1种快速高效提取乳酸菌质粒的方法

第9期

2014年9月

第14卷

中国食品学报

Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology

Vol．14No．9Sep ．2014

1种快速高效提取乳酸菌质粒的方法

张

波1，2

李

23

晨1，2董慧1，2寇田田1，2许文涛3田洪涛

1，2*

罗云波3

（1河北农业大学食品科技学院河北保定071001

河北保定071001北京100083）

河北省农产品加工工程技术研究中心

中国农业大学食品科学与营养工程学院

摘要根据碱裂解提取大肠杆菌质粒的原理与程序，借鉴Anderson 和O ’Sullivan 的乳酸菌质粒提取方法，使酶

解破壁和碱破膜变性相结合，通过优化乳酸菌质粒提取中酶浓度、酶解时间、质粒沉淀条件，提出1种高效提取乳酸菌质粒的方法。在此基础上，分析并检验该方法提取乳酸菌质粒的适用性、效率和质粒质量。结果表明：采用该方法可提取乳球菌及乳杆菌中的质粒，所提取的乳酸菌质粒不受质粒大小及拷贝数高低的影响，乳酸菌质粒的检出率和提取的成功率显著提高；提取的乳酸菌质粒达到DNA 纯化后的水平，可用于酶切等分子生物学操作。操作实践表明：该方法适合乳酸菌质粒的小量提取（1.5～2mL 菌液）到中量提取（10mL 菌液）；其操作周期与大肠杆菌质粒提取检测彼此相当，而比Anderson 和O ’Sullivan 提取检测乳酸菌质粒缩短3～4h 。本文还就乳酸菌质粒提取中的主要原理及注意事项进行探讨，以期为进一步开发乳酸菌质粒分离纯化试剂盒提供理论依据。关键词文章编号

乳酸菌；质粒提取；简单快速；稳定高效；方法

1009-7848（2014）09-0007-07

乳酸菌（LAB ，Lactic Acid Bacteria ）促进人和动植物体健康的功能性已被世人公认，在食品、医药和饲料工业中占有越来越重要的地位[1]。鉴于乳酸菌的重要生理功能和广泛应用，目前对乳酸菌的研究已进入分子生物学和基因工程时代。

质粒（Plasmid ）[2]是在细菌细胞中染色体之外，能够自主复制的共价闭合环状双螺旋的DNA 分子或遗传因子。继Cords 等人[3]在乳酸菌（链球菌

取过程中易断裂[4]，这些都给乳酸菌质粒提取带来很大困难。

Anderson 等[5]提出提取乳球菌大质粒的方法，

其采用适合的生长和裂解条件，将碱变性和热变性相结合，利用氯化铯密度梯度离心纯化质粒，取得了较好的效果。Klaenhammer [6]等开发了提取乳杆菌质粒的一般方法；O ′Sullivan 和Klandhammer [7]提出小量提取乳球菌和乳杆菌质粒的方法；Os -

N 群）中发现质粒后，研究发现质粒不仅编码乳酸

菌的功能性基因，也是目前乳酸菌分子生物学和基因工程中的重要载体。质粒的提取效果直接关系到后续酶切、连接、转化、克隆与表达等操作的成败。

乳酸菌属于革兰氏阳性菌，与阴性菌相比，其刚性细胞壁厚且致密，破壁困难。一些乳酸菌的天然质粒拷贝数低，质粒大小存在差异，大质粒在提

收稿日期：2013-08-30

基金项目：国家高技术研究发展计划（863计划）项目（No ．

man 等[8]比较了乳酸菌质粒不同提取方法，并对提

取条件进行优化。

目前许多实验室采用Anderson 和O ′Sullivan 的方法提取乳球菌和乳杆菌的质粒。Anderson 的方法需要特殊试验材料，如：氯化钠饱和苯酚、异戊基氯仿乙醇等，而O ′Sullivan 的方法需要使用剧毒物质溴化乙锭，这些都限制了该两种方法的广泛应用。此外，这两种方法操作繁琐、耗时较长；提取质粒的电泳条带模糊，很难达到后续回收、酶切、连接等分子生物学要求；对于某些拷贝数偏低的质粒很难达到预期提取效果。鉴于此，探寻简单、快速、稳定、高效提取乳酸菌质粒的方法，是目前乳酸菌分子生物学研究和基因工程发展中亟待

2006AA10Z317）

作者简介：张波，男，1986年出生，硕士生通讯作者：田洪涛

8

中国食品学报

2014年第9期

解决的主要课题之一。

本文根据碱裂解提取大肠杆菌质粒的原理与程序[9]，借鉴Anderson 和O ′Sullivan 的乳酸菌质粒提取方法，使酶裂解和碱裂解相结合，通过优化乳酸菌质粒提取的重要条件与步骤，提出1种简单、快速、稳定的提取乳酸菌质粒的方法。在此基础上，分析检验该方法提取乳酸菌质粒的适用性、效率和质粒质量。以期为进一步开发乳酸菌质粒分离纯化试剂盒提供理论依据。

杆菌单菌落，接种至10mL 液体培养基中，37℃培养至对数末期或稳定期。根据需要在培养基中加入终质量浓度为5μg/mL的红霉素。

2）收集细胞：取2mL 培养物倒入微量离心管中，在4℃下12000r/min离心1min ，离心结束

后，尽可能吸干培养液。若菌浓度低时，则在第1次离心集菌后，在含有菌体沉淀的离心管中再次进行2mL 培养物集菌，每个微量离心管集菌不超过5次。

1

1.1

材料与方法

材料

试验菌种和菌株

3）洗涤细胞：加入500μL 冰预冷的Solution Ⅰ，漩涡剧烈振荡，洗涤菌体；4℃下12000r/min

离心1min ，弃上清。

1.1.1

1）乳球菌：乳酸乳球菌ML23[10]（Lactococcus lactis ），含质粒pMG36e （3.6kb ）；嗜热链球菌05-32[11]（Streptococcus thermophilus ）99241（分离自国内发酵乳制品），含质粒pQC1（4.5kb ），pQC2（3. 5kb ）。

2）乳杆菌：瑞士乳杆菌05-29（Lactobaccillus helveticus ）AS 1.1877T （购自中科院微生物所）[12]，含质粒pLH2（5.7kb ），pLJ1（3.29kb ），pLH4（2.6kb ）；植物乳杆菌07-191[13]（Lactobacillus plantarum ）AS.1.2986（购自中科院微生物所），含质粒pL2000

（2.0kp ），pL9000（9.0kp ）。

4）酶解破壁：加入200μL 4℃融化的Solu -tion Ⅱ，反复颠倒混均，37℃温浴10～90min 。5）破膜变性：加入400μL 新配制的冰冷的Solution Ⅲ，盖紧管口，快速轻柔颠倒5～6次。6）质粒复性：加入300μL 冰预冷的Solution -IV ，盖紧管口，轻柔颠倒5～6次，使溶液在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，冰浴3～5min 。

7）收集上清：4℃下12000r/min离心5min ，吸取上清液至一个1.5mL 离心管中。

8）酚仿抽提：先加入上清液1/2体积的Tris-苯酚饱和溶液，再加上清液1/2体积的氯仿/异戊醇[24∶1]，轻柔颠倒混匀；4℃下12000r/min离心

1.1.2主要试剂及药品Solution Ⅰ：6.7%蔗糖，25mmol/LTris-Cl （pH 8.0），30～50mmol/LEDTA

（pH 8.0）。121℃灭菌20min 。

5min ，吸取上层水相清液至另一个1.5mL 离心管

中。

9）沉淀质粒：加入等体积的冰冷的异丙醇充

分颠倒混匀；-20℃放置30min 。4℃下12000r/

SolutionII ：采用无菌操作，在Solution Ⅰ中添

加20~50mg/mL的溶菌酶，-20℃保存备用。

Solution Ⅲ：0.2mol/LNaOH ，3%（m/V）SDS ；该

溶液现用现配制。

Solution Ⅳ：60.0mL 5mol/LKAC ，11.5mL 冰HAC ，28.5mL 去离子H 2O ，4℃保存备用。

Supercoiled DNA ladder marker 、DL5000DNA ladder marker 、限制性核酸内切酶Xba I ，Pst I ，Nhe I ，Eco RI ，Hind III ，购自TaKaRa 生物工程（大

连）有限公司；溶菌酶购自美国Amresco 公司；

min 离心5min ，弃上清液。

10）洗涤质粒：加入冰冷的500L ～1mL 70%乙醇洗涤质粒2次。

11）质粒干燥：将离心管置于37℃温箱中，风干10～15min 。

12）质粒溶解与RNA 消化：加入20μL ～25μL TE 缓冲液溶解质粒DNA ，再加入1μ～2μL 10mg/mLRnaseA 溶液；37℃水浴消化30min ；电

泳检测或-20℃保存。

RNaseA 购自上海生工。1.2方法1.2.1

乳酸菌质粒的提取

1.2.2乳酸菌质粒提取中重要条件的优化

1）挑取单菌落与细胞培养：挑取乳球菌或乳

1）溶菌酶浓度对质粒提取的影响在Solu -tion Ⅰ中分别添加20，30，40，50mg/mL的溶菌酶，制成Solution Ⅱ的溶菌酶浓度梯度溶液，以含质粒

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1种快速高效提取乳酸菌质粒的方法

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pMG36e 的乳酸乳球菌ML23为试验菌株，根据1.2.1节方法提取乳酸菌质粒，当分别加入不同溶

菌酶浓度的Solution Ⅱ后，37℃温浴60min ；异丙醇-20℃醇沉30min 。

节。采用不同溶菌酶浓度梯度的Solution Ⅱ溶液对试验菌株ML23进行破壁以及质粒提取与检测，探明在乳酸菌质粒提取中破壁的溶菌酶最适浓度，结果见图1。

2）溶菌酶温育时间对质粒提取的影响选

[***********][**************]7

M 1234

择40mg/mL溶菌酶浓度的Solution Ⅱ，根据1.2.1节方法提取ML23中的质粒pMG36e ，当加入So -

lution Ⅱ后，37℃分别温浴10，30，60，90min ；异丙醇-20℃醇沉30min 。电泳检测。

3）加入异丙醇后的放置条件对质粒提取的影响根据1.2.1节方法提取ML23中的质粒pMG36e ，选择40mg/mL溶菌酶浓度的Solution Ⅱ，37℃温浴60min ；当加入异丙醇后，分别于室温、冰上、-20℃醇沉30min 。电泳检测。1.2.3

乳酸菌质粒提取的适用性和效率分析———

利用条件优化后的方法提取并检测乳酸菌质粒根据1.2.3节优化的条件与1.2.1节和1.2.2节的方法，以O ′Sullivan 的方法作为对照，选取典型的

注：M ：supercoiled DNA ladder marker ；1，2，3，4：溶菌酶质量浓度分别为20，30，40，50mg/mL所提质粒。

图1溶菌酶质量浓度对质粒提取效果的影响

Fig.1The effection of lysozyme concentration to plasmid extraction from lactic acid bacteria

2株内含质粒的乳球菌和2株内含质粒的乳杆菌

为试验菌株，进行质粒提取和检测。

由图1结果可见，ML23分别经20，30，40，50

mg/mL溶菌酶Solution Ⅱ破壁后所提取的质粒，电

泳条带的亮度随溶菌酶浓度的增加而提高；当溶菌酶质量浓度达到40，50mg/mL时，质粒提取效果最佳，考虑到成本因素，确定溶菌酶破壁的最适质量浓度为40mg/mL。

1.2.4乳酸菌质粒提取的质量分析———质粒浓度

与纯度检测及酶切特性分析

1）质粒的浓度与纯度检测根据1.2.2节优

化的条件与1.2.1节的方法，提取4株乳酸菌试验菌株的质粒，将所得的4株菌质粒分别以TE 缓冲

液稀释1000倍，利用紫外分光光度计检测质粒

2.1.2溶菌酶温育时间对质粒提取的影响根据

DNA 在260nm 和280nm 处的吸光值，按公式计

算A 260×稀释倍数×50μg/mL，分析质粒DNA 的浓度与纯度。

2.1.1节试验结果，选择含40mg/mL溶菌酶的So -lution Ⅱ对试验菌株ML23进行破壁，37℃分别温

浴不同时间，考察在乳酸菌质粒提取中溶菌酶破壁的适宜时间。结果见图2。

M

[***********][**************]7

注：M ：supercoiled DNA ladder marker ；1，2，3，4：溶菌酶作用时间为10，30，60，90min 所提质粒。

2）质粒的酶切特性分析根据1.2.2节优化的条件与1.2.1节的方法，提取试验菌株乳酸乳球菌ML23的质粒，对质粒分别进行限制性核酸内切酶XbaI ，PstI 单酶切以及NheI 和EcoRI ，NheI

和Hind III 双酶切，电泳检测质粒酶切后的DNA 片段。

1234

2结果与分析

2.1乳酸菌质粒提取中重要条件的优化

2.1.1溶菌酶浓度对质粒提取的影响乳酸菌为

革兰氏阳性菌，细胞壁厚，交联度大，不易破壁。因此，溶菌酶破壁是乳酸菌质粒提取的首要关键环

图2溶菌酶作用时间对质粒提取的影响

Fig.2The effection of processing time of lysozyme

to plasmid extraction from lactic acid bacteria

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图2结果看出，ML23经40mg/mL溶菌酶的

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Solution Ⅱ破壁并在37℃下分别温浴10，30，60，90min 所提取的质粒，电泳条带的亮度随温育时间的延长而增加；当温育时间≥60min 时，质粒电泳条带的亮度到达最大。因此，利用40mg/mL溶

菌酶的Solution Ⅱ破壁时，确定37℃温浴的适宜时间为60min 。

[***********][**************]7

M 123

2.1.3异丙醇醇沉温度对质粒提取的影响前人

的研究表明：菌体经溶菌酶破壁、SDS 破膜变性、酚氯仿抽后，质粒溶于水相中，加入异丙醇沉淀质粒的温度有3种：室温、冰上与-20℃。上述3种异丙醇沉淀质粒的条件，究竟哪种对沉淀质粒更有效，以ML23为试验菌株予以探究。结果见图3。

图3结果显示，在加入异丙醇后分别在3种温度下沉淀所提取的ML23菌株质粒，电泳条带的亮度在-20℃放置30min 时达到最大。因此，确定加入异丙醇沉淀质粒的适宜条件为-20℃醇沉

注：M ：supercoiled DNA ladder marker ；1，2，3：加入异丙醇后分别于室温、冰上、-20℃条件下放置30min 。

图3异丙醇处理条件对质粒提取的影响

Fig.3The effection of processing conditions

acid bacteria

of isopropanol to plasmid extraction from lactic

30min 。

2.2乳酸菌质粒提取方法的适用性和效率分

析———利用条件优化后的方法提取并检测乳酸菌质粒

为明确作者提出的乳酸菌质粒提取方法的适

bp 11849

[***********][1**********]

M

1

2

3

4

用性和高效性，以O ′Sullivan 的方法作为对照，选取典型的2株内含质粒的乳球菌ML23、05-32和

2株内含质粒的乳杆菌07-191、05-29为试验菌株，进行质粒提取和检测。结果见图4和图5。

bp [***********][**************]7

M

1

2

3

4

注：M ：supercoiled DNA ladder marker ；1，2，3，4：ML23、05-注：M ：supercoiled DNA ladder marker ；1，2，3，4：ML23、05-

29、05-32、07-191质粒提取。29、05-32、07-191质粒提取。

图4O ′Sullivan 建立方法提取各类乳酸菌质粒图5优化后的方法提取各类乳酸菌质粒

Fig.4Plasmid extraction from kinds of lactic acid bacteria with the method established by O ′Sullivan

Fig.5Plasmid extraction from kinds of lactic acid

bacteria with the optimization method

图5结果可见，采用作者提出的优化后的乳酸菌质粒提取方法，均可从乳酸乳球菌ML23、和嗜热链球菌05-32、植物乳杆菌05-29、瑞士乳杆菌07-191中提取大小范围为2～10kb 的天然质粒或外源质粒。根据文献已知[11，14]：嗜热链球菌的

2个天然质粒拷贝数很低，运用前人的方法提取

检测这2个质粒，常出现电泳条带模糊甚至无电泳条带的现象，而利用作者建立的方法提取检测这2个质粒，电泳条带清晰明亮，说明：该方法同样适用于提取低拷贝数的乳酸菌质粒。

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1种快速高效提取乳酸菌质粒的方法

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与图4相比，图5中的电泳条带普遍清晰明亮，且均为超螺旋形式，表明作者提出的方法较

bp [***********][1**********]100

M 1234

O ′Sullivan 的方法，可显著提高检出率和成功率。

根据操作实践，利用本方法进行乳酸菌质粒提取检测的操作周期，较Anderson 和O ′Sullivan 的操作周期缩短3～4h ，可明显提高操作效率。

综上可见，我们建立的方法是一种简单、快速、稳定、高效的提取乳酸菌质粒的方法。

2.32.3.1

乳酸菌质粒提取的质量分析

质粒的浓度与纯度检测及内切酶特性分析

注：M ：DNA marker DL5000；1，2，3，4：pMG36e 经XbaI 单酶切，PstI 单酶切，经NheI 、Hind III 双酶切，NheI 、

不同乳酸菌所含质粒数目不同、每个质粒的大小和拷贝数也不相同[4]。根据2.1节条件优化结果和1.2.1节方法提取4株乳酸菌质粒；测定乳酸菌质粒的A 260和A 280，计算A 260/A 280及质粒浓度，结果见表1。

EcoR Ⅰ双酶切。

图6质粒pMG36e 的酶切图

Fig.6Plasmid pMG36e digested

法所提取的乳酸菌质粒，纯度较高，达到了质粒

表1

质粒浓度与纯度检测

Table 1Detect the concentration and purity

of the plasmid A 260

A 2800.1120.1070.1320.111

A 260/A 2801.8481.8501.9841.838

质量浓度/·mg mL -1

DNA 纯化后的水平，可用于后续分子生物学操

作。

3讨论

本方法的细胞洗涤溶液Solution Ⅰ为TES ，借

ML2305-2905-3207-191

0.2070.1980.2620.204

10.359.9013.1010.24

鉴了Anderson 方法的Solution Ⅰ而对大肠杆菌质粒提取方法的Solution Ⅰ进行了改进，不仅将An -

derson 方法中6.7%蔗糖取代了大肠杆菌质粒提取

方法中50mmol/L葡萄糖，可以有效防止大于15

kb 的大质粒在细胞裂解时受损；将EDTA 的浓度

表1结果看出，通过控制集菌获得的菌体量，质粒浓度均可以达到10mg/mL左右，质粒的A 260/

由Anderson 方法的提高至30mmol/L～50mmol/L，能够有效螯合金属离子，避免菌体裂解后释放的

A 280比值均在1.8～2.0之间，表明：采用作者建立

的优化后的方法所提取的乳酸菌质粒，纯度较高，质量良好，达到了质粒DNA 纯化后的水平。

DNA 酶对质粒DNA 的降解。由于乳酸菌为革兰

氏阳性菌，细胞壁厚而致密，肽聚糖含量高，交联度大。作者借鉴O ′Sullivan 的方法，将溶菌酶浓度由Anderson 的10mg/mL提高至30～50mg/L；溶菌酶缓冲液仍采用本方法中的细胞洗涤溶液So -

2.3.2质粒的内切酶特性分析质粒的内切酶特

性是定性检测质粒DNA 纯度的重要指标。根据

2.1节条件优化结果和1.2.1节方法提取ML23中

质粒pMG36e [15]；再按1.2.5节（2）方法对乳酸菌质粒进行限制性核酸内切酶XbaI ，PstI 的单酶切以及NheI 和EcoR I ，NheI 和Hind III 的双酶切。结果见图6。

图6结果显示，质粒pMG36e 经限制性核酸内切酶酶切后，酶切片段的电泳条带清晰可见，且符合预期大小。说明：采用作者提出的优化后的方

lution Ⅰ，取代了Anderson 的溶菌酶缓冲液（25

mmol/LTris-Cl[pH8.0]）和O ′Sullivan 的溶菌酶缓冲液（25%蔗糖溶液）；37℃酶解时间由Anderson

的5min 和O ′Sullivan 的15min 提高至60min 。充分破壁的同时有效利用较高浓度的EDTA 螯合金属离子，防止了DNA 酶对质粒的降解。在破膜变性步骤中，本方法中的Solution Ⅲ（0.2mol/L

NaOH+3%SDS）相当于大肠杆菌质粒提取中的

12

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min 的效果最佳。

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SolutionII ，SDS 的浓度由提取大肠杆菌质粒中So -lutionII 的1%提高至3%，可加速细胞膜的裂解并

促使细胞蛋白质和染色体迅速变性。在质粒沉淀步骤中，本方法采纳借鉴了大肠杆菌质粒提取中质粒沉淀和Anderson 的方法，采用异丙醇进行一次性沉淀。异丙醇沉淀比无水乙醇用量少，操作方便，沉淀快而完全，质粒损失较小；但除盐效果逊于无水乙醇，可通过70%乙醇洗涤解决。结果表明：在不同沉淀条件的3个处理中，-20℃沉淀30

根据作者操作实践，利用本方法进行乳酸菌质粒提取检测，操作周期短，质粒提取效率高，这是一种简单、快速、稳定、高效的提取乳酸菌质粒的方法。该方法为进一步开展乳酸菌质粒提取的批处理研究以及开发乳酸菌质粒分离纯化试剂盒奠定了基础，也为乳酸菌分子生物学的研究和基因工程技术的发展提供了依据。

参

[1][2][3][4][5][6]

考文献

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第14卷第9期

1种快速高效提取乳酸菌质粒的方法

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A Rapid Method for Extracting Plasmids from Lactic Acid Bacteria

Zhang Bo 1，2Li Chen 1，2Dong Hui 1，2Kou Tiantian 1，2Xu Wentao 3Tian Hongtao 1，2*Luo Yunbo 3

（1Food Science and Technology College ，Agricultural University of Hebei ，Baoding 071001，Hebei

2

Agricultural Products Processing Engineering Technology Research Center of Hebei ，Baoding 071001，Hebei

3

College of Food Science and Nutritional Engineering ，China Agricultural University ，Beijing 100083）

A rapid and effective method for extracting plasmids from lactic acid bacteria is presented. The concen -

Abstract

tration and processing time of lysozyme and plasmids precipitating condition were optimized combing the method of breaking the cell wall by lysozyme and breaking the membranes of cells with denaturation ，according to the principle and the procedure of isolating plasmids from Escherichia. coli by using alkaline lysis technique and the method for extracting lactic acid bacteria plasmids established by Aanderson and O ′Sullivan. On that basis ，the applicability ，efficiency and quality of the isolated plasmids through this method were analysed and examined. The results shown that the size and the copy number degree of the plasmids would not affect the extraction from lactic acid bacteria. The detection rates and success rates of plasmids extraction were improved significantly. And the isolated plasmids which had achieved the DNA purification standard could be used for subsequent enzyme digestion of molecule biology. Pactices proved that this method was suitable for extracting lactic acid bacteria plasmids which from little amount material （1.5~2mL bacterium fluids ）to medium amount material （10mL bacterium fluids ）of extraction. The operating period of lactic acid bacteria plasmids ex -traction and Escherichia. coli plasmids extraction was equivalent and shortened by three or four hours compared with the methods that Aanderson and O ′Sullivan had established. The thesis also researched the main principle and considerations of extracting the plasmids from lactic acid bacteria ，in order to provide the foundation for developing the reagent kits with further isolation and purification of lactic acid bacteria and promoting the research of lactic acid bacteria molecular biology and the development of gene engineering technology.

Key words

lactic acid bacteria ；plasmids extraction ；simple and rapid ；stable and effective ；method

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英专家称每日食用水果可使心脏病发作率降低

据俄罗斯“消息岛”新闻网9月8日消息，英国科学家研究发现，每日食用1至2份水果，可使心脏病和中风的发作率降低。

英国牛津大学的科学家发现，相较于从不吃水果的人，在每日饮食中增添水果的人患心血管疾病以及心脏病发作的风险更低。每日食用水果可使患缺血性中风的风险下降25%，出血性中风的风险下降40%。

此外，每日食用水果还可降低血压，并降低死亡风险。

专家指出：“这项研究表明，食用的水果和蔬菜越多，对我们心脏健康越有益。甚至每天只食用一份水果都能降低患心血管疾病的风险。”

（消息来源：环球网）

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