａｌｓｉｇｎａｌｓｏｒｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｔｉｓｓｕｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｐｏｓｅｏｆｗｉｄｅｎｉｎｇｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｍａｌｌａｎｉｍａｌｉｎｖｉｖｏｉｍａｇｉｎｇ．

ｏｐｔｉｃａｌｓｉｇｎａｌｃｏｕｌｄｂｅｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｔｈｅｃｅｌｌｕｌａｒｍａｓｓｏｆ５０ｃｅｌｌｓｗｈｅｎｌｏｃａｌｈａｉｒｗａｓｒｅｍｏｖｅｄ．Ｔｈｅｉｍａｇｉｎｇｍｏｄｅｌｅｓｔａｂ－ｌｉｓｈｅｄｂｙｃｏｍｂｉｎｉｎｇＸ－ｒａｙｗｉｔｈｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｃｏｕｌｄｎｏｔｏｎｌｙｄｅｔｅｃｔｔｈｅｓｔｒｅｎｇｔｈｏｆｏｐｔｉｃａｌｓｉｇｎａｌｓｅｍｉｔｔｅｄ，ｂｕｔａｌｓｏｃｌｅａｒ－ｉｍａｇｉｎｇｃｏｎｄｉｔｉｏｎｈａｓｂｅｅｎａｃｈｉｅｖｅｄ．ＡｉｍａｇｉｎｇｍｏｄｅｌｏｆｃｏｍｂｉｎｉｎｇＸ－ｒａｙａｎｄｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｉｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｆｏｒｔｈｅｐｕｒ－［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］　ｉｍａｇｉｎｇｉｎｖｉｖｏ；ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ；ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ；Ｘ－ｒａｙ；ｃａｎｃｅｒｃｅｌｌ

ｗｉｔｈｓｔａｂｌｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｗｅｒｅｉｍｐｌａｎｔｅｄｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙｉｎｔｏＢＡＬＢ／ｃ

　　恶性肿瘤是严重威胁人类健康的重大疾病，人们对肿瘤发生机制和治疗新药的研究一直没有中断过，好的实验动物模型和观察方法对于开展此类研究是非常重要的。活体成像技术是指应用影像学的方法，对活体状态下的生物学过程进行组织、细胞和分子水平的定性和定量研究，随着分子影像学技术的发展，在医学、生物学、药学等相关领域应用迅速

［１～３］

扩展。利用生物发光（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）技术标记肿瘤细胞，经皮下、静脉或原位接种后，该检测方

［作者简介］　王　豫，女，硕士，实验师，研究方向：放射生物学和肿瘤实验治疗

［作者单位］　军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京　１００８５０［通讯作者］万方数据　周平坤，Ｔｅｌ：０１０－６６９３１２１７，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｏｕｐｋ＠ｂｍｉ．ａｃ．ｃｎ

法可对标记物在动物个体中的分布、增长等进行活

体检测。为了进一步提高此技术的检测灵敏度，扩展可检测的技术参数范围，本研究观察了小鼠毛发对光信号成像的影响，并将生物发光信号与Ｘ线两者结合起来，扩展活体成像的检测效率和适用范围，为今后小动物成像技术的推广奠定有力的基础。１　材料与方法

１．１　材料１．１．１　实验动物　ＳＰＦ级雄性ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，６～８周龄，体质量（２０±２）ｇ。ＳＰＦ级雄性ｎｕ／ｎｕ裸小鼠，６～８周龄，体质量（１８±２）ｇ。均购自军事医学科学院实验动物中心。动物质量合格证号：ＳＣＸＫ－（军）

２００７－００４。１．１．２　实验细胞与试剂　采用本实验室早先构建的稳定高表达的荧光素酶细胞株：人乳腺癌细胞株

＋＋

（４Ｔ－１－Ｌｕｃ）；人肝癌细胞株（Ｈｕｈ－７－Ｌｕｃ），在含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养液（Ｇｉｂｃｏ公司）中，５％ＣＯ２３７℃孵箱恒温培养。Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ发光底物购自美国ＳｃｉｅｎｃｅＬｉｇｈｔ公司。１．１．３　实验仪器　小动物活体成像仪（德国伯托ＬＢ９８３ＮＣ１００Ｕ）。１．２　实验方法

图１Ａ由左至右为依次注射细胞浓度为５００００、

５０００、５００、５０、５以及空白对照小鼠。从图１Ａ中可

湖晒山辩

以看出，在此条件下曝光时间５ｍｉｎ，皮下注射５００个发光细胞可测得明显的信号值。当皮下注射５０个发光细胞时，系统采集不到信号。图１Ｂ中显示出信号值随注射细胞的浓度增加而上升，可见信号区域内的信号与细胞数是成正比的。

ａＯ０００ａ０００ａ００色０色０

１．２．１　稳定克隆癌细胞株在体内发光强度的检测　

理

ｏ

将早先构建的稳定高表达的荧光素酶细胞株乳腺癌

’：ｙ

细胞（４Ｔ－１－Ｌｕｃ＋

）进行胰酶消化计数并调整细胞浓

度为５×１０５

／ｍｌ。用ＰＢＳ将其梯度稀释，吸取混合

均匀的细胞１００μｌ，实施ＢＡＬＢ／ｃ小鼠的皮下注射粥Ｊ。本组实验共６只小鼠，分别注射终浓度为５００００、５０００、５００、５０、５个细胞，以及一个仅注射底物的小鼠作为空白对照。实验动物于成像前注射２００卅

μｌ荧光素酶底物（１５ｍｇ／ｍｌ）５ｍｉｎ后，戊巴比妥钠麻醉放入成像暗箱平台，ｉｎｄｉｇｏ操作软件完成图像分析过程ｄｉｇｏ。图像处理及数据分析采用仪器配备的被３００

ｉｎ发光细胞在活体动物内的灵敏度软件处理，计算出此区域发出的光子数（参数：曝光时间，检测其－５ｍｉｎ，ｂｉｎｎｉｎｇ值４×４）。１ＢＡＬＢ．２．２　×３００

毛发有相应阻挡信号的作用／ｃ排除干扰因素的发光检测小鼠未脱毛的情况下检测的　上述实验是在，所以我们做了同批次。由于小动物小鼠的脱毛与未脱毛的对比实验。将上述实验动物进行局部的脱毛处理后，重复上述步骤检测成像。（参数：曝光时间５ｍｉｎ，ｂｉｎｎｉｎｇ值４×４）。１．２．３　活体动物肿瘤的生物发光成像　将已经构

建好的人肝癌细胞（Ｈｕｈ－７－Ｌｕｃ＋

），进行雄性ｎｕ／ｏ口寸００

ｎｕ

裸小鼠右前肢的皮下接种（１×１０５

／ｍｌ），在肿瘤接种１周后开始成像检测，获得肿瘤组织中活细胞的光子值（参数：曝光时间３ｍｉｎ，ｂｉｎｎｉｎｇ值４×４）。１丽ａ００

ｄｉｇｏ．２．４分子成像系统　建立Ｘ线结合生物发光成像检测×１０／ｍｌ于裸鼠肺原位，将人乳腺癌细胞，接种（４Ｔ　采用ｉｎ－

＋

２０－１－ｄＬｕｃ）皮

下接种１６

后检测发光，通过Ｘ线模块成像信号作为明场（结构图像），检测发光信号作为暗场（检测功能图像），并进行拟合（参数：曝光时间１ｍｉｎ，ｂｉｎｎｉｎｇ值４×４）。

２　结果

２．１　Ｌｕｃ＋ＢＡＬＢ生物发光成像检测的灵敏度

），注入荧光素酶底物后万方数据

／ｃ小鼠皮下注射５乳ｍｉｎ腺癌开始成像检测细胞（４Ｂ

Ｔ－１－。

　图１　ＢＡＬＢ／ｃ小鼠皮下注射发光细胞与底物混合物的生物

发光成像结果（不脱毛）

Ａ．肿瘤细胞的体内成像；Ｂ．体内肿瘤细胞的光子值

在相同条件下对同批次ＢＡＬＢ／ｃ小鼠进行了脱

毛处理。图２Ａ中的检测结果可以清楚的看出，能检测到皮下注射５０个发光细胞的信号值。在图２Ｂ中也显出信号值随注射细胞的浓度增加而上升，可见信号区域内的信号与细胞数也是成正比的。

　图２　ＢＡＬＢ／ｃ小鼠皮下注射稳转发光细胞与底物混合物的

生物发光成像结果（局部脱毛处理）

Ａ．肿瘤细胞的体内成像；Ｂ．体内肿瘤细胞的光子值

２．２　裸鼠在体肿瘤的生物发光成像

将已经构建的人肝癌细胞（Ｈｕｈ－７－Ｌｕｃ＋

）皮下

接种１×１０５

，实验中观察到肿瘤接种在皮下后通过与底物反应即可产生光信号，从成像图３中可以看出，肿瘤接种１周后可检测到荧光信号并见清晰的皮下肿瘤，表明细胞在裸鼠体内不断增殖形成肿瘤；２周后红色区域信号增强，表明肿瘤体积逐渐生长，４周时，信号区有空白区域，表明肿瘤中心出现营养缺乏性坏死，没有荧光信号产生。可以清楚地看到随着时间的延长，小鼠的原位瘤越来越大，实时显示肿瘤的信号值逐渐增强。２．３　生物发光结合Ｘ线的活体成像

由于标记细胞在动物体内复杂的定位，直观的观测技术虽然可以从动物体表的信号水平直接获得

００

及检测灵敏性，就需要寻找信号稳定、标记简便、安

［７］

全无毒、检测灵敏的实验方法。

生物发光成像是基于捕捉细胞中表达的萤火虫荧光素酶与注射底物反应所发出的光子信号的检测方式，由于不需要激发光，能够一定程度避免由激发光产生的动物皮毛、组织等的自发光干扰。但在实际实验过程中，我们发现小动物的毛发对发光信号仍然存在一定的阻挡作用。我们对比观察了有无毛发的ＢＡＬＢ／ｃ小鼠的发光强度，结果证实，在脱毛处理的ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，检测灵敏度明显提高，可以检出图３　生物发光活体成像系统光实时观测体内肿瘤生长情况

细胞的发光值，但仍达不到获得一个清晰可见的准

确定位的需求。为克服上述缺陷，我们开发建立了一种生物发光结合ｄｉｇｏ下接种分子成像系统在人乳腺癌细胞Ｘ线的成像检测技术。采用ｉｎ－

＋

２０ｄ后检测发光，设置Ｘ线信号作为明场（４Ｔ－１－Ｌｕｃ）皮，发光信号作为暗场，并进行明暗场图像拟合。图４中可以清晰的检测到肺部的肿瘤信号，通过此实验

可以观测到小鼠脏器以及骨骼等器官的清晰位置。

图４　生物发光结合Ｘ光活体成像检测肿瘤信号及定位

３　讨论

近年来活体成像技术已经成为生命科学研究和医学诊断强有力的手段。随着对亚细胞结构和功能、分子生理和病理、细胞间和细胞内信号通路研究的深入，人类对疾病和对生命本质的认识不断被追溯到蛋白质ＭＲＩ、基因水平。在２０世纪发展起来的ＣＴ、环境内细微生命过程的探询、超声等宏观影像技术已经远不能满足对活体。组织切片和免疫染色能够部分解释一些生物现象，但是需要将研究对象从活体组织中分离，所得结果与其在活体内机制难免有所偏离，甚至完全相反

［４］

。我们知道荧光素酶

和荧光蛋白是具有生物活性的蛋白质，在活体内无

毒、无放射、可代谢、可穿过各种膜屏障。它们的编码基因片段小，可以被融合标记于绝大多数蛋白质和细胞，甚至可以对整个生物体进行全身背景标记

［５，６］

。在不影响生物体任何结构和功能的前提

下，这些荧光基团配合外部检测设备可以对各种体内生物现象进行实时活体显像。生物成像的最终目的是通过标记的发光探针实现对生物样本中单个生

物分子进行超灵敏检测万方数据

，欲提高生物成像的效果以

低至５０个发光细胞。在信号值相对较弱的情况下，想要检测出信号，最好的方法是避免毛发的阻挡。在小鼠肿瘤模型中，利用生物发光在活体成像方面的优势，实时地观察到了随着肿瘤移植时间的延长，活体成像检测到的发光面积逐渐增大，发光强度也逐渐增加，证实了在相同的深度情况下，检测到的发光强度和细胞的数量具有非常好的线性关系，实现了实时、动态观测深部肿瘤的生长情况。

为了实现从动物体表的发光信号水平值直接测定，到发光源（癌细胞的组织分布）的准确定位，我们开发建立了生物发光结合Ｘ线的活体成像检测技术，对小动物实现精确结构成像，与发光成像组合应用，确保图像真实。该技术方法可应用于肿瘤转移的准确定位，以及化学物发光体或药物的组织分布和代谢等研究。

本研究是鉴于小动物活体成像技术检测过程中的部分潜在干扰因素和应用中的局限性，进行了实验技术的优化，并且通过技术开发建立了新的检测方法，为今后扩展活体成像的应用范围奠定了基础。

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（钱　全　编辑　　２０１２－１０－２９　收稿）

小动物生物发光活体成像的条件优化与技术扩展研究

作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：

王豫， 关华， 宋曼， 王晓迪， 高毅， 周平坤， WANG Yu， GUAN Hua， SONG Man，WANG Xiao-di， GAO Yi， ZHOU Ping-kun

军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京,100850军事医学

MILITARY MEDICAL SCIENCES2013,37(4)

本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_jsyxkxyyk201304008.aspx