不同品系节旋藻乙酰辅酶A羧化酶基因的克隆比较

　　[摘 要]本实验克隆了节旋藻及其高乙酰辅酶A羧化酶活性突变株的乙酰辅酶A羧化酶α-CT 、β-CT 、BC和BCCP四个亚基的ORF序列，片段大小分别为981bp、948bp、723bp和537bp。对原藻株和突变株乙酰辅酶A羧化酶的四个亚基进行序列比对，并与Genbank中节旋藻全基因组测序结果进行比较，发现四个亚基的ORF序列完全一致。该结果表明节旋藻乙酰辅酶A羧化酶高度保守，乙酰辅酶A羧化酶四个亚基的ORF序列并未发生改变，并不是导致乙酰辅酶A羧化酶活性在出发株与突变株中出现差异的原因。 　　[关键词]节旋藻突变株 乙酰辅酶A羧化酶 基因克隆 　　中图分类号：S917.4 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2014）27-0085-03 　　节旋藻（Arthrospira）属于蓝藻门（Cyanophyta）、蓝藻纲（Cyanophyceae）、颤藻目（Oscillatoriales）、颤藻科（Oscillaoriales）。藻体为多细胞排列而成的丝状体，弯曲呈螺旋状，无分支。节旋藻的蛋白质含量高达60%-72%，还含有多种维生素、氨基酸和矿物质[1]，有很好的提高免疫力[2]、抗肿瘤[3-4]、抗辐射[5]和抗病毒[6]的功能，被世界粮农组织誉为21世纪人类最理想的食品[7]。节旋藻于20世纪80年代初引入我国，经过30多年的发展，节旋藻养殖及相关产业已经成为我国最大的微藻生物技术产业群[8]。提高节旋藻中脂质含量对于提高节旋藻的营养价值，或者将节旋藻应用于生物能源的生产有重要的意义。本实验前期通过诱变与筛选获得了2株能够稳定遗传的脂肪酸含量显著提高的突变株，其乙酰辅酶A羧化酶活性与出发藻株相比显著提高。为了研究乙酰辅酶A羧化酶活性提高的原因，为脂肪酸含量提高提供理论依据，本研究拟克隆节旋藻及其高乙酰辅酶A羧化酶活性突变株的乙酰辅酶A羧化酶α-CT 、β-CT 、BC和BCCP四个亚基的序列。 　　植物中的乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl-CoA carboxylase，ACCase）催化乙酰辅酶 A转化为丙二酸单酰辅酶A的反应。该反应是脂肪酸合成的第一步，也是关键的限速步骤。节旋藻乙酰辅酶A羧化酶由羧基转移酶α亚基（α-carboxyltransferase）、羧基转移酶β亚基（β-carboxyltransferase），生物素羧化酶亚基（biotin carboxylase）和生物素羧基载体蛋白亚基（biotin carboxyl carrier protein）四个亚基构成，生物素作为羧基的载体，以共价键连接在生物素羧化酶上，生物素羧基载体蛋白在生物素羧化酶和羧基转移酶之间传递羧基，生物素羧化酶和羧基转移酶各催化反应的一半。整个反应步骤如下： 　　酶-生物素 + HCO3- + ATP → 酶-生物素-CO3- + ADP + Pi 　　酶-生物素-CO3- + 乙酰辅酶A → 酶-生物素 + 丙二酸单酰辅酶A 　　由于乙酰辅酶A羧化酶对油脂的合成与积累有着较大的影响，对高产油作物的产量与品质的提高有着重要的研究价值与实际意义。目前已经从小麦[18]、玉米[19]、油菜[20]等多种植物中克隆出ACCase基因的全长序列。楚敏等克隆了谷子ACCase的BC亚基，该亚基是生物素羧化位点和ATP结合位点，也是ACCAse中最保守的区域[21]。武永玉等运用RT-PCR、RACE、PCR walking等技术，克隆出油菜ACCase的α-CT亚基全长cDNA并在大肠杆菌中顺利表达[22]。卢捷等使用简并引物克隆一段序列，再用这段序列从地中海拟无枝菌酸菌U32的基因组cosmid文库中克隆出accA基因[23]。 　　本实验选用黄岛养殖厂提供的节旋藻藻株以及通过诱变获得的具有更高ACCase活性的突变株，克隆其ACCase 4个亚基α-CT 、β-CT 、BC和BCCP基因的ORF序列，并与Genbank中节旋藻全基因组测序结果进行比较分析。 　　1、材料和方法 　　1.1 藻种 　　本实验选用的藻株为黄岛养殖厂提供的节旋藻藻株，编号623，以及本实验室通过诱变获得的高ACCase活性突变株，编号623-8和623-16。 　　1.2 方法 　　1.2.1节旋藻DNA的提取 　　使用TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit提取节旋藻DNA。 　　1.2.2 引物设计 　　根据GenBank中已有的节旋藻全基因组测序结果（GenBank： FO818640.1），设计如下克隆引物： 　　3 讨论 　　ACCase活性对于提高脂肪酸含量有重要价值，本实验克隆并测序出发株623、突变株623-8和623-16的乙酰辅酶A羧化酶四个亚基的ORF序列，对其序列进行了比对，并与Genbank中节旋藻全基因组测序结果进行比对，发现四个亚基的ORF序列完全一致。该结果表明节旋藻乙酰辅酶A羧化酶高度保守，乙酰辅酶A羧化酶四个亚基的ORF序列并未发生改变，并不是导致乙酰辅酶A羧化酶活性在出发株与突变株中出现差异的原因。 　　Davis等将T7噬菌体的强启动子与大肠杆菌4个ACCase亚基的编码基因连接起来，在转化大肠杆菌后，脂肪酸含量增加了6倍[24]。Ohlrogge等将油菜种子napin的启动子与拟南芥ACCase基因连接后转入油菜中，获得的转基因油菜，其第一代成熟的种子中ACCase活性比对照组增加了2倍，脂肪酸含量增加28%，第二代种子的脂肪酸含量增加了5-6.5%[25]。Sellwood等使用反义表达技术抑制油菜ACCase的活性，获得的转基因油菜成熟种子的含油量显著低于对照组[26]。Roesler等将油菜种子贮藏蛋白napin的启动子与拟南芥ACCase基因连接后通过大豆Rubisco SSU转移肽的转运下转入油菜中，获得的转基因油菜其第一代成熟的种子中ACCase活性比对照组提高了10-20倍，脂肪酸含量增加5%，脂肪酸组成发生改变[27]。本实验中节旋藻突变株与出发株相比脂肪酸含量显著提高，进一步检测发现突变株乙酰辅酶A羧化酶活性提高，然而乙酰辅酶A羧化酶四个亚基的ORF序列并未发生改变，推测影响乙酰辅酶A羧化酶活性的因素为该酶在出发株与突变株中的表达量差异，如启动子序列、表达调控序列以及可能存在的mRNA修饰基因等序列的突变，该部分还有待使用实时荧光定量PCR等方法进一步探索。 　　参考文献 　　[1] Niels T. ，Eriksen， Production of phycocyanin-a pigment with applicaations in biology，bioechnology，foods and medicine.Appl Microbiol Biotechnol，2008，80：1-14. 　　[2] 唐玟，金鹰，郭宝江. 螺旋藻藻蓝蛋白和藻多糖对人体外周血淋巴细胞功能的影响.华南师范大学学报.1998，4：63-67. 　　[3] 高向东，吴梧桐. 节旋藻多糖抗肿瘤作用的研究.中国药科大学学报，2000，31（6）：458-461. 　　[4] Babu Mathew， Rengaswamy Sankaranarayanan， Padmanabhan P. 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