叶酸受体介导的靶向给药研究进展

・178・Foreign Medical Sciences Section o f Pharmacy 　2006Jun ; 33(3)

叶酸受体介导的靶向给药研究进展

林凤云综述　朱照静3审校

(重庆医科大学药学系药剂学教研室, 重庆　400016)

摘要:叶酸受体可以与叶酸及其类似物特异性结合, 通过介导细胞内化将其摄入细胞胞浆。利用

叶酸受体在肿瘤和关节炎细胞的过度表达, 使药物与叶酸结合, , 即可将药物主动靶向肿瘤和关节炎细胞, 从而提高药物在肿瘤、, 、治疗的目的。本文就叶酸受体及其组织分布, 向诊断、治疗的研究进展进行了综述关键词:叶酸; 叶酸受体中图分类号::A :100120971(2006) 0320178204　　1986年自发现叶酸(folic acid ,folate ,FA ) 是由受体介导的内吞途径进入细胞以来, 人们开始对FA 作为靶向载体进行深入研究。现已证实在肿瘤、关节炎部位有高表达的叶酸受体(folate receptor , FR ) , 对FA 及FA 2药物复合物具有高亲和力, 通过内吞作用可将药物转运至细胞内。以FA (或其类似物) 为配体, 从小分子放射性显像剂到大分子基因药物都可与FR 高效结合, 并被转运进入细胞。本文将FA 作为靶向载体的作用机制及其在肿瘤、关节炎诊断和治疗方面的应用进行综述。1　叶酸受体及其组织分布

FA 是人体必需的维生素, 但人体不能合成FA ,

巢癌、肾癌、子宫内膜癌、睾丸癌、脑瘤、肺腺癌等高

β水平表达; 2FR 在乳腺癌、脑瘤、睾丸癌、头颈部肿瘤、粒细胞白血病等高水平表达; γ2FR 在组织中难以检测[3]。转移瘤的FR 比原位、恶性程度低的肿瘤表达更多。此外, 在关节炎的活性滑液巨噬细胞

上β2FR 也有大量表达, 而在休眠的巨噬性细胞上不表达。

表1　叶酸受体在肿瘤中的表达

肿瘤卵巢癌脑瘤子宫内膜癌肾癌头颈部肿瘤肺癌乳腺癌间皮组织癌结肠直肠癌

新发病人(例)

[***********][***********]0250015200

FR 过表达率(%)

93%75%91%43%38%37%32%73%22%

需摄取外源性FA 。其摄取途径是FA 通过与细胞表

面的FR 结合, 内吞进入细胞。由此, 人们推测在细胞增殖较多、分裂较快的组织, 需要大量的FA , 由此推测FR 应高水平表达。

实验证实,FR 是一种糖基化磷脂酰肌醇连接的膜糖蛋白, 相对分子质量(M r ) 为38～40ku , 主要有

αβ3种亚型:2FR 、2FR 和γ2FR 。FR 在正常组织中的

表达高度保守, 只在肺、肾、脉络膜、胎盘中有低到中等水平表达, 以β2FR 为主。而在大部分恶性肿瘤中FR 具有高度表达(表1) [1,2], 有时可比正常组织高

α出100～300倍。2FR 在一些上皮细胞系肿瘤, 如卵

　收稿日期:2005211209

　作者简介:林凤云, 女, 在读硕士研究生, 研究方向:药物新剂型与新技术,T el :[1**********]8,E 2mail :lfyun82@126. com

　3通讯作者:朱照静, 男, 教授, 硕士生导师, 研究方向:药物新剂型与新技术,T el :[1**********]8,E 2mail :zhaojing@cta. cq. cn

2　叶酸受体介导的内吞作用

FR 对FA 及其52甲基四氢叶酸、52甲酰基四氢

叶酸、磺胺、甲氨蝶呤、5,102亚甲基四氢叶酸等叶酸

类似物具有很高的亲和力(K D ≈10-10m ol ・L -1) 和特异性, 可介导这些物质内吞进入细胞, 它是生物细胞最具有特点的转运过程之一。因此, 人们利用FR 对FA 及其类似物的转运机制和FR 在肿瘤及关节炎巨噬细胞的高度表达, 对肿瘤和关节炎的特异性

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显像诊断及治疗进行研究。将放射性核素、抗肿瘤药物及基因药物与FA 或FA 类似物偶联, 通过FR 介导进入靶细胞内, 对疾病进行诊断和治疗。其转运过程如图1所示[4]:外源性的FA 2药物复合物与细胞膜表面的FR 特异性结合,FA 2药物/FR 复合物周围形成凹陷, 在细胞内形成内涵体, 在核内体膜质子泵的作用下, 内涵体内pH 由7降至5, 使FA 2药物/FR 复合物的构象改变, 药物从复合物上解离, 药物被释到细胞内, 而FR 可再回到细胞膜表面, 循环转运药物

。

图1　FR 介导的内吞作用过程

3　叶酸受体介导的肿瘤诊断

人们对FR 介导的诊断显影剂包括放射性核素、荧光染料、磁共振(MRI ) 成像剂和正电子发射计算机断层(PET ) 显影剂等进行了研究, 但是只有放射性核素取得了一定的成功, 已进入了临床[5]。因此, 本文将主要介绍放射性核素的应用。

FA 及其类似物通过γ羧基与放射性核素偶联形成显影剂, 可与FR 特异性结合, 选择性浓集于FR 表达丰富的组织。由于FR 在肿瘤和非肿瘤组织的

分布有显著性差异, 因此,FR 介导的显影剂可获得肿瘤与正常组织高对比度的图像, 以此对肿瘤进行定位、诊断及评价化疗效果。目前, 用于显影的放射性核素主要有铟(111In ) 、镓(67G a ) 、锝(99m T c ) 和铜(64Cu ) 。核素2FA 偶联显影剂在体内表现出明显的肿瘤特异性, 当显影剂与FA 同时给药时, 摄取被竞争性抑制, 说明显影剂是通过FR 介导进入肿瘤细胞, 而非特异性结合很少。不同显影剂在肿瘤与非靶组织的浓度比值如表2所示[3,6,7]。

表2　各种显影剂在肿瘤与非靶组织浓度比值

肿瘤/非靶组织肿瘤/血液肿瘤/肌肉肿瘤/肝脏肿瘤/肾脏

67

G a 2DF 2FA 409±195

111

In 2DTPA 2FA 350±100

99m

T c 2HY NIC 2FA

99m

T c (CO ) 32DTPA 2FA 9. 0±0. 11. 4±0. 10. 43±0. 040. 07±0. 01

55. 0±19. 228. 2±14. 85. 78±2. 920. 26±0. 03

124±4711±32. 6±0. 9

33. 3±9. 831. 1±9. 71. 00±0. 34

67

　　G a 2DF 2FA :67镓2去铁胺2叶酸盐; 111In 2DTPA 2FA :111铟2二乙三胺五乙酸2叶酸盐; 99m T c 2HY NIC 2FA :99m 锝2肼基烟酰胺2叶酸盐; 99m T c (CO ) 32DT 2

PA 2FA :三羰基99m 锝2DTPA 2叶酸盐

　　K e 等[6,8,9]的研究表明, 111铟2八齿2二乙三胺五

111乙酸2叶酸盐(111In 2octadentate 2DTPA 2FA ) 、铟2二乙

基丙酸2D 2谷氨酸2蝶酸盐(99m T c 2EC20) 的肿瘤/非靶组织分布情况与111In 2DTPA 2FA 基本相同, 都具有肿瘤选择性。对67Cu 2FA 偶联物作为显影剂虽然进行了研究, 但目前尚未获得理想的结果。

目前, 在FR 介导的肿瘤诊断试剂中, 仅111In 2

三胺五乙酸2乙基二氧2双乙胺2蝶酸盐(111In 2DTPA 2

99m NOON 2pteroate ) 、锝2二乙三胺五乙酸2叶酸盐

(99m T c 2DTPA 2FA ) 和99m T c 2半胱氨酸2天冬氨酸2二氨

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DTPA 2FA (即F olateScan ) 完成了Ⅱ期临床试验, 在35

例卵巢癌患者中正确检出率为82%[10]。4　叶酸受体介导的肿瘤治疗4. 1　叶酸2硼化合物

的绿色荧光蛋白小干扰RNA 质粒载体2乙烯亚胺2聚乙二醇(pS UPER 2siG FP 2PEI 2PEG ) 却不超过40%, 表明FR 可介导基因转运方面的优势。

Y ang 等[16]合成的反义表皮生长因子受体寡聚核苷酸(antisense 2EG FR 2ODN ) 2磷脂酰乙醇胺2聚乙二醇2叶酸盐(DSPE 2PEG 2FA ) 与K B 细胞共同培养1h 后, 噻唑蓝(MTT ) 比色分析结果表明, 对K B 细胞生长的抑制率达50%, 而非10%; 延长4. 4(T AA ) 与正常蛋白相差很、体液免疫不能识别肿瘤细胞, 从而不能进行正常免疫应答, 逃避在体内被杀灭。为了达到免疫治疗的目的, 可采用外来半抗原修饰肿瘤分子, 提高机体免疫系统对肿瘤细胞的识别能力。同时可利用抗体依赖细胞介导的细胞毒药物, 增加杀死肿瘤细胞的能力。FR 在肿瘤细胞高度表达, 可作为外来半抗原修饰肿瘤的靶点。

Lu 等[17]在BA LB/c 小鼠腹腔内植入5×106FR 阳性的M109肺癌细胞, 并用钥孔　血蓝素2异硫氢酸荧光素(K LH 2FIT C ) 免疫, 肿瘤移植4d 后, 每周给予FA 2异硫氢酸荧光素(FA 2FIT C ) 1800nm ol ・kg -1治疗, 结果小鼠存活率比仅给予磷酸盐缓冲溶液(P BS ) 的对照组显著增加。接着Lu 等[17]又在接种L1210A 白血病细胞的DBA 小鼠模型上作进一步的

硼中子捕获疗法(BNCT ) 是目前新兴的一种肿瘤治疗方法, 其原理是用热中子轰击硼(10B ) 同位素, 产生α粒子和Li +离子。这两种粒子将在组织内产生

细胞毒性药物在对肿瘤进行化疗时, 常因药物不能在肿瘤部位达到有效浓度而导致化疗失败, 同时也会增加毒副作用。FA 及其类似物与细胞毒性药物偶联, 可将药物靶向浓集于肿瘤组织, 对肿瘤进行特异性治疗, 改善药物的治疗效果。

Ladino 等通过二硫键将美登醇与FA 偶合, 形成FA 2美登醇复合物, 可对高表达FR 的细胞株(如SK 2OV 23,LoV o ,HeLa ,SW620和K B 细胞等) 有选择性杀灭作用(IC 50=10-10～10-11m ol ・L -1) 。Aronov 等[12]制备的FA 2PEG 2Pt 复合物, 与FR 阳性的M109细胞孵化时, 可明显提高铂(Pt ) 在细胞内的浓度。Paran 2jpe 等[13]合成了喜树碱(CPT ) 的FA 复合物, 可将CPT 的毒性增加16倍。

Y oo 等[14]将FA 和多柔比星(DOX ) 分别连接在PEG 链的α2和ω2端, 形成的DOX 2PEG 2FA , 对K B 细胞毒性(IC 50=5. 6μm ol ・L -1) 比DOX (IC 50=9. 8μL -1) 高。对荷瘤裸鼠尾静脉注射23d 后, 给m ol ・

予DOX 2PEG 2FA 裸鼠的肿瘤体积比给予DOX 的明显减小(40%) , 结果表明具有靶向性。4. 3　转运基因药物

K im 等[15]采用FA 载体技术, 制备了基因药物绿色荧光蛋白小干扰RNA 质粒载体2乙烯亚胺2聚乙二醇2叶酸盐(pS UPER 2siG FP 2PEI 2PEG 2FA ) , 在G BF 2K B 细胞上的基因沉默效率为90%, 而没有FA 载体

研究, 接种后的第7,8,9,11和14天给予FA 2FIT C

(1800nm ol ・α细胞因子I L 22(250ku ) 和IFN 2kg -1) 、

(75ku ) , 结果FA 2FIT C 可与细胞因子协同作用, 明显提高荷瘤动物的存活率。5　叶酸受体靶向关节炎

关节炎可引发体内免疫应答, 刺激活性巨噬细胞的生成, 而FR 在活性滑液巨噬细胞有高度表达, 提示可利用FR 对关节炎进行选择性诊断和治疗。Turk 等[18]以佐剂性关节炎小鼠为模型, 考察了FA 2

γ闪烁扫描法显示, 关节炎小鼠足EC20的靶向性。

部有EC20聚集, 但健康小鼠没有聚集。关节炎小

鼠肝和脾对EC20的摄取均有所增加, 可能是由于炎症激活了肝脾组织的巨噬细胞, FR 表达相应增加。游离的FA 可减小组织的图像密度, 说明FA 2EC20利用FR 将放射性药物或治疗药物靶向佐剂性关节炎的巨噬细胞是可行的。

Chen 等[19]设计了一种近红外荧光标记的FA

国外医学药学分册　2006年6月　第33卷第3期・181・

Deliv Rev , 2004, 56(8) :1127-1141.

探针(NIR22FA ) , 并以小鼠关节内注射脂多糖(LPS ) 造模, 测定其荧光信号。LPS 诱导踝关节炎症后48h , 分别静脉给予NIR22FA 及对照试剂游离荧光染料(剂量每只为2nm ol ・L

-1

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99m

) , 荧光信号检测结果表明

NIR22FA 在炎症部位的分布显著增加。先给予600

倍的叶酸(每只1. 2μm ol ・L -1) , 5min 后再注射NIR22FA 时, 观察到FA 竞争性抑制NIR22FA 在炎症

关节部位的分布, 增强比下降到1. 1。表明FR 介导的近红外荧光探针可特异性结合到关节炎炎症部位。因此, 可用于关节炎的诊断。

Paulosa 等[20]运用FR T c (CO ) 32DTPA 2folate as a 2receptor 2targeted radiopharma 2

ceutical[J].Nucl Med Biol , , 29(5) :569-573.

[8]e CY, athias T the tum or 2ass ociated folate

an

In 2of pteroic acid [J].J Am

, (20) :7421-7426.

, 孔　血蓝素半抗原(复合物(FA 2E DA 2FIT C ol -1kg -1, 注射时间分为诱导后1,4,7,10,16,19d , 以数字测径器测定关节大小, 结果表明,FR 介导的关节炎免疫疗法可明显改善关节炎的症状, 使发炎肿胀下降约30%。6　结语

CP , Parker M A , Vlahov IR , et al . Synthesis and biological

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99m

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近年来, 配体2受体靶向转运系统已经成为新药研发的重点。与其他配体相比FA 具有显著优势:

M r 小、稳定性好、无免疫原性、价格便宜、易于制备、

与FR 亲和力高; 同时它的应用空间更广, 可用于FR 肿瘤和炎症性疾病的诊断、治疗。但是, FR 介

+

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导的靶向给药研究, 目前大多数仅处于实验研究阶段, 临床试验尚需进一步研究。寻找更好的标记显像剂的方法, 性能更佳的双功能螯合剂; 研究适合高效的制备FA 复合物的方法、提高FA 药物复合物的稳定性、体内靶向性等是今后要解决的主要问题。FR 介导的靶向转运已经在肿瘤、关节炎的靶向诊断

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