产阿魏酸酯酶菌株的筛选及其酚酸释放研究

现代食品科技

Modern Food Science and Technology 2015, Vol.31, No.7

产阿魏酸酯酶菌株的筛选及其酚酸释放研究

胡博涵，吴晖，赖富饶，尹志娜，雷灼贵，陈彩薇，周福珍，陈华敏，陈国枝（1. 华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 510640）（2. 广东省微生物研究所，广东广州 510070）

摘要：本文采用平板筛菌和牛津杯透明圈试验法筛选具有产阿魏酸酯酶的菌株，将其接种于麸皮中进行固态发酵，采用分光光度法和HPLC 法分析发酵麸皮其阿魏酸酯酶活力、总酚酸以及阿魏酸的释放量，并进行个体形态、菌落特征和TIS 测序鉴定，结果表明：筛选出一株菌株的阿魏酸酯酶酶活优于其他菌株，在发酵第4 d该菌株的阿魏酸酯酶酶活达最高为；而且发酵麸皮释放总酚酸的能力较高，将麸皮的总酚酸量提高6.6倍，其中阿魏酸的量达到0.697%，0.22%。对其进行分子鉴定，该菌株与烟曲霉（Aspergillus clavatus）同源性达100%阿魏酸含量，是农副产品增值利用以及药用功能开发的主要研究方向。

关键词：麦麸；阿魏酸酯酶；酚酸；阿魏酸；烟曲霉；鉴定

文章篇号：1673-9078(2015)7-92-98 1

1

1

1

1

1

2

2

2

HU Bo-han, WU Hui , LAI Fu-rao, YIN Zhi-na, , CHEN Hua-min,

2((2.Guangdong Institute of Mi

Abstract: The agar plate screening and Oxford were microorganisms that could produce feruloyl pectrophotometry and High Performance Liquid Chromatorg released in the fermented wheat bran. The characteristics, and iternally transcribed spacer (TIS) sequencing increase in fermented Aspergillus clavatus, and it was named Yanqing.

; ferulic acid; Aspergillus clavatus; identification

1

1

1

2

2

2

2

每年其产量达2000万t 多种成分，其中以阿拉伯木聚糖为主的非淀粉多糖含46%，是小麦细胞壁的主要成分。麸皮中还含有一定

收稿日期：2014-12-30

基金项目：中央高校基本科研业务费专项资助项目（2013ZM0065） 作者简介：胡博涵（1990-）, 男，在读硕士研究生，研究方向为食品质量与安全

通讯作者：吴晖（1968-）男，博士，教授，研究方向为食品质量与安全

数量的酚酸类物质，如阿魏酸（ferulic acid）、P-香豆酸(p-coumaricacid) 、咖啡酸(caffeicacid) 、芥子酸(sinapicacid) 和丁香酸(syringicacid)等成分，其中以阿魏酸为主要成分，约为麸皮质量的0.4%~0.7%[1]。阿魏酸主要通过酯键与细胞壁多糖和木质素交链，或自身酯化或醚化形成二阿魏酸释放出来。

研究表明酚类物质主要以游离型、结合型和束缚型等几种形式存在于植物机体内[3~5]，麦麸中的阿魏酸基本是以束缚型的形态存在的，其游离型结合型:结合型:束缚型的比例为0.1:1:100[2]。目前从麦麸中获得阿魏酸的方式主要为酶法。一般采用有机溶剂为媒介，

[2]

92

现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2015, Vol.31, No.7

辅以超声[6]、微波[7]、亚临界[8]等方法进行。由于束缚型酚类物质一般与其他物质以不同的键型相连接，传统的提取方法不足以将酯键、糖苷键或醚键断裂，因此对束缚型酚类物质的提取主要采用强酸强碱[9]或生物方法（酶法和发酵法），其主要目的都是破坏细胞壁纤维成分致密的结构，以使束缚行酚类物质释放出来。尽管化学方法操作简单、效率高，但是后续需要处理提取废液，不利于可持续性发展。因此相比较而言，采用生物方法更符合绿色、环保的发展要求。

对于利用麦麸进行发酵的研究多集中在低聚木[11~12][13~14]

糖生产和产酶活性等领域，对于利用产阿魏酸酯酶的微生物提高麸皮酚酸的含量的报道鲜见。本研究拟筛选产阿魏酸酯酶活性较强的微生物，利用麦麸作为其发酵底物产生阿魏酸酯酶，断裂麦麸中植物细胞多糖及木质素和阿魏酸之间的酯键，研究获得束缚型释放酚酸的方法，并结合微生物本身产生的多种酶系共同作用获取小麦麸皮中的阿魏酸，克服化学方法污染性，利用微生物生长周期短，不受气候限制，易于大规模发酵生产获取阿魏酸酯酶，为农副产品增值利用提供理论依据。

[10]

（约6.4），121 ℃保温灭菌20 min。

察氏酵母膏琼脂：NaNO 3 3 g ，K 2HPO 4 1 g ，MgSO 4·7H 2O 0.5g，KCl 0.5 g，FeSO 4·7H 2O 0.01g，蔗糖30 g，酵母膏5 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL。pH 值自然。121 ℃保温灭菌20 min。

发酵培养基：麦麸:水为重量比1:1，pH 值自然。

1.2 方法

1.2.1

PDA 培养基中于28 落转接到斜面PDA 28 60 h用；

28 ℃培养2 d，取30 g发酵麸皮℃浸提1 h，将浸提液12000 ，获得上清液。取200 μL上清液，37 ℃培养箱中保发酵液消解底物而形成无色透步筛选高产阿魏酸酯酶的菌株。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 泥土

产阿魏酸酯酶菌株固态发酵麸皮阿魏酸酯酶活力测定

产阿魏酸酯酶样品制备：将产阿魏酸酯酶能力较强的菌株分别接种到25 g的无菌麸皮发酵培养基500 mL 三角瓶中，置温度为28 ℃培养一定时间。分别对培养2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d的麸皮进行粗酶液的提取。

阿魏酸酯酶粗酶液的制备：称取固态发酵的麸皮样品10 g于小烧杯中，加入50 mL 0. 05 mol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH 值6.2），在磁力搅拌器上匀质15 min，并于12000 r/min离心15 min，收集上清液，即为待测粗酶液。

在1.9 mL 1 mmol/L阿魏酸甲酯溶液（pH 6.0）中加入0.2 mL稀释的酶液，于50 ℃反应10 min后，加入900 μL冰乙酸终止反应，再加入5 mL蒸馏水，混匀后以对照组为空白测定320 nm处的吸光值A 。

酶活定义：1 mL酶液在50 ℃、pH 6.0条件下，每分钟酯解阿魏酸甲酯，生成1 μmol阿魏酸所需酶量定义为1个酶活力单位(U)。

1.1.2 培养基与试剂

初筛培养基：·7H 2，3 2.0 g，KCl 0.5 g，MgSO 4·7H 2，2430 g，琼脂20 g蒸馏水，pH 值自然；121 ℃灭菌20 min ℃左右添加无菌的10%100 mL，摇匀

42O 0.01 g，NaNO 3 2.0 g，4·2O 0.5 g，K 2HPO 4 1.0 g，麸皮1000 g，pH 值自然。

PDA 马铃薯（去皮）200 g，葡萄糖（或蔗糖）20 g，琼脂20 g，定容至1 L，pH 自然。121 ℃保温灭菌20 min。

察氏培养基：NaNO 3 3 g ，K 2HPO 4 1 g ，MgSO 4·7H 2O 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO 4·7H 2O 0.01 g，蔗糖30 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL。pH 值自然。121 ℃保温灭菌20 min。

麦芽汁琼脂：麦芽汁150 mL，琼脂3 g，pH 自然

1.2.3 产阿魏酸酯酶菌株固态发酵麸皮总酚含

93

现代食品科技 Modern Food Science and Technology

[15]

2015, Vol.31, No.7

量的测定

总酚含量测定参考韩富根

的方法，略有改动。

样品处理：取发酵麸皮0.5 g，加3 mL 95%乙醇

研磨成匀浆状，再加5 mL 95%乙醇过滤，用95%乙醇定容至25 mL。以儿茶酚作标准曲线。

样品测定：取2 mL待测液于10 mL离心管中，再加入2 mL福林试剂，摇匀，3 min后加入10%碳酸钠2 mL振荡。静置1 h后700 nm处比色测定，以2 mL蒸馏水代替待测液作为空白。根据标准曲线计算总酚含量。

步试验，获得8株产阿魏酸脂酶的菌株，对8株菌进行液体发酵麸皮，将其发酵液进行牛津杯透明圈试验测定透明圈大小（见图1、2），由图2可知，菌株6号的透明圈直径最大，其次是菌株1和菌株8。透明圈大小与酶活大小成正相关，根据透明圈的大小，说明6号菌株的阿魏酸酯酶酶活较其他菌株高，将其命名为烟青。这与王洪川的研究黑曲霉发酵麸皮产阿魏酸酯酶酶活结论相同。

[16]

1.2.4 菌种鉴定

1.2.4.1 形态特征观察

将酶活较高的菌株在察氏培养基、麦芽汁琼脂、査氏酵母膏琼脂上生长培养，进行菌落特征和显微镜下其个体形态特征观察。 1.2.4.2 ITS 测序

通过PCR 获得ITS 扩增片段进行鉴定，所得结果在Genbank 上进行同源性比对分析，并利用MEGA3.1构建系统发育树，确定菌种。

图1 Fig.1 Yanq arent circles in Oxford cup method

1.2.5 烟青固态发酵麸皮阿魏酸含量的测定

称200 g 麸皮加水200 g 混合后灭菌，置瓷盘冷却，麦麸厚度控制在2.5 cm 内，烟青种子接种量为0.5%(含菌量为1~2×10个/g)，培养温度为28 酵时间为48 h。将固态发酵麸皮，按比例在40 ℃水浴锅中浸提1 h，于4 离心15 min3 mL入10 mL离心管加r/min离心15 min，

HPLC XBP C18(L)(4.6 mm×，10 1%冰乙酸:320 nm20 ℃，流速为0.9 。取100%甲醇40、60、80、100、120、

图2 8株菌牛津杯试验透明圈大小结果

Fig.2 The size of transparent circles produced by 8 isolated strains

in Oxford cup test

9

2.2 产阿魏酸酯酶活力比较

根据透明圈试验结果，选择1、2、6、8号菌株进行不同时间发酵麸皮阿魏酸酯酶活力测定，其结果见图3。从图3可以看出，随时间的延长，所有菌株酶活先提高随后降低；除8号菌株第2 d 高于其他菌株外其他时间6号菌株阿魏酸酯酶活力高于其他3株的酶活力，而且在发酵第4 d 麦麸发酵液中阿魏酸酯酶酶活水平为最高为32.7 mU/mL，则发酵麸皮固体中阿魏酸酯酶酶活为163.5 mU/g，随着时间的延长酶活逐渐下降，且有显著性差异（p

1.3 采用SPSS 17.0系统进行数据的统计性分析，显著性差异采用Duncan 分析。

2 结果与讨论

2.1 产阿魏酸酯酶菌株的筛选

从土壤中筛选出54株，对其进行平板透明圈初

94

现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2015, Vol.31, No.7

继续生长的需求，菌丝随之进入繁殖阶段，分泌出来的胞外酶减少，从而酶活在某一时间内开始降低。

究采用微生物发酵方法，发现麸皮通过6号菌株初步发酵，总酚酸比没发酵的麸皮量提高了6.6倍。如果通过发酵工艺条件的优化，总酚酸的释放量会提高更多，这对谷物麸皮的利用价值提升提供了理论依据，因此将6号菌株烟青进行菌种鉴定。

2.4 产阿魏酸酯酶菌种鉴定 2.4.1 烟青形态鉴定

图3 不同菌株不同发酵时间阿魏酸酯酶活力 Fig.3 Feruloyl esterase activity of various strains at different

fermentation periods

2.3 产阿魏酸酯酶菌株固态发酵麸皮总酚含量比较

hology

图6 个体形态图（放大倍数400倍） Fig.6 Cellular morphology (400 magnification)

6号菌株烟青在察氏培养基上菌落生长速度较

图4

Fig.4 Total q by d慢，培养7 d直径30 mm；质地丝绒状至粉粒状，菌丝体白色，分生孢子结构呈暗蓝绿色，无渗出液（图5）。在麦芽汁琼脂上菌落生长速度较快，培养7 d 直径45 mm，平坦，质地粉粒状，分生孢子结构多，灰绿色，菌落反面红褐色。在査氏酵母膏琼脂上菌落培养7 d直径40 mm，质地丝绒状；分生孢子结构多，呈灰蓝色，边缘较稀，呈白色，无渗出液。

从图6可知，显微镜下可以观察到分生孢子头幼时为棒形，分生孢子梗发生于基质，孢梗茎长短不一；顶囊由孢梗顶端逐渐膨大成为棍棒形，直径50~60 mm ，产孢子结构单层，瓶梗密集这生于顶囊的全部表面，瓶梗大小8~12 μm×2~3 μm；分生孢子为椭圆形，孢子大小4~5 μm×3 μm，壁光滑。

选择1、26、84。从号菌株外其他菌6号菌株d 含量中束缚型酚酸占总量的80%~90%

[17]

。通过上述4

株菌株发酵谷物麸皮其总酚酸含量得到大大地提高，

而且菌株酶活不同其酚酸释放出的量不同，6号菌株酶活高其麸皮中的酚酸释放量高。束缚型酚酸的释放一般利用超声辅助酸碱作用或者酶反应来实现进行酚酸成分的释放[18-20], 郝杰等[18]在经过超声辅助碱解释放之后，麦麸中游离的总酚含量提高了7.23倍，本研

2.4.2 烟青ITS 扩增测序

烟青通过26S rDNA PCR产物电泳图如下（图7），

经纯化获得ITS 扩增片段，通过测序得到一个长度为654 bp的rDNAITS 序列如下：

TTTCCGTAGG TGAACCTGCG GAAGGATCAT TACCGAGTGC GGGCCCTCTG GGTCCAACCT 60

95

现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2015, Vol.31, No.7

CCCACCCGTG TTTATCGTAC CTTGTTGCTT CGGCGGGCCC GCCGTCTTCG GACGGCCGCC 120

GGGGAGGCCT CCGCGCCCCC GGGCCCGCGC CCGCCGAAGA CCACAACATG AACTCTGTTC 180

TGAAGTTTTG CAGTCTGAGT TGATTATCAT AATCAGTTAA AACTTTCAAC AACGGATCTC 240

TTGGTTCCGG CATCGATGAA GAACGCAGCG AAATGCGATA ACTAATGTGA ATTGCAGAAT 360

TCAGTGAATC ATCGAGTCTT TGAACGCACA TTGCGCCCCC TGGTATTCCG GGGGGCATGC 420

CTGTCCGAGC GTCATTGCTG CCCTCAAGCA CGGCTTGTGT GTTGGGCCCC CGTCCCCGGT 480

TTCCCGGGGA CGGGCCCGAA AGGCAGCGGC GGCACCGCGT CCGGTCCTCG AGCGTATGGG 540

GCTTTGTCAC CCGCTCTTGT AGGGCCGGCC GGCGCCTGTC GACACCAACC CAATTTTTCT 600

AAGGTTGACC TCGGATCAGG TAGGGATACC CGCTGAACTT AAGCATATCA ATAA 654

表明菌株烟青与烟曲霉（Aspergillus clavatus ）比对相似度为100%。

内转录间隔区ITS 进行PCR 扩增，测序后，将结果再进一步与NCBI 数据库进行比对并构建系统发育树。

products

将该序列提交至

GenBank 进行同源性比较，结果

图8 系统进化树 Fig.8 Phylogenetic tree

2.4.3 烟青系统发育树

将菌株ITS 基因序列与GenBank 中的已知序列进

96

行了分析比对，从GenBank 中取得相关序列作为参考菌株序列，首先使用ClustalX 将序列进行完全比对，

现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2015, Vol.31, No.7

然后使用程序Mega 的Neighbor-joining 法、Minimum evolution 法对其作系统进化树。数据自展重抽样次数1000次。经测序得出烟青的ITS 所得结果在Genbank 上进行同源性比对分析，并利用MEGA3.1构建系统发育树（如图8），从图8中可以看出，供试菌株烟青与Aspergillus clavatus 处于同一分支，进化上的距离最近。与烟曲霉（Aspergillus clavatus ）同源性达100%。根据上述烟青的形态特征、菌落特征和ITS 序

列分析，故烟青为烟曲霉（Aspergillus clavatu）。

对6号菌株烟青提取基因组DNA ，并以其为模板对

曲霉（Aspergillus clavatus）命名为烟青。利用烟青发酵麸皮进行生物法获取更大的总酚酸及阿魏酸，该法操作简单，发酵时间短，易于控制不需要额外添加其他营养物质，对提高麸皮的利用价值提供了理论依据。

2.5 烟青固态发酵麸皮阿魏酸含量的测定

将烟青发酵第4 d 的麦麸进行HPLC 测定阿魏酸

含量。阿魏酸标样标准曲线见图9，标准曲线为

2

y=311134x+202717，R =0.9969，通过HPLC 测定其发酵的麦麸中阿魏酸为0.697%，没有发酵的麸皮阿魏酸含量为0.467%，发酵提高了0.22%，在小麦麸皮中阿魏酸的含量一般为0.4~0.7%[1]，该菌株发酵麸皮产生阿魏酸酯酶，能将麦麸中阿魏酸游离出来，从而提高了麦麸中阿魏酸的含量，说明该菌株发酵是提高麦麸阿魏酸含量的一种有效的途径。阿魏酸的HPLC 测定图谱见图10。

[21]

10 sample and that

from Yanq ing- fermented bran sample

[1] 张伟, 耿欣. 不同食品中阿魏酸含量的分析[J].食品研究与

开发,2012,33(8):126-128

ZHANG Wei, GENG Xin. Analysis On Contend Of Feruilic In Different Food [J]. Food Research and Development. 2012, 33(8): 126-128

[2] YU Pei-qiang, David D Maenz, John J McKinnon, et al.

Release of ferulic acid from oat hulls by aspergillus ferulic acid esterase and trichoderma xylanase [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50(6): 1625-1630 [3] LIU R H. Whole Grain Phytochemicals and Health [J].

Journal of Cereal Science,2007,46(3):207-219

[4] Krygier K, Sosulski F, Lawrence H. Free, Esterified and

Insolublebound Phenolic Acids. Ⅱ:Composition of Phenolic Acids in Rapeseed Flour and Hulls [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1982, 30(2): 334-336 [5] WANG Bini, LIU Hai-feng, ZHENG Jian-bin, et al.

Distribution of Phenolic Acids in Different Tissues of Jujube and Their Antioxidant Acitivity [J]. Journal of Agricultural

97

ard curve

3 结论分离建立了一个54株菌的菌种库，得到了具有较高产阿魏酸酯酶的8株菌，其中6号菌株的阿魏酸酯酶酶活优于其他菌株在第4 d 的时候，该菌株的阿魏酸酯酶酶活达最高；而且发酵麸皮释放总酚酸的能力较高，将麸皮的总酚酸量提高6.6倍，其中阿魏酸的量达到0.697%，较未发酵的提高了0.22%。对其进行分子鉴定，得出该菌株与烟曲霉（Aspergillus clavatus ）同源性达100%，该菌株为烟

现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2015, Vol.31, No.7

and Food Chemistry, 2011, 59(4): 1288-1292

[6] WANG Jing, SUN Bao-guo, CAO Y an-ping, et al.

Optimisation of Ultrasound-Assisted Extraction of Phenolic Compounds From Wheat Bran [J]. Food Chemistry, 2008,106:804-810

[7] Wataniyakul P, Pavasant P Goto, et al. Microwave

Pretreatment of Defatted Rice Bran for Enhanced Recovery of Total Phenolic Compounds Extracted by Subcritical Water [J]. Bioresource Technology, 2012, 124: 18-22

[8] Liyana-Pathirana C M, Shahidi F. Importance of Insoluble-

Bound Phenolics to Antioxidant Properties of Wheat [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006, 54(4): 1256-1264

[9] V erma B, Hucl P, Chibbar R N. Phenolic Acid Composition

and Antioxidant Capacity of Acid and Alkali Hydrolysed Wheat Bran Fractions [J]. Food Chemistry, 2009, 116: 947-954

[10] Hegde S, Kavitha S, V aradaraj MC, et al.Degradation of

Cereal Bran Polysaccharide-Phenolic Acid Complexes by Aspergillus CFR1105 [J]. Food Chemistry, 2006, 96: 14-19 [11] WANG Jing, SUN Bao-guo, CAO Yan Ping, et al. In Vitro

Fermentation of Xylooligosaccharides From Wheat Bran Insoluble Dietary Fiber by Bifidobacteria [J]. Polymers, 2010, 82(2): 227-538

[12] Manisseri Chitsseri, Gudipati, Muuralishna. xylo-oligosaccharides 2010, 43(3): 421-430

[13] Mathew S, Abraham T E. S tudies on the Production of

Feruloyl Esterase from Cereal Brans and Sugar Cane Bagasse by Microbial Fermentation [J]. Enzyme and Microbial [14] Aikat K, Bhattacharyya B C. Protease Ex traction in Solid

State Fermentation of Wheat Bran by a Local S train of Rhizopus Oryzae and Growth Studies by the Soft Gel

from

wheat

bran

polysaccharides [J]. LWT-Food Science and Technique [J]. Process Biochemistry, 2000,35(9):907-914 [15] 韩富根, 刘学芝, 焦桂珍. 用福林法测定烟叶中总酚含量的

探讨[J].河南农业大学学报,1993,1(27):95-98

HAN Fu-gen, LIU Xue, JIAO Gui-zhen. The Use of Folin Method for Determining the Total Phenols Content in Tobacco Leaves [J]. Acta Agrieulturae Universitatis Hermnensis, 1993, 1(27):95-98

[16] 王洪川, 陈洪章. 高产阿魏酸酯酶菌株的筛选及其固态发酵

的研究[J].食品与发酵工业,2007,33(4)11-15

WANG Hong-chuang, Chen Hong-gao. Screening of High Producing Feruloyl Esterases Strain and S tudy on Its Solid State Fermentation Conditions [J]. Food And Fermentation Industry, 2007, 33(4): 11-15

[17] 郝杰, 张长虹, 曹学丽. 七种谷物麸皮中的酚酸类成分分析

[J].食品科学,2010,10(30):263-268

HAO Jie, ZHANG Chang-hong, CAO Xue-li. RP-HPLC Analysis of Phenolic Acids in Different V arieties of Gereal Bran [J]. Food Science, 2010, 10(30): 263-268

郝杰, 曹学丽. 小麦麸皮中束缚型酚酸的化学法释放工艺[J].

,2010,18(31):130-135

HAO Jie, CAO Xue li. Optimization of Chemical Release of Bound Phenolic Acids From Wheat Bran [J]. Food Science, 2010,18(31):130-135

[19], 张颖, 张璟, 等. 碱解麦麸制备阿魏酸的研究[J].食品

科学,2002,8(23):162-165

张璟, 欧仕益, 张宁, 等. 酶解麦麸制备阿魏酸和低聚糖的研

究[J].食品科学,2003,24(11):63-68

ZHANG Jing, OU Shi-yi, ZHANG Ning, etal. Processing Study on Ferulic Acid and Oligosaccharides Prepared From Enzymatin Hydrolysis of Destorched Wheat Bran [J]. Food Science,2003,24(11):63-68

[21] Sindhu Mathew, T Emilia Abraham. Ferulic acid: an

Antioxidant Found Naturally in Plant Cell Walls and FeruIoyl Esterases Involved in Its Release and Their Applications [J]. Critical Reviews in Biotechnology, 2004, 24(2-3): 59-83

98