微生物原生质体融合育种技术及其应用
中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2010,30(1):93297
微生物原生质体融合育种技术及其应用
毛 雨 王 丹
1
2,3
3
黄占斌
133
邢建民
2
(1中国矿业大学(北京) (2中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室 北京 100049)
摘要 。微生物原生质体融合(microbialprotoplastfusi,
。结合相关研究进展,分析了原生质体融合技术的组成,包括制备、再生、融合的影响因素以及融合子的筛选方法,重点评述了原生质体融合技术应用在微生物育种中的最新进展,以及微生物原生质体融合技术的发展前景。关键词 微生物 原生质体融合 遗传育种 基因组重组
中图分类号 Q933
微生物菌种是发酵工业中的一个关键因素,它决定了发酵过程的成败及某一发酵产品是否具有工业化价值。自然界中的原始菌株大多不具有很高的工业化价值,因此需要对菌株进行选育和改良,以提高产品的质量,降低成本。原生质体融合技术是起源于20世纪
60年代的一项重要的菌种改良技术,是将亲株细胞分
及其遗传标记选择,双亲本原生质体制备和再生,亲本原生质体诱导融合,融合重组体筛选,遗传特性分析和测定
[3]
。
1.1 原生质体的制备和再生
原生质体的制备首先要去除细胞壁,当前去壁的方法主要有机械法、非酶法和酶法,现在使用较多的为酶法。在放线菌和细菌中,主要采用溶菌酶,酵母菌和霉菌一般用蜗牛酶、消解酶或纤维素酶等。影响原生质体制备和再生的因素很多:在菌龄上,为了使细胞易于原生质体化,一般选择对数生长期或生长中期的菌体,也有的采用生长后期的菌。酶浓度以及作用时间也会影响原生质体的制备和再生率,一般来说酶浓度越高,作用时间越长,原生质体制备率就越高,但酶解时间过长又会影响再生率。对于不同的菌体,优化其最适酶浓度和作用时间非常必要。本实验室在琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)的原生质体制备和再生实验中发现采用对数生长中期的菌更易于原生质体化,在酶解琥珀酸放线杆菌(A.succinogenes)过程中,最适的酶浓度大大低于其他革兰氏阴性菌,且最佳酶解时间较短,原生质体的再生率高。另外,菌体的预处理,酶的处理温度,渗透压稳定剂等都会影响微生物原生质体的制备和再生。
1.2 原生质体的融合
别去除细胞壁后进行融合,经基因组间的交换重组,获得融合子的过程
[1]
。与其他育种技术相比,原生质体
融合技术具有重组频率高、受结合型或致育型限制小以及遗传物质传递完整且不需要完全了解作用机制等优点,因而被国内外微生物育种学者广泛应用。 1974年,匈牙利的Ferenczy
[2]
成功将白地霉
(Geotrichumcandidum)营养缺陷型突变株的原生质体
进行融合,使原生质体融合技术首次应用于微生物中。接下来的几十年,该技术的基本实验方法逐步完善,现已作为一项十分有用的技术广泛应用于工业微生物菌种选育中。本文就原生质体融合技术的过程及其应用于微生物育种方面的最新进展做了简要综述,并分析了目前存在的问题及未来的发展方向。
1 原生质体融合技术
原生质体融合技术一般分成五大步骤:直接亲本
收稿日期:2009209209 修回日期:2009211205
3国家“863”计划(2006AA100205)资助项目33通讯作者,电子信箱:[email protected]
由于在自然条件下,原生质体发生融合的频率非
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中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVol.30No.12010
常低,因此在实际育种过程中要采用一定方法进行人为诱导融合。在微生物原生质体融合中,诱导融合方
2+
法主要有化学法(一般采用PEG结合高Ca、pH诱导
质体时,向酶解液中加入不同荧光色素,使双亲原生质体在特定波长下呈现不同颜色,原生质体融合后,直接选出带有两色荧光的融合子即可。龙建友等
[7]
将链霉
法)、物理法(包括电融合和激光诱导融合法等)。 当用PEG法诱导原生质体融合时,很多因素影响融合频率。如PEG聚合度、PEG浓度和作用时间、离子种类和浓度、融合剂pH、温度等。一般来说相对分子质量为100026000的PEG都是有效的,PEG的浓度为
30%～50%,不同相对分子质量的PEG素No.24菌株原生质体带上酚藏花红荧光标记,将其诱变株Ms224菌株原生质体带上伊文思蓝荧光标记,融合后,1.。袁耀武等
[8]
量分数时是同效的。,、+
+
+2将能氧化邻苯二胺的酿酒
有助于融合,而KPEG溶液一加入,,但由于PEG有一定的毒性,因而大部分学者认为PEG处理时间一般控制在1～10min即可。
1.3 融合子的筛选
1.3.1 利用营养缺陷型标记筛选融合子 融合双亲
酵母(S.cerevisiae)及具有分解尿素能力的粟酒裂殖酵母(S.pombe)融合,利用二者的生理特征进行显色反应,从而筛选融合子。
1.3.6 利用其他标记筛选融合子 利用DNA水平上
的分子标记或DNA含量、氨基酸含量等生化指标来选择融合子,对具有能直接观察的形态学差异的菌株也可通过形态差异来选择融合子。赵航等
[9]
为不同的营养缺陷型,原生质体融合后于基本培养基进行培养。由于双亲都丧失了合成某种物质的能力,在基本培养基上不能生长,而在融合子中,缺陷的遗传物质得到互补,所以可在基本培养基上长出菌落,利用这种方法即可检出融合子。Dai等
2
[4]
在稗突脐蠕
孢菌(Exserohilummonoceras)和弯孢菌(Curvularia
lunata)融合实验中,根据菌落形态及大小筛选出了孢
子产量高、代谢产毒能力强的融合子。
以大肠杆菌
2
(Escherichiacoli)W4183(Arg)及Fu2021(Leu)为亲本
2 原生质体融合技术的应用进展
2.1 提高代谢产物的产量和质量
进行融合,在不加Arg、Leu的培养基上筛选出融合子。
1.3.2 利用抗药性标记筛选融合子 微生物的抗药
原生质体融合常用于抗生素高产菌株的选育,特别是在链霉素育种中。Xu等
[10]
性是由遗传物质决定的,不同种微生物对同种药物的抗性存在差异,利用这种差异即可对融合子进行筛选。杨合同等
[5]
以始旋链霉菌(S.
pristinaespiralis)CGMCC0957突变菌中普纳霉素产量最
将带有抗苯菌灵标记的哈茨木霉菌株高的四株菌为亲本进行原生质体融合,得到普纳霉素产量比亲本高89.4%,达到0.89g/L的优良菌株。Jin等
[11]
(Trichodermaharzianum)T9和带有潮霉素B标记的康
宁木霉菌株(T.koningii)Tk7a进行原生质体融合,用含有苯菌灵和潮霉素B的平板筛选,得到带有两亲本共同抗性的融合子。
1.3.3 利用灭活标记筛选融合子 通过灭活标记筛
以10株产量较高的多杀菌素产生菌
Saccharopolysporaspinosa为出发菌株,经过融合,得到高
产菌株S.spinosa4～7,其产量可达到547mg/L,较出发菌株提高了200.55%以上,在5L发酵罐中发酵
168h,多杀菌素产量可达到428mg/L。
选融合子是指将单亲或双亲的原生质体经紫外线照射、加热或经过某些化学药剂处理,使其丧失在再生培养基上再生的能力,两亲株融合后,融合子损伤互补,因而可在再生培养基上存活。骆健美等
[6]
在酶制剂产生菌的选育研究中,原生质体融合技术也应用广泛。主要用于提高菌种产酶活力。Khattab等
[12]
将两株高产将Aspergillusniger黑曲霉经过紫外或EMS诱变
褐黄孢链霉菌(StreptomycesGilvosporeus)SG2200221和
SG2200222的原生质体分别经过紫外灭活和热灭活后
后,筛选出胞外葡萄糖氧化酶(GOD)活性最高的突变株进行融合,得到的融合子C215、C21、C218的GOD活性达到了61.4U/ml、60.8U/ml、62.7U/ml,较初始菌分别提高了386.2%、382.4%、394.3%。
原生质体融合技术在构建各种代谢物高产菌株方面的应用也十分普遍。Yu等
[13]
融合,形成能够生长繁殖的融合子。这种方法省略了对双亲株的遗传标记,使工作量大大降低,还避免了亲本特性的改变。
1.3.4 利用荧光染色标记筛选融合子 在制备原生
以鼠李糖乳杆菌
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毛 雨等:微生物原生质体融合育种技术及其应用
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(Lactobacillusrhamnosus)Lr2WT的诱变优良菌为出发合菌。
2.4 改良菌种的遗传特性
菌,通过双亲灭活,用碳酸钙高糖平板筛选有效融合子,得到具有耐糖和高产两个表型的改良菌株F222,在初糖浓度150g/L发酵罐中,F222的乳酸产量为
140g/L,是野生菌的1.8倍。2.2 提高菌株降解能力
每个菌株都具有某方面优良性状,通过原生质体融合技术将具有所需性状的两亲本进行遗传物质重组,即可获得兼具两亲本优良性状的新菌株。L