环氧化酶和其抑制剂与宫颈癌关系的研究

摘要

目的（１）探讨环氧化酶（ＣＯＸ）在宫颈上皮组织中的表达及其与宫颈癌临床、病理特征的关系；（２）探讨宫颈癌中ＣＯＸ－２与Ｋｉ一６７增殖指数、ｂａｘ、微血管密度（ＭＶＤ）以及ＣＤ４４ｖ６之间的关系；（３）探讨环氧化酶抑制剂阿司匹林、塞来昔布对Ｈｅｌａ和Ｓｉｈａ细胞株细胞周期及凋亡的影响。

方法（１）采用组织芯片技术结合免疫组织化学ＰＶ法分别检测宫颈癌、宫颈上皮内瘤变（ＣＩＮ）和正常宫颈上皮组织中ＣＯＸ．１、ＣＯＸ．２的表达。同时检测宫颈癌组织中Ｋｉ．６７、ｂａｘ、ＭＶＤ（用ＣＤ３４标记）和ＣＤ４４ｖ６的表达。（２）采用细胞培养技术及流式细胞术检测环氧化酶抑制剂阿斯匹林、塞来昔布对人富颈癌细胞株（Ｈｅｌａ和Ｓｉｈａ）细施周期及凋亡的影响。

结果（１）ＣＯＸ．１在正常宫颈组织、ＣＩＮ及宫颈癌中的表达差异无统计学意义（Ｐ＞Ｏ．０５）。ＣＯＸ－２在正常宫颈组织中无表达，在ＣＩＮ（６６．７％）及宫颈癌（８７．１％）中的表达率明显高于正常宫颈组织（Ｐ＜Ｏ．０１），但ＣＯｘ一２在ＣＩＮ及宫颈浸润癌中的表达率比较，差异无统计学意义（Ｐ＞Ｏ．０５）。（２）宫颈癌中ＣＯＸ．１的表达与发病年龄、临床分期、病理分级、宫颈浸润深度及淋巴结转无关（Ｐ＞Ｏ．０５）；ＣＯＸ．２的表达与发病年龄、临床分期、病理分级及宫颈浸润深度无关（Ｐ＞０．０５），而与淋巴结转移有关（Ｐ＜Ｏ．０５），伴淋巴结转移者ＣＯＸ－２的表达较高。（３）宫颈癌中ＣＯＸ－２的表达与髓一６７标记指数、ＭＶＤ及ＣＤ４４ｖ６呈正相关，与ｂａｘ无直线相关关系。（４）经流式细胞术分析显示，随着阿司匹林／塞来昔布浓度的增加，Ｈｅｌａ和Ｓｉｈａ细胞周期中Ｇｏ／ＧＩ期细胞增多，Ｓ期细胞减少。与阿司匹林（兰５ｍｍｏｌ／Ｌ）／塞来昔布（＞＿２５１．ｔｍｏｌ／Ｌ）共同孵育７２小时后，与空白对照组相比ＰＩ指数减小（Ｐ＜０．０５），调亡率增高（Ｐ＜Ｏ．０５）。流式分析图中可见亚二倍体凋亡峰。

结论（１）ＣＯＸ．１的表达可能与宫颈癌的发生、发展无直接关系；ＣＯＸ．２过度表达可能参与宫颈癌的发生、发展过程，故可作为反映宫颈癌生物学行为的有效指标之一。（２）ＣＯＸ．２参与宫颈癌的机理可能与促进肿瘤血管形成、促进细胞增殖及细胞黏附有关，与ｂａｘ的表达无直接关系。（３）环氧化酶抑制剂可抑制体外人宫颈癌细胞株Ｈｅｌａ和Ｓｉｈａ的增殖、促进细胞凋亡。关键词宫颈癌，环氧化酶，环氧化酶抑制剂

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Ａｂｓｔｒａｃｔ

ｏｂｊｅｃｔ：（１）ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣＯＸ一１ａｎｄＣＯＸ・２ｉｎｃｅｒｖｉｃａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＣＩＮａｎｄｎｏｒｍａｌｃｅｒｖｉｃａｌｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．ＴｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅＣＯＸｓａｎｄｅｌｉｎｉｃｏ—ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃｖａｒｉａｂｌｅｓｉｎｔｈｅｓｅｃｅｒｖｉｃａｌｃａｒｃｉｎｏｍａｐａｔｉｅｎｔｓ．（２）Ｔｏ

ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎＣＯＸ一２ａｎｄＫｉ一６７ｉｎｄｅｘｓ，ｂａｘ，ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒｄｅｎｓｉｔｙ（ＭＶＤ）ａｎｄＣＤ４４ｖ６ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．（３）Ｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｓｏｆｃｅｌｅｃｏｘｉｂ．ａｓｅｌｅｃｔｉｖｅｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ－－２ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ａｎｄａｓｐｉｒｉｎ，ａｎｏｎ・－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｎｔｗｏｃｅｒｖｉｃａｌｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌ】ｉｎｅｓｉｎｖｉｔｒｏ．

ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＭｅｔｈｏｄｓ：（１）ＴｈｅＣＯＸ一１，ＣＯＸ－２，ｗｅｒｅｅｘａｍｉｎｅｄｂｙ

ｃｈｉｐ

１０ｍｅｔｈｏｄｃａｓｅｓｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＰＶｍｅｔｈｏｄａｎｄｔｉｓｓｕｅｃｅｒｖｉｃａｌｉｎ１０１ｃａｓｅｓｏｆｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．１２ｃａｓｅｓｏｆＣＩＮａｎｄｏｆｎｏｒｍａｌｃｅｒｖｉｃａｌ

ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ；Ｋｉ一６７，ｂａｘ，ＭＶＤ（１ａｂｅｌｌｅｄｂｙＣＤ３４）ａｎｄ

ｉｎｌ０１ｃａｓｅｓｏｆｃｅｒｖｉｃａｌＣＤ４４ｖ６ｗｅｒｅｅｘａｍｉｎｅｄｃａｒｃｉｎｏｍａｓａｔｔｈｅＳａｍｅｔｉｍｅ．（２）１１１ｅｅｆｆｅｃｔｏｆｃｅｌｌｃｙｃｌｅ

ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ＦＣＭ）．

ｎｏａｎｄｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｔｉｃｒａｔｅｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙｆｌｏｗＲｅｓｕｌｔｓ：（１）１１１ｅｐｏｓｉｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒａｔｅｓｏｆＣＯＸ一１ｈａｖｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ

ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｃｅｒｖｉｃａｌｃａｒｃｉｎｏｍａｓ，ＣＩＮａｎｄｎｏｒｍａｌｅｅｒｖｉｃａｌｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．ＣＯＸ－２ｐｒｏｔｅｉｎＣａｎｎｏｔｂｅｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｎｏｒｍａｌｃｅｒｖｉｃａｌｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ；１１１ｅｐｏｓｉｔｉｖｅ

ｒａｔｅｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

ｗｅｒｅｏｆＣＯＸ－２ｉｎＣＩＮ（６６．７％）ａｎｄｃｅｒｖｉｃａｌｃａｒｃｉｎｏｍａｓ（８７．１％）ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｉｎｎｏｒｍａｌｃｅｒｖｉｃａｌｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ（Ｐ＜０．０１），ｂｕｔｔｈｅｒｅ

ｎｏｗａｓｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎＣＩＮａｎｄｃｅｒｖｉｃａｌｃａｒｃｉｎｏｍａｓ（Ｐ＞０．０５）．ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣＯＸ．１ｉｎ（２）Ｔｈｅｃｅｒｖｉｃａｌｃａｒｃｉｎｏｍａｓｈａｓｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｗｉｍ

ａｇｅ，ｃｌｉｎｉｃａｌｓｔａｇｅｓ，ｇｒａｄｅｓ，ｉｎｖａｓｉｏｎ

ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣＯＸ－２ｉｎｃｅｒｖｉｃａｌ

ｓｔａｇｅｓ，ｇｒａｄｅｓｄｅｅｐａｎｄｍｅｔａｓｔａｓｉｓｏｆｌｙｍｐｈａｔｉｃｎｏｄｅ；Ｔｈｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓｈａｓａｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｗｉｔｌｌａｇｅ．ｃｌｉｎｉｃａｌａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｄｅｅｐ，ｂｕｔｉｔｈａｓｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｗｉｔｌｌｍｅｔａｓｔａｓｉｓｏｆｌｙｍｐｈａｔｉｃｎｏｄｅ（ｐ＜０．０５）．（３）ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣＯＸ－２ｉｎｃｅｒｖｉｃａｌｃａｒｃｉｎｏｍａｓｈａｓｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｗｉｔｈＫｉ一６７，ＭＶＤａｎｄＣＤ４４ｖ６，ｂｕｔｈａｓ

ｗａｓｆｏｕｎｄ

ａｓｐｉｒｉｎｎｏｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｗｉｔｈｂａｘ．（４）ＢｙＦＡＣＳ．ｉｔｗｅｒｅｂｌｏｃｋｅｄｂｙｔｈａｔｔｈｅｃｅｌｌｃｙｃｌｅｓｏｆＨｅｌａａｎｄＳｉｈａｃｅｌｌｓｔｈｅｅｉｔｈｅｒａｎｄｃｅｌｅｃｏｘｉｂ，ｗｉｔｈ

¨ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｏｆ

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ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：ｔｈｅ

ｒａｔｉｏｗｅｒｅＧ洳】ｐｈａｓｅａｎｄｔｈｅｒａｔｉｏｏｆＳｉｈａ／Ｈｅｌａｗｅｒｅｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ｔｈｅＳｐｈａｓｅｎｏｔｉｎｈｉｂｉｔｅｄＧ２～Ｍｐｈａｓｅｒａｔｉｏｗｅｒｅｅｆｆｅｃｔｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ．Ｗｈｅｎｉｎｃｕｂａｔｅｄｗｉｔｈａｓｐｉｒｉｎ（＿＞５ｍｍｏｌ／Ｌ）／ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ（＿＞１０１ａｍｏｌ／Ｌ）ｆｏｒ７２ｈｏｕｒｓ．

ｔｈｅａｐｏｐｔｏｔｉｃｒａｔｅｓｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ

ｗｅｒｅｉｎｄｅｘｅｓ（ＰＩ）ｗｅｒｅｒｅｄｕｃｅｄ（ｐ＜Ｏ．０５），ｗｈｉｌｅｃａｌｌｉｎｃｒｅａｓｅｄ（ｐ＜Ｏ．０５），ｗｅｆｉｎｄｓｕｂ—ＧｊｓｕｍｍｉｔｉｎＦＡＣＳｇｒａｐｈ．

ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｗｉｔｈＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：（１）ＣＯＸ－１ｐｒｏｂａｂｌｙｈａｓ

ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓｎｏａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒ；ＣＯＸ－２ｍａｙｐｌａｙａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒ，ＣＯＸ一２ｍａｙｂｅｖａｌｕａｂｌｅｔｏｆｕｒｔｈｅｒｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｂｅｈａｖｉｏｒｏｆｃｅｒｖｉｃａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ．（２）Ｔｈｅｐｒｏｂａｂｌｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｗｅｒｅｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ．ｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｃｅｌｌａｄｈｅｒｅｎｃｅ，ｂｕｔｎｏｔｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｂａｘ．（３）ＢｏｔｈａｓｐｉｒｉｎａｎｄｃｅｌｅｃｏｘｉｂｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｄｕｃｅｄｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆＳｉｈａａｎｄＨｅｌａｃｅｌｌｌｉｎｅｓｉｎｖｉｔｒｏ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒ，ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ，ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ１ＩＩ

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缩略语表

ＣＯＸＣｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ

Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ３，５’一ｃｙｃｌｉｃａｄｅｎｙｌｉｃａｃｉｄ

Ｂａｓｅｐａｉｒ

Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ

Ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ环氧化酶环磷酸腺苷碱基对３，３’．二氨基联苯胺ＢｃＡＭＰｂｐＤＡＢＮＦ—ＫＢ

ＶＥＧＦｋａｐｐａ核因子ＫＢ血管内皮生长因子

二甲基亚矾

碘化丙啶

非甾体类抗炎药

磷酸盐缓冲液

ＲＰＭＩ．１６４０培养液

前列腺素Ｅ２

前列腺素１２

蛋白激酶Ｃ

蛋白激酶Ｇ

微血管密度

宫颈上皮内瘤变

前凋亡因子

增殖指数

于道尔顿ＶａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒＤＭＳＯＰＩＮＳＡＩＤｓＰＢＳｄｉｍｅｔｈｙｌｓｍｌｆｏｘｉｄｅＰｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅｎｏｎｓｔｅｒｉｏｄａｎｔｉ—ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｄｒｕｇｓｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅＲｏｓｗｅｌｌＲＰＭＩ・１６４０ＰＧＥ２ＰａｒｋＭｅｎｏｒｉａｌＩｎｓｒｉｔｕｔｅｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎＥ２ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ１２ＰＧｈＰＫＣＰＫＧｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＣｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＧＭＶＤＣＩＮＢｃｌ＿２ＰＩｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌｄｅｎｓｉｔｙｃｅｒｖｉｃａｌｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｎｅｏｐｌａｓｉａＰｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃｆａｃｔｏｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｉｎｄｅｘｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ

ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙＫＤｅＤＮＡ

ＰＰＡＲ５ＤＮＡ互补ＤＮＡ过氧化物酶体增殖激活受体６ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒｅｒａｔｏｒ

ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ６

ＰＰＡＲＴｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒｅｒａｔｏｒ

ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ７过氧化物酶体增殖激活受体Ｙ

ＭＭＰｓＭａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ基质金属蛋白酶

学位论文独创性声明

本人毕慧玲声明，所呈交的学位论文系在导师田秀珠教授指导下本人独立完成的研究成果。文中任何引用他人的成果，均已做出明确标注或得封许可。论文内容束包含法律意义上己属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。本文如违反上述声明，愿意承担以下责任和后果：

ｌ、交回学校授予的学位证书；

２、学校可在相关媒体上对作者本人的行为进行通报；

３、本文按照学校规定的方式，对因不当取得学位给学校造成的名誉损害，进行公开道歉。

４、本人负责因论文成果不实产生的法律纠纷。

论文作者签名：日期：——年——月——Ｒ

学位论文版权使用授权书

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山西医科大学硕士学位论文

前言

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，是癌症造成妇女死亡的第二位原因，其发病机制迄今尚未完全阐明。据ＷＨＯ报道每年新发现宫颈癌病例约有５０万，故对宫颈癌发病机制及防治途径的研究在妇科肿瘤中占有非常重要的地位。８０年代以来，一些大型流行病学调查发现，长期使用ＣＯＸ抑制剂（ＮｓＡＩＤｓ）治疗类风湿性关节炎的患者结肠癌发病率下降４０％～６０％。近年来的研究表明，ＣＯＸ（尤其是ＣＯＸ．２）与多种上皮性肿瘤的发生、发展关系密切Ｉ”，并发现ＣＯＸ抑制剂在抑制肿瘤的发生、发展过程中发挥一定作用，其可能的抗癌机制有（１）影响细胞的增殖与分化，（２）抑制细胞凋亡，（３）促进肿瘤血管形成，（４）影响机体免疫状态，（５）增加肿瘤细胞的侵袭能力，（６）促进癌前病变向肿瘤转化等１２１。但有关环氧化酶及其抑制剂与宫颈癌发生、发展之间关系的研究较少，因此我们做了以下三个方面的研究：（１）采用组织芯片技术及免疫组织化学技术，分别检测了正常宫颈上皮、宫颈上皮内瘤变（ＣＩＮ）及宫颈浸润癌组织中ＣＯＸ－Ｉ、ＣＯＸ－２的表达，并分析其与发病年龄、临床分期、病理分级、宫颈浸润深度及淋巴结转移等临床、病理特征之间的关系，以探讨ＣＯＸ与宫颈癌发生、发展之间的关系；（２）检测宫颈浸润癌组织中ｌ（ｉ．６７、ｂａｘ、ＭＶＤ（微血管密度，ｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌｄｅｎｓｉｔｙ，用ＣＤ３４标记血管内皮细胞）和ＣＤ４４ｖ６的表达，弗分析它们与ＣＯＸ．２的关系，从而在促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、促进肿瘤微血管形成以及细胞黏附等几个方面探讨ＣＯＸ．２促进宫颈癌发生、发展的可能机制；（３）采用细胞培养技术及流式细胞术检测ＣＯＸ抑制剂阿斯匹林、塞来昔布对人宫颈癌细胞株（Ｈｅｌａ和Ｓｉｈａ）增殖和凋亡的影响，为进一步探讨ＣＯＸ抑制剂抗肿瘤作用的机制，以及将其应用到临床中去积累资料。

材料与方法

１材料

１．１组织标本：

收集２００３年２月～２００４年４月在山西省肿瘤医院妇产科住院手术的患者１２３例，其中正常宫颈组织１０例（来自该院因子宫肌瘤行子宫全切术的患者），ＣＩＮ１２例，宫颈浸润癌１０１例（鳞癌９５例，腺癌６例）。宫颈浸润癌患者均有完整的临床病理资料，依据国际妇产科联盟（ＦＩＧＯ，１９８８年）临床分期标准Ｉ期５６例，ＩＩ期４５例。病理分级Ｇｌ～Ｇ２期６６例，Ｇ３期３５例。伴淋巴结转移者３２例。所有患者均为初治，术前未行放化疗治疗，均无高血压、糖尿病、肾炎、急慢性盆腔炎及内异症，近期均未服用影响前列腺素和血栓素代谢的药物，年龄３１～６８岁。

１．２细胞：

人宫颈癌细胞株Ｈｅｌａ及Ｓｉｈａ购自第四军医大学附属西京医院妇产科实验室。

１．３主要试剂：

ＣＯＸ．１、ＣＯＸ－２、Ｋｉ．６７、ｂａｘ、ＣＤ４４ｖ６及ＣＤ３４单克隆抗体及ＰＶ－６０００试剂盒均为美国Ｚｙｍｅｄ公司产品，购自北京中山生物技术有限公司。培养基ＲＰＭｌｌ６４０购自ＧｉｂｃｏＢＲＬ公司，小牛血清购自杭州四季青生物公司，胰酶购自ｓｉｇｍａ公司。塞来昔布购自山西威尔克科技发展公司，阿司匹林购自山西医科大学制药厂。塞来昔布及阿司匹林均溶于１００％一－－甲基亚砜中，存于４。Ｃ备用。

１．４主要仪器及设备：

层流洁净细胞培养室

Ｃ０２培养箱

流式细胞仪

无菌工作台山西医科大学中心实验室（１８１５ＴＣ）ＳＨＥＬ－ＬＡＢＢＥＣＴＯＮＤＩＣＫＩＮＳＯＮ公司北京新技术应用研究所２

低温冰箱

电子天平ＳＡＮＹＯＳＡＩＵ’０ＲＨＵＳ

２方法

２．１组织芯片技术及免疫组织化学法

２．１．１组织芯片的制作

所有组织标本均经１０％甲醛固定，石蜡包埋，切片厚５９ｍ，行ＨＥ染色，经山西省肿瘤医院病理科专家确诊。对选取的组织蜡块重新制作新鲜ＨＥ切片，确定具有代表性的病变部位，在相应的蜡块上做好标记。参照Ｋｏｎｏｎｅｎ等建立的方法应用打孔针制备组织芯片【３】。其方法是在一个新的空白蜡块中穿孔（直径ｌｍｍ），在选取的组织蜡块中按照标记穿取组织柱（直径ｌｍｍ），准确放入空白蜡块的小孑Ｌ内，依次按序操作，直至将所有组织标本种植于另一空白蜡块中。应用石蜡切片机进行连续切片。

２．１．２免疫组化技术

１、石蜡切片，常规脱蜡至水。

２、３％Ｈ２０２室温孵育ｌＯ分钟

３、蒸馏水冲洗，ＰＢＳ浸泡５分钟

４、柠檬酸缓冲液中高压锅热修复５分钟。

５、滴加一抗（即用型），４０Ｃ过夜。

６、ＰＢＳ冲洗。

７、滴加二抗，３７０Ｃ孵育１５分钟。

８、ＰＢＳ冲洗。

９、ＤＡＢ显色。

１０、自来水充分冲洗。

１１、复染、脱水、透明、封片。

用已知阳性片作阳性对照，用磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）代替一抗作为阴性对照。

２．１．３免疫组化结果判定①ｃＯＸ．１和ＣＯＸ一２：阳性染色为棕黄色颗粒，特异性位于细胞核周及

细胞浆内。综合染色强度和分布范围进行半定量处理，染色强度按下列标准评分：基本不着色为０分；着色淡，但明显强于阴性对照者为１分；着色清晰者为２分；着色强者为３分。分布范围按下列标准评分：阳性细胞数为０记０；＜３０％为１分；３０％～６０％为２分；＞６０％为３分。上述两种评分相加，Ｏ～１分为阴性，２分或以上者为阳性，其中２分为（＋），３～４分为（＋＋），５～６分为（＋＋＋）［４１。

②ｂａｘ：主要定位于细胞浆，呈棕黄色。基本不着色者为０分，着色淡为１分，着色深为２分。着色细胞占计数细胞百分率≤５％为０分，６％～２５％为１分，２６％～５０％为２分，ｔ＞５１％为３分，将每张切片染色程度与染色细胞百分比率得分相乘的积为其最后得分。Ｏ～１分为阴性（一），２～３分为弱阳性（＋），４～６分为中等阳性（＋＋），＞６分为强阳性（＋＋＋）【５】。

③ＣＤ４４ｖ６：：主要分布于细胞膜，呈深黄染色，按Ｋａｉｎｚ标准判定【６】，阳性：＞２０％的肿瘤区域呈强染色，或＞８０％的肿瘤区域呈弱染色，但细胞膜染色清晰。阴性：其它染色情况均为阴性。

④Ⅺ．６７标记指数：Ｋｉ．６７蛋白表达定位于细胞核，以细胞核内出现明确的棕黄色颗粒为硒．６７阳性细胞。随机选择３个高倍视野（Ｘ４００）计数肿瘤细胞总数和Ｋｉ．６７阳性细胞数，阳性细胞所占平均百分数为鼬．６７标记指数。

⑤ＭｖＤ：ＣＤ３４染色后，由内皮细胞或幼稚内皮细胞形成的管状、窄隙状、囊状和空泡状，染为黄褐色的结构即判定为可计数的微血管，高倍镜下计数，全部横切和纵切的微血管作为ＭＶＤ。

２．２细胞培养及流式细胞术

２．２．１细胞的培养：

人宫颈癌细胞株（Ｈｅｌａ和Ｓｉｈａ）采用ＲＰＭｌｌ６４０培养液，内含１０％灭活小牛血清，常规培养于３７。Ｃ、５％Ｃ０２、饱和湿度的孵箱中，用Ｏ．２５％胰酶消化传代。

２．２．２与药物共同孵育后经流式细胞仪分析：

选对数生长期的细胞按１×１０５／ｍｌ的浓度接种于六孔培养板中，次日更换培养液后与不同浓度的阿司匹林或塞来昔布共同孵育，使其终浓度分别４

为：阿司匹林２．５ｍｍｏｌ／Ｌ，５ｍｍｏｌ／Ｌ，１０ｍｍｏｌ／Ｌ；塞来昔布１２．５ｌａｍｏｌ／Ｌ，２５Ｉ，ｔｍｏＩ／Ｌ，５０ｐｍｏｌ／Ｌ，并设相应的空白对照组，空白对照组及各不同浓度组均做两瓶。共同培养７２小时后胰酶消化（０．２５％），收集细胞制成１×１０６个／ｍｌ的单细胞悬液，加入４０Ｃ预冷的７０％乙醇固定细胞，ＰＢＳ漂洗２次，用１ｍｌＰＢＳ液重新悬浮细胞，加碘化丙啶，避光染色２０分钟后通过流式细胞仪检测，应用ＤＮＡ细胞周期分析软件，计算出各样品ＤＮＡ含量，分析细胞周期及凋亡率。细胞的增殖活性以增殖指数（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｉｎｄｅｘ，ＰＩ）表示，计算公式为：

ＰＩ（％）＝（Ｓ％＋Ｇ２～Ｍ％）／（Ｇｏ～Ｇｌ％＋Ｓ％＋Ｇ２～Ｍ％）×１００％２．３统计方法

采用ＳＰＳＳｆｏｒＷｉｎｄｏｗｌ０．０软件包进行统计分析，率的比较用ｆ检验，相关分析用ｓｐｅａｒｍａｎ相关检验，多个样本均数间的比较用方差分析，Ｐ＜Ｏ．０５为有统计学意义。

结果

３．１ＣＯＸ－１及ＣＯＸ－２蛋白在各组宫颈上皮组织中的表达

免疫组化检测结果显示ＣＯＸ．１、ＣＯＸ．２主要表达定位于细胞浆，为棕黄色颗粒。

ＣＯＸ．１的表达：１０例正常宫颈组织中有６例阳性表达（６０．Ｏ％），１２例ＣＩＮ中有９例阳性表达（７５．Ｏ％），１０１例宫颈浸润癌中有６７例阳性表达（６６＿３％），各组问阳性表达率比较，差异无统计学意义（Ｐ＞Ｏ．０５）。

ＣＯｘｌ２的表达：１０例正常宫颈组织中均无表达（Ｏ％），１２例ＣＩＮ中有８例阳性表达（６６．７％），１０１例宫颈浸润癌中有８８例阳性表达（８７．１％）。ＣＯＸ．２在ＣＩＮ和宫颈浸润癌的表达率明显高于正常宫颈组织（Ｐ＜０．０１），但ＣＯＸ．２在ＣＩＮ及宫颈浸润癌的表达率相比较，差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５），见表一１。

表＿１ＣＯＸ－！及ＣＯＸ－２蛋白在各组宫爱上皮组织中的表达（倒）

｝与正常宫颈相比，差异有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．０１）

Ａ与ＣＩＮ相比，差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）

３．２

３．２．１ＣＯＸ－１及ＣＯＸ－２的表达与宫颈癌临床病理特征的关系ＣＯＸ－１的表达与宫颈癌Ｉｌ缶床病理特征的关系

宫颈浸润癌中ＣＯＸ－１的表达在不同发病年龄、临床分期、病理分级、宫颈浸润深度及有无淋巴结转移患者间相比较，差异均无统计学意义（Ｐ６

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＞Ｏ．０５），见表一２。

３．２．２ＣＯＸ－２的表达与宫颈癌临床病理特征的关系

宫颈浸润癌中ＣＯＸ一２的表达在不同发病年龄、临床分期、病理分级及宫颈浸润深度患者间比较，差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５），而有淋巴结转移者ＣＯＸ一２的表达高于无淋巴结转移者（Ｐ＜Ｏ．０５）。组织学类型中腺癌仅６例，未作统计学处理，见表．３。

表－２ｃＯＸ－１的表达与宫颈癌临床病理特征的关系７

罩卜３ＣＯＸ－２的表达与宫颈癌临床病理特征的关系

带｝者为有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。

３．３宫颈癌中ＣＯＸ－２的表达与Ｋｉ＿６７标记指数、ｂａｘ、＿帕及ＣＤ４４ｖ６的关系

为进一步探讨ＣＯＸ－２参与宫颈癌发生、发展的可能机制，本实验检测了蹦一６７、ｂａｘ、ＭＶＤ及ＣＤ４４ｖ６在宫颈癌组织中的表达，并分析它们与ＣＯＸ－２的关系，从而在促进细胞增殖、抑制细胞调亡、促进肿瘤微血管形成以及细胞黏附等几个方面进行研究。

经组织芯片技术及免疫组化染色半定量分析发现：宫颈浸润癌中ＣＯＸ一２的表达分别与Ｋｉ一６７标记指数、微血管密度呈显著正相关（Ｐ＜Ｏ．０１），与ＣＤ４４ｖ６呈正相关（Ｐ＜０．０５）；而ＣＯＸ．２的表达与ｂａｘ的表达无直线相

关关系（Ｐ＞Ｏ．０５）。

３．４阿司匹林及塞来昔布对Ｈｅｌａ和Ｓｉｈａ细胞细胞周期及细胞凋亡的影响

为进一步探讨ＣＯＸ抑制剂对宫颈癌细胞的影响，本实验通过流式细胞术分析不同浓度阿司匹林或塞来昔布作用后，Ｈｅｌａ和Ｓｉｈａ细胞周期的变化情况及细胞凋亡率的改变。

如表４、表５所示，与各浓度的阿司匹林／塞来昔布共同孵育７２小时后，随着药物浓度的增高，Ｓｉｈａ及Ｈｅｌａ细胞周期发生变化：Ｇｏ～Ｇｌ期细胞增多，ｓ期细胞减少，Ｇ２～Ｍ期细胞比例无明显改变。

分别与５ｍｍｏｌ／Ｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ阿司匹林共同孵育７２小时后，同对照组相比Ｓｉｈａ及Ｈｅｌａ细胞ＰＩ增殖指数减小（Ｐ＜Ｏ．０５），凋亡率增高（Ｐ＜Ｏ．０５），流式分析图中可见亚二倍体凋亡峰。

分别与１２．５９ｍｏｌ／Ｌ、２５９ｍｏｌ／Ｌ、５０９ｍｏｌ／Ｌ塞来昔布共同孵育７２小时后，同对照组相比Ｓｉｈａ及Ｈｅｌａ细胞ＰＩ增殖指数减小（Ｐ＜０．０５），凋亡率增高（Ｐ＜Ｏ．０５），流式分析图中可见亚二倍体凋亡峰（表．６，附图．１９，２０）。

袁ｒ－－４阿司匹林／塞来昔布对Ｓｉｈａ细臆株细胞周期的影响（；士ｓ）９

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表－５阿司匹林／塞来昔布对ｌｔｏｌａ细胞株细胞周期的影响（；士ｓ）

表＿６阿司匹林／塞来昔布对Ｓｉｌｕｄｌｔｏｌａ细胞株ＰＩ增殖指数及凋亡率的影响（；±ｓ）空白对照组

阿司匹林组

２．５ｍｍｏｌ几

５ｍｍｏｌ／Ｌ

１０ｍｍｏｌ几４３．０：ｔ＝４．１２２．２５士０．１ｌ５１．３７４－２．８９０．９７：±－０，１６４１．９士０．８７３６．８１ａ＝０．５６＋３０．９９：ｉ＝５．１２‘３．０８士０．１８７．９９ｉ０．２８‘１３．０６士２．２６’４７．４０＝１＝１．８８４１．３８＝１：６．６７＋３４．５３＋１．３５＋１．６６士０．３２４．４０土１．１２＋９．１６土０．５２＋塞来昔布组

１２．５９ｍｏＩ／Ｌ

２５ｐ＿ｍｏｌ／Ｌ３１．２７：ｔ＝１．５３＋２２．９５：１：２．８２‘９．１４士０．４６＋１４．９１４－２．０４３９．３６士１．３５’３４．０４ａ：０Ａ５’４．７６士Ｏ．３５‘９．９１：￡０．７８‘！！＆竺！些！！：！！兰：竺型：！！圭！：！！：！！：！些！：！！：！！：壁！：塑。￥与空白对照组相比，差异有统计学意义（Ｄ＜Ｏ．０５）。１０

讨论

４．１环氧化酶与宫颈癌

环氧化酶（ｃｏｘ）是催化膜磷脂花生四烯酸转化为前列腺素类物质（如前列腺素、血栓烷素）的限速酶，存在两种同工酶，即ＣＯＸ．１和ＣＯＸ．２。ＣＯＸ－１基因属于“管家基因”，在大多数正常细胞中都呈稳定表达。一般情况下活性稳定，在应激状态下或受某些激素、生长因子刺激时，其活性仅轻度增加２－４倍。ＣＯＸ一２基因属于“快速反应基因”，ＣＯＸ．２蛋白是诱导型酶，在静息状态下不表达，只有当细胞接受相应刺激后才开始从头合成，但其表达水平较基础水平可升高ｌＯ－８０倍不等。近年来大量研究表明，除参与炎症反应外，ＣＯＸ．２的过度表达与多种上皮性肿瘤的发生、发展关系密切，但具体机制尚不清楚。有人采用免疫组织化学法对宫颈癌组织中ＣＯＸ。２的表达进行了分析，在１３例中有１２例表达明显增高，而正常宫颈组织中未检测到阳性表达，而且ＣＯＸ．２也表达于宫颈上皮内瘤变（ｃＮ）【７１。Ｋｉｍ等研究发现ＥＧＦＲ和ＣＯＸ．２同时表达是富颈癌的一个独立预后因子Ｉ盯。我们采用组织芯片技术结合免疫组织化学ＰＶ法检测了１０１例宫颈癌、１２例宫颈上皮内瘤变（ＣＩＮ）和ｌＯ例正常宫颈上皮组织中ＣＯＸ－１、ＣＯＸ－２的表达。我们的研究结果显示，在正常宫颈上皮、ＣＩＮ及宫颈癌组织中均有ＣＯＸ．１蛋白的表达，且各组间比较差异无统计学意义（Ｐ＞Ｏ．０５），说明ＣＯＸ．１可能与宫颈癌的发生、发展无关。然而在对ＣＯＸ．２的检测中发现：ＣＯＸ一２在正常宫颈组织中无表达，在宫颈浸润癌及ＣＩＮ中的阳性表达率明显高于正常宫颈组织（Ｐ＜０．０１），但ＣＯＸ．２在ＣＩＮ及宫颈浸润癌的表达率比较，差异无统计学意义（Ｐ＞Ｏ．０５）。因此我们的实验结果提示ＣＯＸ．２的过度表达可能参与宫颈癌发生的早期过程，ＣＯＸ．２很可能是肿瘤发生的早期标志之一。这与国外一些学者的研究结果基本一致１９一Ｏｌ。本研究结果还显示，不同发病年龄、临床分期、病理分级及宫颈浸润深度患者间ＣＯＸ．２蛋白的表达相比较，差异无统计学意义（Ｐ＞Ｏ．０５）。而伴淋巴结转移者ＣＯＸ．２的表达高于无淋巴结转移者（Ｐ＜Ｏ．０５）。这一结果表明，ＣＯＸ一２能提示宫颈癌具有较高转移潜能及危险性，进而可用于提示预后。术前活检标本

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中ＣＯＸ．２的表达水平将刘宫颈癌患者术前分期及选择合理的术前治疗有一定参考价值。

４．２环氧化酶参与宫颈癌的可能机镧

４．２．１促进细胞增殖，诱导细胞凋亡

恶性肿瘤的发生发展离不开肿瘤细胞的异常增殖。已有大量研究表明，ＣＯＸ．２及其ＰＧＥ２产物可以刺激结肠癌细胞生长增殖，用ＣＯＸ．２ｅＤＮＡ转染人结肠癌细胞株Ｃｏｌ０３２ＤＭ后发现结肠癌细胞ＤＮＡ合成明显增加，出现增殖效应，ＣＯＸ．２抑制剂则可抑制上述生物学行为的改变１１１１。可能的具体途径是其主要产物ＰＧＥ２通过自分泌和，或旁分泌途径作用于同种细胞或邻近周围组织其它类型细胞，与细胞膜受体ＥＰ结合，通过Ｇ蛋白耦联途径促进细胞增殖。本实验中，我们通过检测确．６７来评估宫颈癌细胞的增殖状态，从而分析ＣＯＸ．２与宫颈癌细胞增殖问的关系。Ｋｉ．６７基因位于染色体１０ｑ２５，分子量为３４５ｋＤ，在细胞周期中的Ｓ、Ｇ２、Ｍ期均有表达，而在Ｇｏ期表达缺失。Ｋｉ．６７具有半衰期短的优点，可以准确反映细胞的增殖活性，其增殖指数高低与许多肿瘤的分化程度、浸润、转移以及预后密切相关，因此被广泛作为各种恶性肿瘤增殖状态的标记物之一。本实验结果显示鼬．６７增殖指数随着ＣＯＸ．２蛋白表达的增强而增加，提示ＣＯＸ．２可能增强细胞增殖活力，促进磁．６７表达。由此推断，促进细胞增殖可能是ＣＯＸ．２促进宫颈癌发生、发展的重要机制之一。

细胞凋亡是有核细胞在凋亡信号作用下通过启动细胞内死亡机制，经过一系列信号转导途径，最终发生细胞程序性变性和死亡的过程。细胞凋亡不仅在肿瘤的发生发展中有重要意义，而且化疗、放疗和生物治疗都是主要通过诱导凋亡来治疗肿瘤【１２ｌ。ｂａｘ蛋白首先在ＥＢ病毒ＤＮＡ中被发现，由１９２个氨基酸组成，分子量为２１ＫＤ，ｂａｘ基因是ｂｃｌ．２基因家族的一员，是ｂｃｌ．２家族中研究最广泛的促凋亡基因【１３１。ｂａｘ与ｂｃｌ一２是一对凋亡调控基因。ｂａｘ蛋白可与ｂｃｌ．２形成异源二聚体，或ｂａｘ与ｂａｘ形成同二聚体。当细胞内ｂｃｌ．２较多时，ｂｃｌ．２和ｂａｘ的异源二聚体增多，可以阻止细胞的凋亡；当细胞内ｂａｘ较多时，则ｂａｘ本身形成的同源二聚体占主导地位，则易发生凋亡。有学者发现ｂａｘ蛋白的表达与一些恶性肿瘤发生、发展及生物学行

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为有密切关系。Ｔａｉ．Ｙ报道，ｂａｘ促细胞凋亡基因蛋白既可以直接影响线粒体功能，又可以间接通过降低某些化疗药物对细胞凋亡的耐受力，从而诱导细胞凋亡【Ｊ仉。有研究发现ＣＯＸ抑制剂吲哚美辛（ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ）可使食管癌细胞株ｂａｘ表达上调，诱导细胞凋亡，但与ＣＯＸ－２的高表达无关【Ｊ”。我们的研究结果表明ＣＯＸ－２的表达与ｂａｘ的表达无明显相关性（Ｐ＞０．０５），这说明宫颈癌中ＣＯＸ．２的表达与ｂａｘ的表达无直接关系。

４．２．２促进肿癌血管的生成

在宫颈癌的发生、发展过程中，血管生成是癌细胞生长和转移的关键步骤，新生的血管不仅为肿瘤生长提供必需的营养成分，为肿瘤细胞进入循环系统导致远处转移提供通道，同时还可分泌一些细胞因子促进肿瘤细胞的增殖【１６１。由于ＣＤ３４表达于造血干细胞和新生血管内皮细胞，是显示血管内皮细胞的特异性标记物１１７１，所以我们选择ＣＤ３４来标记微血管密度（ＭｖＤ），用来研究ＣＯＸ－２与富颈癌血管生成之间的关系。研究发现Ｉｌ州ＣＯＸ－２过度表达的胃癌组织中微血管密度较ＣＯＸ－２低表达者明显增加。转染ＣＯＸ－２基因的结肠癌细胞株在过度表达ＣＯＸ．２的同时，还能诱导、促进血管生成。有试验表明，ＣＯＸ－２的表达同ＶＥＧＦ的表达呈正相关，其机制可能是：过度表达的ＣＯＸ－２及前列腺索通过ＥＰ受倒ｋ／ｃＡＭＰ途径激活各种膜内激酶，或通过核受体直接进入核内并作用于基因，诱导ＶＥＧＦ表达上调而促进肿瘤新生血管生成。而ＣＯＸ抑制者ｑ可抑制以上生化过程，从恧抑制肿瘤的生长、侵袭。目前研究认为，ＣＯＸ．２对肿瘤血管形成的调控机制可能有以下几种：（！）ＣＯＸ－２催化产生的前列腺素可诱导组织生成ＶＥＧＦ，ＶＥＧＦ则通过旁分泌和自分泌的形式作用于血管内皮细胞表面受体，促使内皮细胞向毛细血管的转化，从而促进血管形成；②通过刺激ｂｃｌ．２而抑制血管内皮细胞的凋亡；③花生四烯酸的代谢产物血栓素Ａ２、ＰＧＥｚ和ＰＧｌ２可直接刺激血管内皮细胞迁移、生长，诱导血管生成１１９Ｊ。也有研究认为，ＣＯＸ．２的高表达能刺激肿瘤细胞释放血管源性的前列腺素；而后者刺激内皮细胞迁移和管腔形成，这是血管生成的初始步骤，对调节肿瘤新生血管的形成有重要作用【２０】。本实验结果也显示：ＣＯＸ．２的表达与ＭＶＤ呈正相关（Ｐ＜０．０１），由此推论，ＣＯＸ－２在促进宫颈癌微血管形成中起一定作用，

因而促进肿瘤血管生成可能是ＣＯＸ一２参与宫颈癌发生、发展的重要机制之４．２．３促进细胞移动、黏附

体内外实验研究表明，ＣＯＸ．２可使基质金属蛋白酶ＭＭＰ．２的表达增加、活性增强，使浸润抑制因子Ｅ．钙粘连素的表达水平降低，促进基底膜和基质降解、肿瘤细胞转移【２】２２１。ＣＯＸ．２抑制剂可逆转上述生化过程，降低肿瘤细胞的侵袭性。而且选择性ＣＯＸ．２抑制剂可降低唾液酸化的路易寡糖（ＳｉａｌｙｌＬｅｗｉｓ）ａ抗原，降低结肠癌细胞与内皮细胞的黏附能力【２３１，因此促进肿瘤细胞移动、黏附及肿瘤的浸润，有可能是ＣＯＸ．２促进肿瘤发生、发展的机制之一。

ＣＤ４４分子是一种分布极为广泛的细胞跨膜糖蛋白，属于细胞黏附分子，它通过细胞与细胞、细胞与基质的相互作用参与肿瘤的形成、分化、浸润和转移。在淋巴细胞、成纤维细胞和上皮细胞均能检测到它的表达。人类ＣＤ４４基因定位于１１号染色体短臂，由至少２０个高度保守的外显子组成。ＣＤ４４是具有多种生物学功能的单基因编码糖蛋白家族，按外显子的转录片段是否参与选择性拼接，将其分成标准型（ＣＤ６６ｓ）和变异型（ＣＤ４４ｖ）两大类。ＣＤ４４蛋白的功能【２４】主要有：①参与淋巴细胞归巢过程；②参与淋巴细胞激活过程；③与透明质酸结合、介导细胞基质之间的粘连；④影响细胞迁移过程。故ＣＤ４４特别是ＣＤ４４ｖ６与多种肿瘤的演进、转移和预后有关［２５］ｏ本研究结果显示ＣＯＸ．２的表达与ＣＤ４４ｖ６的表达呈正相关，由此推论宫颈癌中ＣＯＸ一２的过度表达可能影响ＣＤ４４基因的转录和表达，出现异常拼接，从而影响细胞间识别、粘着及信息传递，甚至丧失接触性抑制，造成细胞无限增殖。ＣＤ４４（特别是ＣＤ４４ｖ６）能利用淋巴细胞归巢的机制使细胞在发生恶变的早期就在淋巴结中植入、定居及快速增殖，从而促进淋巴结转移的发生。ＣＤ４４ｖ６的增高有可能是ＣＯＸ．２促进宫颈癌细胞移动、黏附、转移的途径之一。

４．２．４其它可能的机制

有研究表明，ＣＯＸ－２及其ＰＧＥ２产物能抑制具有免疫调节功能的淋巴因子的产生，抑制Ｔ细胞和Ｂ细胞的活性，降低机体对肿瘤细胞的局部免疫１４

口“。ＣＯＸ抑制齐４还可通过激活蛋白激酶Ｇ（ＰｒｏｔｅｉｎＫｉｎａｓｅＧ），抑制ＮＦ．ＫＢ活性，下调抗凋亡蛋白Ｂｃｌ．ＸＬ的表达，抑制ＰＰＡＲ一６，激活ＰＰＡＲ—Ｙ等机制发挥作用１２”。目前，ＣＯＸ．２参与宫颈癌的确切机理尚不清楚，有待于进一步深入的研究。

４．３环氧化酶抑制剂与宫颈癌

环氧化酶抑制剂属于非甾体类抗炎药（ＮＳＡＩＤｓ），Ｉ豳床上常用于消炎、镇痛、解热等治疗。自１００年前第一种ＮＳＡＩＤｓ药物阿司匹林由ＦｅｌｉｘＨｏｆｆｍａｎ合成，至今世界上已有５０种以上不同的ＮＳＡＩＤｓ化合物投放市场。随着对两种环氧化酶ＣＯＸ．１和ＣＯＸ．２的认识，ＮＳＡＩＤｓ药物根据它们对两种环氧化酶的选择性不同有了进一步分类，非选择性ＣＯＸ抑制剂（即对ＣＯＸ－１和ＣＯＸ．２的抑制作用相似或对ＣＯＸ．１的抑制作用更强），以及高度特异性抑制ＣＯＸ．２的选择性ＣＯＸ．２抑制剂。前者为传统的ＮＳＡＩＤｓ，包括阿斯匹林、扑热息痛、消炎痛等，后者包括新开发的Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ（塞来昔布）、Ｒｏｆｅｅｏｘｉｂ（罗非昔布）、ＮＳ．３９８等。

８０年代以来，一些大型流行病学调查发现长期使用ＣＯＸ抑制剂（ＮＳＡＩＤｓ）治疗类风湿性关节炎的患者，结肠癌发病率下降４０％～６０％，同时也可明显减少和预防食管癌、胃癌等发生的危险性。而且家族性腺瘤性息肉病患者长期服用小剂量ＮＳＡＬＤｓ后，结肠息肉数目和大小均明显降谢…。这使得ＣＯＸ抑制剂成为预防和治疗肿瘤的一个新靶点。

Ｄｏｕｇｌａｓ等已分别对人结肠癌、直肠癌、皮肤癌、脑胶质细胞瘤、胰腺癌等细胞进行ＮＳ３９８（一种选择性ＣＯＸ－２抑铝ｒＪＮ）体外抑制作用，结果均提示，ＮＳ３９８能够抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡【２踟。有研究认为，一方面ＣＯＸ抑制剂可通过调节ｂｃｌ－２家族的表达诱导细胞凋亡１２９】；另一方面，ＣＯＸ抑制剂可能通过蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）依赖途径调节肿瘤细胞的凋亡【３０ｌ。本实验分别选择了一种传统的ＮＳＡＩＤｓ阿司匹林及选择性ＣＯＸ．２抑制剂塞来昔布，采用流式细胞术，对Ｈｅｌａ（属于人宫颈腺癌细胞株）和Ｓｉｈａ（属于人宫颈鳞癌细胞株）两种细胞株进行细胞周期及细胞凋亡的分析。细胞周期中Ｇｏ期为细胞增殖的静止状态，Ｇ１期为ＤＮＡ合成前期，Ｓ期为ＤＮＡ合成期，Ｇ２期为ＤＮＡ合成后期，Ｍ期为有丝分裂期。Ｓ％反映细胞增殖能力，