衰老人胚肺成纤维细胞核转录活性的研究
・85・
衰老人胚肺成纤维细胞核转录活性的研究1
于宏升 张宗玉 (北京医科大学生化及分子生物学系, 北京 100083)
摘 要 目的 研究人胚肺成纤维细胞(简称2BS ) 核体外转录活性与代龄的关系。方法 用3H 2U TP 掺
入法研究不同代龄2BS 细胞核体外转录活性。结果 衰老2BS 细胞核转录活性较年轻组下降33%(P
, 其催化rRNA 和tRNA 合成的RNA 聚合酶(RNP ) Ⅰ和Ⅲ的转录活性下降24%(P
的RNP Ⅱ转录活性下降38%(P
关键词 转录活性 RNA 聚合酶 RNA 的转运 衰老
研究细胞衰老过程中基因表达调控在转录水平的变化, 已是衰老分子生物学的重要内容。转录是在RNA 聚合酶(RNP ) 催化下, 以DNA 为模板, 合成RNA 的全过程。我室曾观察到大鼠衰老过程中肝细胞核转录活性下降, 但其原因不十分清楚〔1〕。本文测定衰老人胚肺成纤维细胞(2BS ) 核的体外转录活性并初步探讨转录活性下降的原因。
1 材料与方法
111 细胞培养 选用18和48代龄的2BS 细胞(引自卫生部北京生物制品研究所) , 用含10%胎牛血
孔径的微孔滤膜抽滤后, 再分别用反应终止液及5%TCA各洗膜一次, 每次10ml 。烘干滤膜后浸于闪烁液中, 测定3H 2UMP 掺入RNA 中的cpm 值以表示核转录活性(cpm/mg DNA ) 。
114 核内RNA 聚合酶Ⅰ+Ⅲ(RNP Ⅰ+Ⅲ) 和RNA 聚合酶Ⅱ(RNP Ⅱ) 的转录活性测定 参照
3〕
Venugopal 〔方法。115 RNA 从核内向核外转运量的测定 正常细胞核转录系统在35℃水浴反应10min 后, 加入015ml 预冷的反应终止液(甘油12%, β2巯基乙醇215
mmol/L , EDTA 0105mmol/L ,015%Na4P 2O 7, Tris 2HCl (25mmol/L p H 810) , 混匀后用112μm 孔径的
清的DMEM (美国Sigma 公司产品) 培养液于37℃孵育箱传代培养。年轻细胞传至26±2代龄, 衰老细胞传至58±2代龄使用。112 细胞核的制备 参照Michael 的改良方法制备〔2〕。113 细胞核转录体系 在200μl 总反应体积中, 含100μl 细胞核悬液(含1g DNA/L ) 及β2硫基乙醇
215mmol/L 、MgCl 2215mmol/L 、KCl 120mmol/L 、MnCl 2116mmol/L , A TP 、GTP 和CTP 均为016mmol/L ,U TP 0106mmol/L , 3H 2U TP 2μCi (中科院上海原子能所比强为20Ci/mmol ) , Tris 2HCl 25mmol/L ,p H 718或810(年轻组为p H 810, 衰老组为p H 718) 。将混合液于35℃水浴中反应10min 后,
微孔滤膜抽滤除去已转运出核外的RNA 。经洗膜
后烘干滤膜测定cpm 值, 可算出核内RNA 中3H 2UMP 的掺入量。再将总掺入量(按方法3测定) 减
4〕
去核内掺入量, 即为转运至核外的RNA 量〔。116 核悬液中DNA 含量 用二苯胺法测定。
2 结 果
211 衰老及年轻2BS 核转录条件 从图1～图4
立即加入2ml 预冷的反应终止液(5%TCA 210
mmol/L Na 4P 2O 7) 以终止反应。反应液经012μm
1 国家自然科学基金重点项目资助(39230330)
可见两种细胞核体外转录活性在保温10min 内与
时间成正比关系, 故选用10min 为最适反应时间; 最适核浓度选1g DNA/L ; 最适温度选用35℃; 但最适p H 值年轻2BS 选810, 衰老2BS 则选用718。212 衰老与年轻2BS 细胞核转录活性的比较 如表1所示, 衰老细胞核转录活性较年轻降低约33%(P
213 衰老及年轻2BS 细胞核内3种不同的RNP 所
作者简介:于宏升, 男,37岁, 讲师, 硕士研究生, 现在内蒙
古医学院, 从事衰老分子生物学研究
张宗玉, 女,62岁, 教授, 博士生导师, 从事衰老分子生物学研究
致的转录活性 结果如表2所示, 衰老细胞核中催化mRNA 合成的RNP Ⅱ转录活性较年轻的下降了38%, 差异非常显著(P
・86・图1 酶促反应时间与年轻、衰老2BS
细胞核转录活性的关系
图3 温度对年轻、衰老2BS
细胞核转录活性的影响
图4 pH 值对年轻、衰老2BS 细胞核转录活性的影响
图2 年轻、衰老2BS 细胞核核浓度
与其转录活性的关系表1 年轻及衰老2BS 细胞核体外
转录活性的比较(x ±s )
细胞年轻衰老
n
表2 年轻及衰老2BS 细胞核内不同RNA 聚合酶
所致转录活性的比较(x ±s )
细胞
%10067
n
RNA 聚合酶Ⅱ3916±41842417±51911)
RNA 聚合酶Ⅰ+Ⅲ
1717±41132)
(103cpm/mg DNA ) (103cpm/mg DNA )
转录活性(103cpm/mg DNA )
5918±91761)
4011±9167
55
年轻
衰老
55
1) P
1) P
及tRNA 合成的RNP Ⅰ和Ⅲ所致的转录活性, 衰老
2BS 较年轻的下降24%(P
以上结果显
示衰老2BS 核内各种RNP 催化的转录活性都有所降低, 但RNP Ⅱ催化的转录活性的下降, 比RNP Ⅰ和Ⅲ更为明显。
表3 年轻及衰老2BS 细胞核内RNA 向核外的转运(x ±s )
细胞年轻
衰老
n
总转录活性
91122±710146102±9109
1)
3
核内掺入量
50120±71661)
3
转运到核外掺入量
40190±91352)
3
占总百分率
() 4529
55
1) P
・87・
214 衰老2BS 细胞核内RNA 合成后向核外的转RNA 转出量占总合成量的29%, 大大低于年轻细
运 衰老2BS 细胞核内RNA 向核外转运量仅占总合成量的29%, 而年轻2BS 细胞却占45%。因此, 不论从核总转录活性、核内掺入量以及转运至核外的掺入量看, 衰老细胞都较年轻细胞有显著性差异(P
3 讨 论
胞的45%。为什么RNA 的转运随代龄变化出现上
述改变, 这是否为适应年轻细胞生长发育的需要或衰老过程中转运机制受到不同程度的影响, 有待进一步的研究。
4 参考文献1 童坦君, 张宗玉主编1医学老年学1北京:人民卫生出
版社,1995:85298
2 Michael EG , Edward BZ 1Stimulation of 3T3cells induces
trans cription of the c 2fos oncogene 1Nature , 1984; 311(4) :433
3 Venugopal J , K alluri Subba Rao 1G ene expression in
different cell types of aging rat brain 1Neurochemis 2try ,1991;56(3) :812
4 杜延顺, 张宗玉, 张昌颖1大鼠肝细胞核体外转录活性
本文应用3H 2U TP 掺入法研究了衰老2BS 细胞
核的体外转录活性, 观察到转录活性随增龄而下降。RNP Ⅰ与RNP Ⅱ在衰老2BS 细胞中所致的转录活性均下降。这与我室以往研究结果一致〔4〕。已有报道RNP Ⅱ所致转录的mRNA 合成量有年龄相关性减少, 并且比tRNA 和rRNA 下降得更为显著, 虽然所用材料是衰老大鼠的组织细胞, 但其结果与我们的相近。有的学者〔5〕把mRNA 水平高低作为评价衰老的重要参数, 因为它在基因信息传递中起重要作用。
真核生物RNA 合成后还须从细胞核转运到胞浆才能行使其生物学功能, 所以RNA 的核外转运问题也是真核生物基因调控的重要方面, 但有关研究报道较少。我们的结果表明, 衰老2BS 细胞核
随增龄变化的研究1北京医科大学学报,1990;22(4) :
252
5 Richardson A , Maria C , Sparks B et al 1The transcrip 2
tion of various types of ribonucleic acid by hepatocytes iso 2lated from rats of various ages 1J G erontol ,1982;37(6) :666
〔1997203226收稿 1997209221修回〕
(编辑 曲 莉)
・128・
3
By means of incorporation of H 2U TP ,changes in RNA synthesis of nuclei were determined at senescent hu 2
() man diploid fibroblast 2BS . It was found that the rate of RNA synthesis of senescent cell nuclei decreased 33%in
comparison with young cell. Using α2amanitin to preferentiallly inhibit the different types of RNA polymerases re 2ponsible for the three classes of RNA , the synthesis of RNA and tRNA by polymerase Ⅰ+Ⅲdecreased 24%, the synthesis of mRNA by polymerase Ⅱdecreased 38%with aging ,while with significant difference statistically. The transport of RNA from nuclei to cytoplasm was examined , a reduction was observed with aging.
K ey Words RNA synthesis RNA polymerase Transport of RNA Aging
Age 2related changes in RNA synthesis in isolated human fetal lung f ibroblast(2BS) nuclei Yu H ongsheng , Zhang Zongyu
B eijing Medical U niversity , B eijing 100083
(Original paper see page 85)
A hybrid anti 2tumor B72. 3antibody/Metallothionein protein B72. 3M T 21was produced by the construction of the expression vector mpsv2neo 2EP12B72. 3M T 21. This vector contained the neo gene as a selection marker , the murine immunoglobulin promoter and enhancer , and the hybrid B72. 3heavy chain gene fragment with mouse met 2allothionein 21cDNA gene ligated into its CH2domain. The ex pression vector was transfected to the heavy chain loss mutant B72. 3mut (k ) cell line. The hybrid protein B72. 3M T 21was purified from transfectant supernantes using a protein G column. We showed that the hybrid protein retained the binding reactivity for the TA G 72antigen as the original B72. 3antibody , and the metal binding capacity of the mative metallothionein molecule. Therefore , the bifunctional hybrid protein B72. 3M T 21may be very useful in cancer imaging when labeled with radionuclides such as 99m Tc.
K ey Words McAb M T Hybrid molecule B72. 3
(Original paper see page 88)
Production of a bif unctional hybrid molecule B72. 3/Metallothionein 21by protein engineering Xu Zheli , K ong Xiangbo ,Ma Q ingjie et al
The Third Clinical College , Norman B ethune U niversity of Medical Sciences , Changchun 130031
The present research explored the mechanisms that mDSS im proves learning and memory of the mice with de 2mentia. Cultured hippocampal neurons were used as a model for observing morphological changes of the neurons af 2ter mDSS 2sera ,from the mice with senile dementia was added. The results showed that mDSS canprolong survival time of the hippocampal neurons ,and raise the ratio of neurons with processes in survival neurons , and can not af 2fect the size of the cell bodies ,suggesting that mDSS improving learning and memory is possibly associated with the recipe promoting survival and process growth of the hippocampal neurons.
K ey Words Dangguishaoyaosan Senile dementia Hippocampal Neuron culture
(Original paper see page 90)
E ffects of modif ied Dangguishaoyaosan(mDSS) on cultured hippocampal neurons Luo H uanmin ,Yao Zhibin , Xie Yao et al B rain Lab ,SUMS , G uangzhou 510089
The purpose of our study was to explore the mechanism of V E to treat Alzheimer ’s disease (AD ) . AD model rats was treated by V E with 5mg/100g body 2weigh/d ,po. The alternation of rats behavior ,the number and the av 2erage area as well as absorbance (ASO ) of AP 2Li neurons and β2AP depositing in CA1region of hippoampal forma 2tion of AD model rat ’s by the methods of behavior test ,light microscope morphological observation as well as im 2munocytochemical combining image analysis. The results showed that V E could im prove the AD model rat ’s ability of learn and memorizing , which mechanisms were achieved by preventing β2AP from depositing and clearing de 2posited β2AP. The studies give a histological support for the usage of V E treating AD in the clinic.
K ey Words Vitamin E Alzheimer ’s disease Rat
(Original paper see page 95)
E ffect of VE on Alzheimer ’s disease model rat Yang Jie , Q ian Yi , H u H aitao et al
Department of Anatomy , Xian Medical U niversity , Xian 710061