西尼罗河病毒的检测多重PCR连接酶检测反应检测发展

西尼罗河病毒的检测多重PCR，连接酶检测

反应检测发展

西尼罗河病毒（WNV）首次在乌干达的病人于1937年分离（32），已经成为日本脑炎病毒（乙脑）的最广泛的成员（2）。它在1999年在西半球的首次出现，在纽约市（10，22，

26）报告里西尼罗病毒性脑炎62例，7人死亡。在2000年（36，37），由纽约市健康与心理卫生署发起的蚊子池的监察计划，并献血筛查被引进美国于2003年6月在美国报告23个人中16人毒血症在过去一年（8，33）。由于其进入美国，该病毒已迅速蔓延，目前在41个国家流行和哥伦比亚特区（11）。

西尼罗病毒株，主要属于两个不同的谱系，表现出相当的基因多样性，在临床和环境样本的识别和检测构成了挑战。宗族1包括来自几大洲的菌株，并可以细分成至少有三个分支，分支1A，其中包括来自欧洲，非洲，美国和以色列的菌株分支1B，这是针对从澳大利亚库京株;和分支1C，其中包括2株来自印度。宗族2西尼罗病毒株包括来自非洲撒哈拉以南地区和马达加斯加（6，20）。宗族2株之间遗传距离特别大为（75.7至76.8％），观察宗族1株（95.2至99.9％）（20）。

除了这种固有的多样性，西尼罗病毒和隔离新病毒株的各种谱系的蔓延正在不断认可。一个宗族2株在欧洲中部（2），报道最近从欧洲中部和南部俄罗斯的两个新菌株的特点，其遗传距离的基础上，可以考虑西尼罗病毒是独立的谱系（谱系3和4）或乙脑组新成员（1）。此外，北美菌株的系统发育分析表明在纽约原型基因组突变WN-NY99积累应变导致新的遗传变异（5，13，20）。

蚊子池和筛选的血液供应主要由反转录（RT）-PCR为基础的核酸扩增检测（NAT）的方法（31，33）。尽管基因的多样性，最近水平的研究表明，低于40％的参加实验室检测宗族2株（28）。分子检测方法是敏感的，还能够检测出两个谱系，以及众多西尼罗病毒的新兴株特征的病毒，是必要的（34）。

在这份报告中，我们描述了一个新的发展，都基于多重RT-PCR和连接酶检测反应（LDR）的谱系（图1）。LDR最初是为受歧视的单碱基突变或多态性（3，4）。该技术已被用于检测癌基因突变和单核苷酸多态性（14-16，18，19）以及最近的探测和识别细菌在临床血液样本（29）。

我们描述了西尼罗病毒蚊子池样品，临床分离株，以及国家和国际，株检测和鉴定技术的验证。高灵敏度和广泛覆盖的多重RT-PCR/LDR法可以使西尼罗河病毒的血清诊断得到有价值的补充，尤其是在早期症状的患者。此外，该技术的复用能力使得它适合于发展为一个更全面的病毒原体检测。

材料与方法 病毒：在这项研究中所用的西尼罗病毒株来自乌干达，法国，以色列，纽约（NY99）（见表

1）属于欧洲诊断网络进口的病毒和由M.Niedrig在罗伯特·科赫研究所提供的，柏林，德国

（28）。所有其他菌株由从来自世界新出现的病毒和虫媒病毒在得克萨斯医学科大学加尔维斯顿（7）中心获得。

灵敏度测试，西尼罗病毒负载面板添加NY99病毒定义稀释血浆样本，请提供由R.兰乔蒂中心疾病控制与预防中心（CDC）在柯林斯堡部媒介传播的传染病，一氧化碳（

21）。面板滴度为0.15 PFU/ ml的（量化标准斑块检测180,000）。从各种渠道获得用于其他黄病毒的特异性确定。圣路易斯脑炎，墨累河谷热，Powassan脑炎，黄热病病毒，获得R.兰乔蒂（CDC堡柯林斯）；乙脑和森林脑炎病毒获得M.Niedrig（罗伯特·科赫研究所，柏林，德国）；从研究区和登革热病毒血清型I至IV获得盎司（登革热疾病预防控制中心在波多黎各的圣胡安）（见表2）。

蚊子池和临床标本。获得98个积极和20消极的蚊子池样品，从纽约市健康与心理卫生署（纽约DOHMH），西尼罗病毒监测计划（36，37）的一部分，在纽约市的不同地区收集和测试抓来的蚊子。

从50 NAT阳性献血者和92的NAT负捐助者的血浆样品进行了测试。休斯敦，得克萨斯州墨西哥湾沿岸地区血液中心提供的阳性血浆样本；从CDC登革热分公司在波多黎各的负面标本。二十个额外的血浆样本检测呈阳性的登革病毒和西尼罗病毒，由在波多黎各疾病预防控制中心提供。最初的引物验证的额外样本从获得美国红十字会的国家检测和在马里兰州盖瑟斯堡参考实验室获得。

RNA提取。2000g 3分钟，根据制造商之指示，从蚊子池匀浆标本离心澄清。采用QIAamp

病毒RNA小型试剂盒从蚊子池上清液和临床标本中提取病毒RNA样品，以及病毒种子（Qiagen，瓦伦西亚，CA）。

多重PCR/LDR的目标区域的选择。36个西尼罗河病毒的完整基因组序列从GenBank数据库（2005年1月访问）对齐使用CLUSTALW算法的选择最佳的引物结合区域。这些

地区的特点是不同的西尼罗病毒株程度较高的养护，从而达到最大应变覆盖。对引子部分重叠的序列进行设计，同时放大三个不同地区（集成DNA技术，科勒尔维尔，IA）。一个区域是在非结构蛋白NS2A编码序列，两个地区在非结构蛋白NS5区（分别为6，8,8个共有22个引物，用于PCR引物）。每个引物序列包含不超过两个退化的立场，并有一个大约80°C间的熔融温度（见表3）。

高灵敏度的一个主要障碍，在其他系统中用PCR扩增一直是潜在的错误扩增和引物二聚体的指数增长，从而在相同的反应混合物中使用太多的PCR引物。我们利用PCR引物，含5上提出的普遍尾巴序列（5 GCCAACTACCGCAACAC-3）和反向（5-CCAACTACCGCAACCA3）引物（表3）规避这种潜在的陷阱。引物二聚体和短期异常扩增不健全有效，因为这类产品形成狭长结构。正确的PCR产品是高效扩增的正确大小（300至600个基点），而错误扩增不健全。我们已经成功地应用了这一战略，而标准的多重PCR却失败了（12，15，17）。

LDR引物，选择三个不同的保守区域内的三个PCR扩增，就像PCR引物设计，实现最高的应变覆盖的意图。每个的LDR对引物，上游承载20-MER编码补充序列的探针在5’底和下游探头，带有6- 羧基荧光在3’底。编码补充是独特的20-mer寡核苷酸序列互补的编码在普遍的DNA芯片上（18）。

在LDR中，上游和下游的探针杂交的模板序列，并结扎发生时，在结扎交界处才会有完美的互补性（图1）。四十九个LDR目的设计引物共有9个地区（3个LDR每对引物PCR产物），检测尽可能多的和潜在的新变种株（见表4）。

产品的LDR长度从72至88基点不等。寡核苷酸探针（综合DNA技术，科勒尔维尔，IA）被设计有类似的热力学特性，并避免发夹和自我二聚体的形成。

两步多重RT-PCR。上标第一链合成系统用于RT-PCR（Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州）和随机引物在60升容积进行逆转录反应。简单地说，蚊子池，或从临床标本中提取RNA的20升50毫微克/毫升随机引物，3升脱氧核苷三磷酸腺苷（核苷酸）的混合物，1升水， 65°C变性混合5分钟。在冰上冷却后，逆转录缓冲液（20毫米的Tris-HCl，50 mM的氯化钾），氯化镁5毫米，0.01 mol二硫苏糖醇，2个U RNaseOUT潜伏期在25°C。六个单位标二RT加入，混合物先在25°C孵育10分钟，然后在42°C加热50分钟。在70°C加热15分钟终止反应。降解残留的RNA或RNA的DNA杂交卵裂核糖核酸酶实现潜伏期在37°C为20分钟。

五微升的新合成的cDNA遭到多重PCR扩增，体积为25 L，其中1 GeneAmp PCR黄金缓冲区，1.5毫米氯化镁，200M每个的dNTP，PCR引物各5 pmol，和Taq聚合酶1铀（AmpliTaq金牌;应用生物系统公司，福斯特城，加利福尼亚）。进行了10分钟的潜伏期在95°Ç热启动Taq激活，共40个循环后，每个变性步骤在94°C时为30秒。，，一个在60°C退火的步骤1分钟，和一个扩展步骤在72°C1分钟。最后一次延长一步在72°C10分钟。在每一轮被列入非模板的阴性对照和西尼罗河病毒基因阳性对照。在Perkin-Elmer GeneAmp PCR系统9700热循环仪（Applied Biosystems公司，福斯特城，加利福尼亚州）所有PCR热循环进行。扩增产物在2％琼脂糖凝胶电泳进行可视化。 一步法多重RT-PCR。另外，从临床标本中提取RNA是一个一步到位的多重RT-PCR（OneStep RT-PCR检测试剂盒，QIAGEN，瓦伦西亚，加州）。简单地说，15升的RNA加入到最终体积50升，含1 OneStep RT-PCR扩增缓冲液，0.4毫米dNTPs浓度，0.6 M每个PCR引物，和2升OneStep的RT-PCR酶混合物。RT（50°C时为30分钟），随后在95℃变性步骤15分钟和45周期的放大（94°C的30秒，60°Ç为1分钟，72℃1分钟为），最后延伸一步，在72°ç10分钟。

多重的LDR。LDRs被加入到最后体积为20升，含有5升DNA扩增，1升LDR缓冲区（20毫米的Tris[pH值7.6，10 mM的氯化镁，氯化钾100毫米），1毫米和1毫米，二硫苏糖醇，250摩尔每个的LDR底漆，0.01 mol AK16D DNA连接酶（4，25）。

LDR混合物为30秒20圈热循环在94°C和4分在64°C。在此之前的LDRs，混合物含7.5毫摩尔每底漆的LDR磷酸化在30 - 1升激酶反应混合物T4连接酶缓冲（50毫米的Tris-HCl，10毫米10毫米，1毫米二硫苏糖醇，三磷酸腺苷氯化镁，25克/毫升牛血清白蛋白）和10 U的T4的激酶(New England BioLabs, Ipswich, MA)。混合物在37°C孵育60分钟，随后10分钟的潜伏期在65°C和储存在4°C。

毛细管电泳（CE）。随后LDR，混合水稀释1:10，2升被添加到8升的一个CE主含高迪甲酰胺的混合物（Applied Biosystems公司的Foster City，CA）和0.3升的GeneScan500莉兹规模标准（应用生物系统的Foster City，CA）。CE的混合物在94℃变性2分钟，在冰上冷却。LDR产品进行了分析在13730 DNA分析仪（Applied Biosystems公司，福斯特城，加利福尼亚州）。一个样本被认为是西尼罗病毒阳性时，最小的2的LDR在任何三个PCR扩增产品能被CE检测。

通用基因芯片技术发现和杂交条件。通用芯片的制备，通过发现的独特的20-MER邮政编码寡核苷酸（12，14，15，18）在活化Codelink幻灯片（GE Healthcare公司，新泽西州，皮斯卡塔韦）与QArray迷你机器人阵列打印机（Genetix，马萨诸塞州波士顿）根据制造商的指示。编码到384微孔板接种在25研究的最终浓度在50mM磷酸钠（pH值8.5）。一个1米的基准寡核苷酸的浓度添加到印刷的混合物在每口井与每一编码地址。一个羧基-X-罗丹明标记的基准的补充包括在杂交混合物中以确定位置和每个点的质量。机器人进行印刷在10℃，湿度50％至60％。在饱和NaCl室过夜孵育打印幻灯片然后用阻塞的解决方案（0.1三中号，50毫米乙醇胺pH值9.0）阻止残余反应的羧基。每个打印布局包含一个共发现一

式两份（见图4D）96号邮编代码解决。九个编码地址补充追加到西尼罗病毒，特定的上游

引物的

LDR。其他阵列上的编码是相辅相成的编码补充LDR引物具体的其他血液传染病毒的病原体（登革热病毒和其他出血热病毒）。LDR产品从一个子集的九蚊池样本阳性和阴性对照，在94℃变性3分钟，冷冻在冰杂交阵列之前。杂交液组成的LDR产品的整个体积，5 SSC，0.1％SDS，0.1毫克/毫升的鲑鱼精子DNA（Fisher Scientific），5纳米浓度的基准在总体积为30升。杂交液应用到芯片幻灯片与多室ProPlate幻灯片模块（格雷斯生物实验室）。在杂交杂交烘箱内，黑暗中摇晃平台上进行在60°C为2小时。（实验室线;厂商VWR西切斯特宾夕法尼亚）。幻灯片冲洗，60℃的15分钟与1LSDS洗。两次更多的洗涤之后，首先在22°C为1 min后，用0.2SSC然后用0.1SSC，在22°C为1分钟。干纺和幻灯片上ProScan阵列芯片扫描仪（Perkin Elmer公司，韦尔斯利，马萨诸塞州）扫描。

LOD值。测量一个西尼罗病毒负载面板检测的检测限（LOD），含有添加NY99病毒定义稀释血浆样本。面板滴度为从180,000到0.15 CFU / ml（量化标准斑块检测）。稀释范围从1800 PFU/ ml的0.07 CFU / ml为进行了测试。对于每个稀释，提取RNA，从140等分采用QIAamp病毒RNA小型试剂盒（QIAGEN，瓦伦西亚，CA）如上所述。RNA的遭到的一步或两步多重RT-PCR如上所述，随后由复用的LDR和CE如前面所述。一步法（140升等分提取成最终体积为60升的RNA，其中15升用于RT-PCR技术）和2.8PFU用于两步法（140升等分提取到一个60升的RNA，其中20升在RT步骤在一个60升的总容积，这个60升的cDNA，2升的体积被用于PCR步骤）。

结果 PCR/LDR/CE引物的选择和验证。多重PCR/ LDR/ CE的检测，检测西尼罗病毒的基础同时筛选三个西尼罗病毒基因组区域（图1）。三个目标区域进行了初步测试，分别由执行应用PCR / LDR / CE的检测，每个地区的具体引物（图2A至C）。在这种方式，它是可能评估每个地区的底漆性能和确保每个检测来自预期的LDR产品。在初步评估阶段，进行西尼罗病毒文化以及西尼罗病毒阳性的血浆样品从美国红十字会，未能出示PCR扩增的LDR产品之一的引物被丢弃和更换新设计的引物（数据未显示）。

特定区域的LDR每个地区生产的产品在72，79和80峰区域1（伴随着81基地的小高峰，从一个单碱基差异的引物结扎产生在结扎站点之一）；79，86，88峰区域2；80，82，84峰区域2（图2A到C）。图2D显示获得CE资料，当所有三个西尼罗病毒地区LDRS的复杂程度。具有相同长度但不同序列的LDR产品（由于使用简并寡核苷酸），可以在不同的位置迁移在CE上，从而扩大峰附近的山峰重叠。一个阳性样本的识别算需要存在至少有两个LDR从任何一个扩增LDR产品检测从任意两个扩增，至少有两个独立的山峰。没有具体的高峰需要存在。累计剖面复用的LDR是足够积极找出一个样本。

LOD值。以评估耶和华西尼罗病毒多重PCR/ LDR/ CE认证检测，我们测试的病毒载量的面板含有西尼罗病毒系列稀释飙升plasmasamples。耶和华确定后执行RNA提取，逆转录，和多重PCR/LDR/CE认证，有人计算检测使用两个步骤的方法，一步多重RT-PCR。

在两个步骤的方法，随机进行大鼠引物，其次是地区特异引物的PCR扩增。这种方法允许从面板含11 PFU/ ml的病毒载量检测样品稀释。这相当于0.017 PFU的负载。以前的研究使用NY99病毒株在Vero细胞生长的筹备工作一直表明，1 PFU代表500份（30;河兰乔蒂个人通信）。因此，根据这些计算的基础上，应用PCR /的LDR耶和华约8个基因组拷贝。

一步多重RT-PCR方法允许检测病毒载量的面板含0.15PFU/ ml的稀释，约70倍小于集中发现的两步法检测。使用此方法的耶和华相当于0.005 PFU或2.5基因组份（图3）。这可媲美其他检测系统，包括那些检测谱系1和2，如FDA许可的Procleix系统（21，23，

24）。

灵敏度和特异性多重PCR/的LDR/CE认证。多元化PCR/LDR/CE系统的敏感性由西尼罗病毒文化，环境和临床标本决定。样本被认为是西尼罗病毒阳性当最小2个LDR产品在任何三个PCR扩增中被检测到。西尼罗病毒文化包括来自19个国家的34株（表1），这属于谱系1和2，以及库京Rabensburg病毒。所有的菌株呈阳性，除外的Rabensburg病毒和印度两个分离的。同时Rabensburg病毒和两名印度分离，但产生了积极的PCR扩增产物电泳后可见，这表明LDR没有工作。

为了评估该方法的特异性，其他七个黄病毒进行了测试，如表2所列。虽然他们中4个（圣路易斯脑炎病毒，黄热病病毒，墨累山谷热病毒，乙脑）产生PCR扩增被琼脂糖凝胶电泳检测出来，没有结扎后的LDR产品获得。98个汇集蚊匀浆，此前的测试正根据纽约DOHMH两步多重聚合酶链反应PCR/LDR/CE认证检测。但一个样品产生了积极的信号约99％的敏感性。二十个的西尼罗病毒负蚊子池进行了测试，发现没有误报。

五十西尼罗病毒阳性血浆样本具有代表性的浓度范围（至少100拷贝/ ml）在德克萨斯州墨西哥湾沿岸地区血液中心。这些样品进行RNA提取和并行测试两个步骤，一步多重PCR/LDR/CE认证方法。虽然一个循序渐进的方式，在所有50个样品100％的敏感性检测西尼罗河病毒的RNA，两步协议显示，82％的敏感性（50中有41检测出阳性标本）。九十

二额外负西尼罗病毒的血浆样品，连同另外20个登革热病毒呈阳性，但西尼罗病毒负样本（从疾病预防控制中心，波多黎各），被列入分析。共有112的西尼罗病毒负血浆样品检测没有误报，提供100％的特异性。

通用DNA芯片。九个积极西尼罗病毒蚊子池样本的一个子集通用DNA芯片测试作为替代读数系统的通用DNA芯。成功结扎的LDR引物形成的结果LDR产品，承担5’s底编码补充和荧光标记在3’s底。普遍的DNA芯片允许通过编码杂交的结扎产品的检测，配合阵列上发现的编码。这些样本所取得的成果表明，通用阵列可以从九个不同的LDR产品检测出荧光信号，正确杂交，其指定的阵列上的位子（图4）。这表明检测可以通过CE或作为最终读数的通用阵列进行进行。

讨论 在这份报告中，我们描述了一个新的西尼罗河病毒检测方法的基础上的多重RT-PCR检测通过的LDR的发展。我们的检测策略是基于在西尼罗河病毒基因组中找到属于两个谱系的不同菌株之间的地区最稳定的。然后，我们设计了西尼罗病毒特定的RNA（放疗后）所需的特异性扩增的PCR引物而容忍序列变异更不健全的人类RNA。同样LDR引物设计特别的结扎，即使目标序列在不同的三个位置。. 高灵敏度的初始RT-PCR步骤，用简并引物，可以容忍一些不匹配，这是特异性高的LDR步骤所补充的。别致的具体耐高温AK16D允许结扎只有当交界处之间的配对的寡核苷酸序列与模板序列互补的DNA连接酶允许LDR使用。这种类型的检测，是理想的复用，因为几个引物沿模板可以结扎，没有以聚合酶为基础的检测（18，19）中所遇到的干扰。

多元化RT-PCR/LDR/CE测试评估蚊子池和临床标本，临床标本受到一步和两步RT - PCR协议。蚊子池样品获得的灵敏度为98％; 只有样品给予了否定的结果进行了测试在纽约DOHMH, 它被证实为阴性，提示可能的样品降解。

一步协议测试的西尼罗病毒阳性的临床标本，使用目标特异引物，RT及PCR检测灵敏度为100％。另一方面，用两步法，随机引物用RT步骤，82％的样本给予了积极的结果。高灵敏度的一步法与两步的方法可能会导致从前者超过后者的方法有更好性能，这表明在负载测试（图3）。虽然蚊子池由两个步骤的方法获得的灵敏度似乎并没有被这个缺点影响，据报道，mRNA水平低（如对蚊子池预计将在临床标本中发现的），特定基因的启动提供了一个更敏感的方法（35）。

当对34个不同的西尼罗病毒株测试评估，LDR未能检测到的Rabensburg应变和两个属于分支1C印度分离，作为新的证据显示，形成了鲜明的第五个系（9）。这些菌株设计基因组序列时的LDR设计引物。对准的Rabensburg和IND804994株序列，至今已出版，展示他们太发散而不能成功与最初的引物退火。由于LDRs可高度复用而不影响的结扎效率（14，29），允许这些菌株的检测的引物可能很容易被纳入该法的未来版本。该技术的灵活性将允许扩展到包括以类似的方式出现新的西尼罗病毒株的检测。

在过去的几年中，在我们的实验室（12，14-16,19）PCR/的LDR方法已应用于多个应用程序。LDR与特定的附加序列，被称为―邮递区号‖的补充，引物已启用包含指定的寻址邮政编码（16，18），通过一个通用的DNA芯片检测的LDR产品的使用。一个普遍的DNA芯片，提供了完全可编程的优势，并允许无需重新设计的阵列加入新的基因组靶序列。此外，可同时检测不同的病原体，因为杂交事件是由介导的斑点邮政编码和邮政编码补充地方实际病原体的基因组序列的LDR引物。通过病原体检测病原鉴定，相同类型的数组可以被用于不同的生物体，同时不改变斑点探针。

我们团队最近表明，在检测血源性细菌的传染性病原体（29）证明使用PCR/LDR/CE。由于在同一地区频繁的非特异性的临床症状的病毒感染和不同的虫媒病毒的重叠，我们设想

一个类似的方法来检测血液传播病毒的病原体，无论是在临床标本和环境监测。使用检测和鉴定的一种普遍的DNA芯片的多重RT-PCR/LDR的代表了一个方便的工具，由于RNA病毒的频繁序列变异，这可能需要增加检测引物。这种方法可以协助流行病学迅速跟踪未知出血热病毒的新特征。我们同类型的测试设计（未发表资料）临床标本的检测和血清型的登革热病毒的决心，以及其他出血热病毒，为一个全面的病毒检测方法铺平了道路。

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