柑橘黄酮中总黄酮及橙皮苷的含量测定

　　摘要：目的：建立柑橘黄酮中总黄酮及橙皮苷的含量测定方法。方法：采用分光光度法，以芦丁为对照品，测定总黄酮的含量，检测波长为500nm。采用高效液相色谱法测定橙皮苷的含量，色谱柱：Agilent ZORBAX c。(150ram x4.6mm,5um)；乙腈－0.1％磷酸(22：78)为流动相，检测波长为284nm，流速1ml／min。结果：分光光度法测定柑橘总黄酮在8.048－48.288mg／L(r=O.9999)的浓度范围内线性关系良好，加样回收率为101.9％。ItPLC法测定橙皮苷在0.01608－0.402g／L(r=1.0000)范围内线性关系良好，加样回收率为101.6％。结论：两种方法均准确、重现性好。适用于柑橘黄酮的质量控制。

　　关键词：柑橘黄酮；橙皮苷；紫外分光光度法；高效液相色谱法

　　中图分类号：R284

　　文献标识码：A　文章编号：1673－7717(2008)01－0044－02

　　

　　柑橘是芸香科柑橘属植物的成熟果实，其干燥果皮是药材陈皮，具有理气健脾、燥湿化痰作用。柑橘在我国有非常丰富的资源，新鲜柑橘皮中含有丰富的黄酮类物质成分，药理学研究表明黄酮成分是其有效活性成分。具有抗炎、抗氧化、抗过敏作用以及降低血液和肝脏中胆固醇的作用。柑橘黄酮(Citrus Flavonoids，cf)中主要成分橙皮苷(hesperidin)属二氢黄酮苷化合物，具有防止心脑血管疾病的作用，临床上用于防治支气管炎。本文通过用分光光度法及HPLC法测定大孔树脂法提取的柑橘黄酮中总黄酮及橙皮苷的含量，为柑橘黄酮的质量控制提供实验依据。

　　

　　1　材料与仪器

　　

　　　UV260紫外可见分光光度仪(日本Shimadzu)；LC－2010AHT(日本，$hlmadzu)；LC－Solution工作站；柑橘黄酮(citrus Flavonoids，cf)由金华贝康生物科技开发有限公司提供(大孔树脂吸附法提取)；芦丁对照品(中国药品生物制品鉴定所，0080－9705)；橙皮苷(hespeadin)对照品(中国药品生物制品鉴定所，110721－200512)；甲醇、乙腈为色谱纯，其它试剂均为分析纯。

　　

　　2　方法与结果

　　

　　2.1　总黄酮的含量测定

　　2.1.1　对照品溶液的制备称取在120℃干燥至恒重的芦丁对照品50.3mg，置25mL容量瓶中，加甲醇适量，振摇溶解后，定容至刻度，摇匀。精密量取10mL，置100mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。

　　2.1.2标准曲线制备精密量取对照溶液1.0、2.O、3.0、4.0、5.0、6.0mL，分别置25mL量瓶中，各加水至6mL，加5％亚硝酸钠溶液1mL，混匀，放置6min，加10％硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6min，加氢氧化钠试液10mL(4.3g／100ral)，再加水至刻度，摇匀，放置15min，以相应试剂为空白，在500nm波长处测定吸光度，以吸光度A为纵坐标，浓度c为横坐标，绘制标准曲线。标准曲线方程为A=10.89534C－1.4×10，r=0.9999，在8.048－48.288mg／L的浓度范围内线性关系良好。

　　2.1.3　加样回收率试验称取cf细粉0.1052g置50mL量瓶中，加甲醇约25mL，超声3rain，加甲醇稀释至刻度，摇匀，吸取2.0mL至25mL的容量瓶中，共9份，按低、中、高浓度分别加入2.1.1项下的对照品溶液2.0、2.5、3.0mL.按2.1.2项下自“加水至6mL起”同法处理。计算加样回收率，平均加样回收率为101.9％(n=6，RSD为0.4％)。

　　2.1.4　精密度试验取对照品溶液及样品溶液，于500nm处，以相应试剂为空白，测定吸收度A，每隔15rain测1次，连续测定1h，结果显示RSD为0.2％。表明显色后在1h内保持稳定。

　　2.1.5　柑橘黄酮中总黄酮含量的测定精密称取cf细粉0.1g，置50mL量瓶中，加甲醇约25mL，超声3mln，加甲醇稀释至刻度，摇匀，吸取4.0mL至25mL的容量瓶中，按2.1.3项下处理，得到的cf样品液，于500nm处测定吸收度A，计算总黄酮含量，平均含量为12.3％(n=3，RSD为0.1％)。

　　

　　2.2　橙皮苷的含量测定

　　2.2.1　色谱条件与系统适用性考察色谱柱：AglientZORBAX C zs(150ram×4.6mm，5um)；乙腈－0.1％磷酸(22：78)为流动相，检测波长为284nm，柱温35℃，流速lmL／min，进样量：10ul。橙皮苷与其它峰的分离度不得低于1.5。结果见图1。

　　

　　2.2.2　标准曲线的制备　精密吸取浓度为0.804∥L的橙皮苷对照品贮备液1.0、2.0、5.0、12.5mL，分别置25mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，以及对照品贮备液，共5个浓度，于上述色谱条件下进样分析，外标法定量，记录色谱图，以峰面积A为纵坐标，以浓度c(g／L)为横坐标，进行回归得回归方程A=1.783×10c－62.74，r=1.0000，在0.01608－0.402g／L的浓度范围内线性关系良好。

　　2.2.3　样品溶液配制精密称取Cf细粉0.1g，置50mL容量瓶中，加甲醇约25mL，超声3min溶解，放冷后，用甲醇定容至刻度，摇匀，以孔径0.45p,in微孔滤膜过滤，即为供试品溶液。

　　2.2.4　精密度试验取橙皮苷对照品溶液在上述色谱条件下连续进样6次，其峰面积的ILSD为0.8％。

　　2.2.5　稳定性试验取对照品溶液及同一供试品溶液，于0、1、2、4、6、8h分别进样测定峰面积，RSD分别为1.2％和1.5％。表明室温下保存的对照品溶液及样品溶液在8h内稳定性良好。

　　2.2.6　加样回收率试验称取已知橙皮苷含量的cf细粉25mg，精密称定6份，分别置10mL容量瓶中，分别加入橙皮苷对照品溶液(0.2573g／L)4.5、5.5、6.5mL，按2.2.3项下供试品溶液制备方法配制，同法测定，计算得平均回收率为101.6％(n=6，ILSD为1.2％)。结果见表l。从表1可见，该方法回收率满足测定要求。

　　

　　2.2.7　样品处理方法考察精密称取cf细粉0.1g。置50mL量瓶中，加入甲醇约25mL，超声2、3、5rain助溶，考察不同超声时间对待测成分溶解的影响，放冷后用甲醇定容，摇匀，以0.45um微孔滤膜过滤，于色谱条件下进样分析，记录色谱图，计算含量。结果表明，超声3min即可使待测成分完全溶解。

　　2.2.8　柑橘黄酮中橙皮苷含量测定精密称取cf细粉0.1g，置50mL量瓶中，按2.2.3项下处理后按上述色谱条件，外标法定量，计算柑橘黄酮中橙皮苷平均含量为5.72％(n=6，RSD 1.3％)。

　　

　　3　讨论

　　

　　由于黄酮类成分均有2－苯基色原酮为母核的结构，而芦丁也有此结构，因此以芦丁为对照测定柑橘黄酮中总黄酮的含量，显色条件及波长的选定均参考了文献[6]中总黄酮测定的条件。

　　HPLC法波长的选择参考了文献中橙皮苷的波长－确定，流动相的选择曾采用甲醇一水一冰醋酸(38：58：4)，但橙皮苷与相邻峰达不到基线分离，后改为乙腈－0.1％磷酸(22：78)，两个样品峰能达到基线分离，分离度达到6.6。

　　由于样品本身是提取物，样品不需前处理及进一步纯化，方法简单，而且用水提取样品与用甲醇提取样品的总黄酮含量结果一致。

　　保留时间为8.0rain的峰，由于检测条件有限，有待进一步确定成分。