酪蛋白的制备
上海大学生命科学实验中心
课 程： 学 号：
实 验 预 习 报 告
姓 名： 同组者： 温 度：
日 期：
指导老师： 湿 度：
实验时间：
（一律用A4纸、钢笔书写或打印，不得涂改，经教师签字后方为有效，附在实验报告中一并交。 如无此原始记录或丢失，报告不批示成绩） 实 验 名 称：酪蛋白的制备
1. 目的：学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法，并依此加深对等电点概念的印象。
2. 原理、仪器设备、材料和试剂：
原理：牛乳中主要含有酪蛋白和乳清蛋白两种蛋白质。其中酪蛋白占了牛乳蛋白质的80%。酪蛋白是白色、无味的物质。不溶于水、乙醇及有机溶剂，但溶于碱溶液。牛乳在pH4.7时酪蛋白等电聚沉后剩余的蛋白质统称乳清蛋白。乳清蛋白不同于酪蛋白，其粒子的水合能力强、分散性高，在乳中呈高分子状态。
在处于其等电点时，兼性离子/粒子在溶液中的溶解度降低；如果我们将牛奶的 pH 调到 4.7，就可获得酪蛋白沉淀；下一步，用乙醇、乙醇-乙醚混合物、乙醚来洗涤沉淀物，以去除脂溶性杂质，就可得到较纯的酪蛋白。
试剂：95%乙醇；无水乙醚；乙醇—乙醚混合液 (V/V=1∶1) 。 0.2mol/L pH4.7醋酸—醋酸钠缓冲液3000mL ： A 液：称取NaAc 3H2O 54.44g，定容至2000mL 。
B 液：称取优级纯醋酸（含量大于99.8%）12.0g 定容至1000mL 。
取A 液1770mL ，B 液1230mL 混合即得pH4.7的醋酸—醋酸钠缓冲液3000mL 。 仪器：离心机 ；抽滤装置 ；研钵 ；布氏漏斗 ；容量瓶。
3. 操作步骤及现象记录
1．将20mL pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液预热至40℃。将20mL 牛奶加热至40℃，在搅拌下缓慢地加入20mL 预热的pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液。
2．用精密pH 试纸调pH 至4.7，可见溶液变为乳白色悬浮液。待悬浮液冷却至室温，3000rpm 离心
15min ，弃上清，得酪蛋白粗制品。用6mL 水洗脱沉淀1次，3000rpm 离心10min ，弃上清 在沉淀中加入6mL95％乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤
3．用乙醇-乙醚混合液洗涤沉淀1次，最后用乙醚洗涤沉淀1次，抽干。将沉淀摊开在表面皿上，风干，得酪蛋白纯品。准确称量，计算含量和得率
含量＝
酪蛋白
g ％）
得率＝
测得含量 ×100％
4. 思考题
1. 制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？
答： 1、由于本法是应用等电点沉淀法来制备蛋白质，故调节牛奶液的等电点一定要准确。最好用酸度计测定。2、精制过程用乙醚是挥发性、有毒的有机溶剂，最好在通风橱内操作。3、目前市面上出售的牛奶是经加工的奶制品，不是纯净牛奶，所以计算时应按产品的相应指标计算。
2. 试设计另一种提取酪蛋白的方法。
答：用盐析法，加重金属离子、有机酸、有机溶剂等，都可以使蛋白质沉淀下来。蛋白质沉淀后，离心10分钟（3000r/min）。水洗两次，离心10分钟（3000r/min）。
加入乙醇，搅拌，悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀两次，抽干。沉淀风干，得酪蛋白纯品。加入有机溶剂是除去脂类杂质。 采用3000g ，30min 离心的方法，最后酪蛋白沉到最下面。
3. 用乙醇、乙醇-乙醚和乙醚洗涤蛋白质的顺序是否可以变换？为什么？
答：不能颠倒次序。经过这个次序以后，结晶吸附的溶剂改为乙醚，乙醚沸点低，容易挥散干净，得到纯的结晶。乙醇和乙醚的溶解性能产很远，乙醇实际上介于水和有机溶剂之间，而乙醚是完全的有机溶剂，他们各自去洗涤各自能溶解的物质，从无机（水）到有机（乙醚）。最后用乙醚是因为 它会很快挥发掉 不留痕迹，可得到纯粹的蛋白质。
4. 等电点沉淀蛋白质的原理是什么？
答：在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零(即正负电荷相等) ，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物