D,L-苯丙氨酸对映体拆分的研究进展

D,L-苯丙氨酸对映体拆分的研究进展

M140101006 高金伟

摘要：氨基酸是组成蛋白质的基本单元，在人体及动物生命活动中起着举足轻重的作用。不同旋光异构性的氨基酸在动物体内代谢途径不同，发挥着不同的生理作用和生物活性。对近年来采用手性试剂拆分法、色谱拆分法、电泳拆分法、膜拆分法、酶促拆分法、萃取法等分离方法拆分D,L-苯丙氨酸对映异构体的研究进展进行了简要的概述。

关键词：D,L-苯丙氨酸；对映异构体；拆分

手性是指原子组成相同，在立体结构上互为镜像，可以比喻为人的左手和右手。互为镜像关系而不能重合的一对分子称对映异构体(对映体)。对映异构体都有旋光性(其中一个是左旋体，另一个是右旋体)，又称旋光异构体(光学异构体)。一对对映异构体右旋体和左旋体的等量混合物称外消旋体。对映异构体在药物中占很大比例，常用药物中40%为外消旋体，天然药物中98%为旋光异构体[1,2]。虽然对映异构体物化性质基本相同，但由于药物所作用的受体或靶位是蛋白质和核酸等手性大分子，对与其结合的药物分子空间构型有特殊要求，因此对映异构体药物在体内往往呈现很大药理、毒理作用及药效学、药动学方面的差异[3]。典型的例子是“Thalidomide(沙利度胺)事件”，研究表明其R-Thalidomide具有治疗呕吐的作用，而S-Thalidomide却具有很强的致畸作用。该外消旋药物在20世纪60年代的广泛使用，使数千名婴儿致畸，成为上世纪医疗界的悲剧[4]。鉴于此，在制药工业，许多国家规定必须对药物的对映体限度进行控制。美国食品与药品监督管理局(FDA)1992年颁布了手性药物指导原则，要求新型手性药物在上市前必须对其对映体分别进行药效研究，说明对映体各自的生理活性、药理作用、毒性和临床效果，如果其对映体药理、毒理等数据表明该对映体不具有治疗作用，则该对映体的含量应进行严格控制。因此，对映体拆分和控制在药物合成及质量控制中已成为一个不可回避的问题。

苯丙氨酸(Phe)又称α-氨基-β-苯丙酸，为无色至白色片状晶体或结晶性粉末，其种类有外消旋DL-型、L-型、D-型。L-苯丙氨酸具有生理活性，人和动物体内不能合成它，必须从外界摄取。L-苯丙氨酸是人和动物必需的氨基酸之一，也是生物体内合成酪氨酸的重要原料，可影响甲状腺激素和毛发、皮肤的黑色素，在体内参与消除肾与膀胱的功能消耗。同时L-苯丙氨酸还是合成抗病毒和抗癌药物如苯丙酸氮芥，甲酰溶肉瘤素，甲氧芳芥及新型甜味剂阿斯巴甜(天冬酰苯丙氨酸甲酯，Asparanie简称为APM)的原料[5]。近几年来正是APM产量的激增，从而引起了L-苯丙氨酸生产的迅速发展。D-苯丙氨酸营养上价值虽小，但它能增强人体的免疫功能，能够抑制脑啡肽(一种内源性镇痛物质)的分解，从而抑制羧肽酶(脑啡肽的降解酶)的活性，因而有出色的镇疼作用[6]。苯丙氨酸在食品医药领域广泛应用，主要用于保健以及药物。已有研究表明氨基酸的D、L异构体在生物体内的吸收、消化、新陈代谢及分泌等过程中的作用是不同的，而且生物体内不同构型的氨基酸在传递神经信息、调节代谢通路及肽和蛋白质的合成等许多生理过程中也具有不同的作用，因此苯丙氨酸对映体的分离具有十分重要的意义，而氨基酸对映体的分离一直是国内外的研究热点。本文将对苯丙氨酸对映体的分离方法和手段作简要的概述，具体如下：

1 手性试剂拆分法

一些非对称的具有旋光性的天然碱类,如奎宁碱和番木鳖碱等的两种酒石酸的盐具有很不相同的物理性质,包括溶解度和旋光性。这是因为一对旋光性的对映体分别地与另一个旋光试剂反应,所得到的是两个非对映立体异构体的衍生物的缘故。例如,对映体(-)-A和(-)A酸分别地与(-)-B碱反应,所生成的盐(+)-A·(-)-B和(-)-A·(-)-B,它们的分子

实际上彼此已不再互为对映体了。因为分子的立体结构的变动,对晶体结构有较大的影响，而使非对映立体异构体的溶解性，结晶性呈现明显的差别，可利用结晶等方法将他们分离、精制。然后利用逆反应去掉拆解剂，得到纯的旋光性化合物，达到拆分的目的。通常可用马钱子碱、奎宁和麻黄素等旋光纯的生物碱拆分酸性外消旋体；用酒石酸、樟脑磺酸等旋光纯的有机碱拆分碱性外消旋体。研究表明，将DL-Phe和N-羧苯甲酰-L-天冬氨酸及L-苯乙醇酸在稀硫酸中成盐，调节pH值，均可结晶析出 L-Phe[7,8]。Weng等利用N-苯甲酰基-D-苯丙氨酸做拆分剂，先后得到D-Phe和L-Phe结晶[9]。Okamoto等以苏氨基物做拆分剂，用酸水解后就可得到L-Phe[10]。此种方法分离苯丙氨酸对映体具有操作简单，用时较省，但是提取的物质纯度不高，拆分剂的用量较大，而且要求拆分剂尽量达到旋光纯态。

2 色谱拆分法

色谱拆分法是目前手性药物分析和分离中应用最广和最有效的方法之一。其分离法以色谱技术为基础，引入不对称结构，使得对映体直接或间接分离开来，同时能够对拆分开来的物质做一系列的分析。目前手性色谱法主要包括气相色谱法(GC)，薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、超临界流体色谱法(SFC)、毛细管电泳法(CE)和逆流色谱-离心分配色谱法(CPC-CCC)等。其中发展最快、应用最广的是高效液相色谱，它是药物质量控制以及立体选择性的药理学和毒理学研究的重要手段，具有有效、快速、操作方便、成本低廉等优点，己经被证明是对映体分离分析的最好方法之一。

2.1 高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)

高效液相色谱法有直接拆分和间接拆分两种。直接拆分法是在色谱柱中引入“手性识别的因素”和“手性环境”，两个对映体可与这些手性因素暂时形成非对映体，呈现出性质上的区别，从而实现对映体分离。间接法是分离前将对映体与高的光学纯度衍生试剂(CAD)反应，形成非对映异构体，然后通过非手性的气相色谱(GC)和高效液相色谱(HPLC)等来分离混合物，直接法分为手性流动相添加剂法(CMPA)和手性固定相(CSP)法两种，手性固定相有多糖类、蛋白质类、环糊精类和冠醚类等。间接法又称为手性试剂衍生化法(CDF)，区别在于手性衍生化是在分子间或者是在分子内部。

2.1.1手性流动相添加剂法(CMPA)

根据添加剂的性质可将手性流动相添加剂( CMPA) 分为4类: 配基交换型手性添加剂、手性离子型配合剂、环型葡聚糖添加剂以及基于其他作用的手性流动相添加剂。其中配基交换型手性添加剂的基础理论研究较成熟, 应用较广泛。近年来，环糊精及其衍生物以其高度的对映体选择性和热稳定性备受研究者的青睐，应用越来越广。赵平等以含L-脯氨酸铜( L-Pro~ Cu(Ⅱ) ) 配合物的溶液作手性流动相，采用反相高效液相色谱法成功地拆分了非衍生苯丙氨酸对映体( D,L-Phe)[11]。李静以脯氨酸手性离子液体作为流动相添加剂，苯丙氨酸对映体获得了较好的拆分效果[12]。

2.1. 2 手性固定相法

手性固定相法是基于样品与固定相表面的手性选择剂形成暂时的非对映体配合物的能量差异或稳定性不同而达到手性分离，根据手性分离机理和手性选择子的不同，手性固定相(CSP)可分为如下几大类:配体交换型手性固定相、冠醚类手性固定相、多糖衍生物类手性固定相、环糊精类手性固定相、Pirkle型手性固定相、手性聚合物固定相、大环抗生素类手性固定相、蛋白质类手性固定相、分子印迹手性固定相等[13]。何炳林[14] 等在聚乙烯胺树脂上经化学反应引入L-氨基酸, 并与铜离子络合生成高分子手性树脂, 有效拆分了DL-苯丙氨酸。

2.1.3手性试剂衍生化法(CDF)

在分离之前向待分离的手性化合物中加入手性衍生化试剂，使手性衍生化试剂与两种旋光异构体反应，将对映体转化为非对映体，进而使用常规柱进行分离分析。刘广军用邻苯二甲醛和N-乙酰-L半胱氨酸作为柱前手性衍生化试剂, 使用常规反相高效液相色谱法拆分DL-氨基酸对映体，分离效果良好[15].

2.2 薄层色谱拆分法(Thin Layer Chromatography,TLC)

薄层色谱属于液相色谱的范畴，对制作薄层色谱的材料适当处理或选择后也可进行吸附、分配、离子交换或者排阻等色谱分离。在正相或反相薄层色谱中，可以在流动相中添加手性选择剂进行对映体分离。TLC和高效液相色谱相比，薄层色谱中手性固定相制备加工方便，操作比较简单，但是薄层色谱的固定相有较高的紫外背景，只能应用于荧光或者有色的样品。此法具有简单、方便及易操作等特点,且重复性良好。方艳红等[16]用β-环糊精(β-CD) 作为流动相手性添加剂，采用薄层色谱分离法，D,L-苯丙氨酸对映体相对比移值α为1.15。

3 电泳拆分法

毛细管电泳是近几十年发展起来的一种高效的分离技术，其推动力是高压电场，以毛细管为分离的场所，分离原理是各组分间电荷和质量的差异所造成的样品在电场中分配行为的差异而实现分离。毛细管区带电泳与胶束电动毛细管是现实中应用最广泛的两种模式。毛细管电泳具有分离效率高、分析时间短和样品用量少等特点，大规模用于分离分析，特别是在手性化合物的分析测定方面。但是毛细管电泳有其局限性,其检测灵敏度不足,重现性较差等。黄宝美等[17]以未涂层融硅石英毛细管为分离柱，建立了苯丙氨酸对映体的高效毛细管电泳-电导分离检测的方法。吴玉娇以β-环糊精和手性离子液体(CIL）联用为分离介质体系，建立拆分苯丙氨酸对映体的毛细管电泳新方法，样品中分析物的回收率在 85.6% ~115.2%之间[18]。沈静茹等[19]采用正向高效毛细管电泳法拆分了非衍生化的D,L-苯丙氨酸，对映体分离度达到4.46。

4膜拆分法

氨基酸的生物转移通常是由埋在生物膜中的载体蛋白质来传递的，这种转移的对映体选择性是非常高的。通过膜分离进行旋光异构体的拆分正是这种生物过程的模拟，分为液体膜拆分法和手性固体膜拆分法，前者基于选择性萃取，择性比较好，选择的种类和程度取决于所使用的载体分子(手性选择剂，CS)的性质。载体分子通常为大分子配体化合物，如冠醚，穴状配体等。后者基于对映体间亲和性的差异，通过调节手性识别位置周围的亲水-疏水性质，来增大固定在膜上的手性识别位置的拆分能力。将具有手性识别能力的膜放在一个被控制的亲水-疏水微环境中，根据它们的分配或渗透行为，得到对旋光物质更高的选择性。膜法具有占地面积小，所用设备简单，能量消耗低、操作方便和易于规模化等优点，但目前选择性和效率还比较差。龙远德等利用天然的环糊精和经过化学修饰的环糊精，制备带有环糊精基团的聚合物膜，拆分了Phe外消旋体[20]。PICKERING 等用铜(Ⅱ) N-癸基-L-羟基脯氨酸作为手性选择剂, 以己醇和癸烷为膜溶剂，制得乳化液膜选择性萃取分离苯丙氨酸外消旋体，最佳对映异构体过量值为40%[21]。刘深[22]以β-CD为手性选择剂的乙酸纤维素膜对苯丙氨酸对映体分离做了研究,对苯丙氨酸的分离率e.e(%)为9.47%。

5酶促拆分法

酶的催化作用表现在酶蛋白质的活性中心是一个不对称环境，有利于识别消旋体，在一定条件下，酶只能与消旋体中的一个对映体发生反应而成为不同的化合物，从而使两个对映体分开，反应产物的对映过剩百分率(ee值)可达100%。酶促拆分法具有催化效率高、专一性强的特点，而且拆分产物旋光度高、副产物少、产品较易分离提纯，是获取对映纯化合物的捷径。使用水溶态酶反应过程的操作十分简便，但最后的分离、精

制操作比较麻烦，而且酶无法回收。何仕国等[23]利用猪肾酰化酶Ⅰ选择性地水解N-乙酰-L-苯丙氨酸，得到光学纯度OP = 98. 8%的L-苯丙氨酸，收率70. 3%；OP= 96%的D-苯丙氨酸，收率63%。黄冠华等[24]在固定化青霉素酰化酶存在下, 通过N-苯乙酰-D, L-苯丙氨酸的选择性水解，得到L-苯丙氨酸(收率63%，光学纯度99%)和D-苯丙氨酸（收率67%，光学纯度91%）。闫博等[25]研究了以( dl) -苯丙氨酸为原料经D-氨基酰化酶制备D-苯丙氨酸, 拆分收率可达97%。

6 萃取法

萃取分离法是利用物质在两种互不相溶的溶剂中的溶剂度或分配比例的不同达到分离，提纯和纯化的一种操作。其主要分为四类萃取技术：溶剂萃取、固相萃取技术、固相微萃取技术和液相微萃取技术。传统的萃取工业中，溶剂萃取法提取和分离效率较高，生产能力比较大，效果好，回收率高，设备简单，连续操作等优点，过程中，手性选择时机依靠极化、诱导和氢键等分子间作用力、配位键生成非对映异构体，由于存在一定的自由能差，从而使得两种对映体分离开来。崔玉等[26]用正十二烷基-L-羟基脯氨酸萃取苯丙氨酸。实验结果表明：合成新萃取剂在铜离子存在下对D-和L-苯丙氨酸显示出良好的萃取作用，分离因子α可达1.8以上。公佩欣报道了以L-苯丙氨酯与Cu(II)离子形成的配合物作为鳌合手性萃取剂对D-苯丙氨酸的萃取能力要大于对L-苯丙氨酸，分离因子达到2.02[27]。

展望

随着社会的发展，人们对氨基酸的需求量将会逐渐增大。就手性氨基酸的拆分而言，目前在工业生产中大多采用的还是化学拆分法。在药物拆分分析研究中，常用的方法是气相色谱法和高效液相色谱法，这两种方法效率较高，但其手性柱价格昂贵、易损坏，且手性衍生化常带进副产物。超临界流体色谱法暂处于发展阶段，其工艺研究尚未成熟，但随着其理论和技术的日益完善，这种方法在手性药物拆分中的应用将得到进一步发展。在众多拆分方法中膜分离具有操作简单、可连续生产、放大过程易行等优点，随着膜材料、膜工艺和膜工程的发展及对拆分、传质机制的深入研究，膜分离将逐渐成为手性拆分技术今后的发展方向。酶拆分法在工业生产方面有较大的应用空间，并且操作简便环保。随着蛋白质工程和工业微生物技术的发展，酶拆分法将在不久会用于大规模工业生产。

参考文献：

[1] 王晓东，姚金水，魏明星等.手性识别及氨基酸手性固定相的研究进展[J].有机化学，2006,

26:912-921.

[2] Chen L R, Jiang S X. Foundation and practice of HPLC [M]. Beijing: Science Press, 2001: 249-253.

[3] 徐贝佳. 高效液相色谱手性固定相法分离药物对映体[D].杭州:浙江大学.2007.

[4] Knoche B, Blaschke G. Investigations on the invitro racemization of thalidomide high performance

liquid chromatography[J]. Journal of Chromatography, 1994, 666: 235-246.

[5] Volker S. Chiral separations using gas chromatography[J]. Trends in Analytical Chemistry, 2002,

21:647-661.

[6] Volker S. Separation of enantiomers by gas chromatography [J].Journal of Chromatography A, 2001,

906:275-299.

[7] Okamoto Y, Yashima E. Polysaccharide derivatives for chromatographic separation of enantiomers [J].

Angewandte Chemie International Edition, 1998, 37: 1020.

[8] Hesse G, Hagel R. A complete separation of a racemic mixture by elution chromatography on cellulose

triacetate[J]. Chromatographia, 1973, 6: 277-280.

[9] Weng W Q, Zeng L, Yao B X, Yao W S, et al. Enantioseparation of amino acid derivatives with a

cellulose-based chiral stationary phase [J]. Chromatographia, 2006, 64: 463-467.

[10] Okamoto Y, Aburatani R, Hatada K. Chromatographic chiral resolution. X1V: Cellulose tribanzoate

derivatives as chiral stationary phases for high performance liquid chromatography [J]. Journal of Chromatography, 1987, 389: 95-102.

[11] 赵平，吴海君，高丽红，等. 手性流动相HPLC法拆分苯丙氨酸对映体[J]. 华东理工大学学报,

2002, 28(3) :225-227.

[12] 李静. 药物对映体的手性离子液体配体交换分离研究[D].湖南：中南大学，2013:1-70.

[13] Myung H H, Sang C H, Sung H W. New ligand exchange chiral stationary phase for the liquid

chromatographic resolution of α- and β-amino acids[J]. Journal of Chromatography A, 2003, 992: 47-56.

[14] 何炳林，袁直. 含L·氨基酸的手性聚乙烯胺配体交换树脂的合成[J].科学通报, 1991 , 8∶591.

[15] 刘广军. 高效液相色谱与化学计量学方法联用测定多种氨基酸对映体[J].曲阜师范大学学报,

2005, 31(3) :86- 89.

[16] 方艳红，王 琼，徐金瑞. 反相薄层色谱法拆分D，L-苯丙氨酸对映体[J]. 理化检验-化学分册，

2005,41(4):241-244.

[17] 黄宝美，张爱华，姚程炜，等. 高效毛细管电泳电导法拆分苯丙氨酸对映体[J]. 分析测试学

报,2007,26(2):258-260.

[18] 吴玉娇. 基于手性离子液体的毛细管电泳技术在手性氨基酸分离中的应用研究[D].山西：山西医

科大学，2014:1-62.

[19] 沈静茹，张祎，吴天骄，等. 手性HPCE整体柱非衍生化法拆分苯丙氨酸[J]. 中南民族大学学

报（自然科学版）, 2014,33(2):10-13.

[20]龙远德，黄天宝.β-环糊精聚合物膜拆分氨基酸对映体[J].高等学校化学学报.1999,20(6) :884-886.

[21] PICKERING P J, CHAUDHURI J B. Enantioselective extraction of (D)-phenylalanine from racemmic

(D/L)- phenylalanine using chiral emulsione liquid membranes [J] . Journal of Membrane Science, 1997, 127: 115-130.

[22] 刘深. 基于β-环糊精手性膜的制备及其对色氨酸、苯丙氨酸对映体的拆分[D].浙江：浙江工业

大学，2013:1-73.

[23] 何仕国，俞一军，许文松. DL-苯丙氨酸的酶法拆分研究[J]. 化学反应工程与工艺，

2004,20(1):64-69.

[24] 黄冠华，夏仕文. 酶法拆分D,L-苯丙氨酸制备D-苯丙氨酸[J].合成化学,2007,15(1):69-72.

[25] 闫博，朱占锋. D-基酰化酶拆分( dl) -苯丙氨酸制备D-苯丙氨酸[J]. 氨基酸生物与科学, 2008,

30(1) : 36-38.

[26] 崔玉，尹少宏，孙国新，等. 正十二烷基-L-羟基脯氨酸手性配位萃取拆分外消旋苯丙氨酸[J]. 无

机化学学报, 2012,28(4) : 686-690.

[27] 公佩欣. 新型螯合萃取剂的合成及萃取拆分苯丙氨酸外消旋体的研究[D].山东：济南大学，

2013:1-79.