花生种子脂肪酶活力定量测定及其与储藏特性的相关性
作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(9): 16761682
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9
http://www.chinacrops.org/zwxb/
E-mail: [email protected]
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.01676
花生种子脂肪酶活力定量测定及其与储藏特性的相关性
高 奇1,3 张 瑛1,2,* 刘 泽1 张正竹3,* 吴跃进2 禹山林4 张 琛3 滕 斌1 吴敬德1 蒋 岚1
2
安徽省农业科学院水稻研究所 / 安徽省水稻遗传育种重点试验室, 安徽合肥 230031; 中国科学院安徽省离子束生物工程学重点试
34
山东省花生研究所, 山东验室, 安徽合肥 230031; 安徽农业大学农业部茶及药用植物安全生产重点开放试验室, 安徽合肥 230036;
青岛 266100 1
摘 要: 对已有水稻脂肪酶活力比色测定方法进一步修改和优化, 建立了花生脂肪酶活力定量测定方法, 并确定取样量5 mg、底物浓度30 mg mL–1为最适试验条件, 该方法具有精确性好、特异性强、重复性好等特点。利用该方法检测216份花生种质资源的脂肪酶活性, 表明不同材料间差异极显著(P
Quantitative Determination of Peanut Seed Lipase Activity and Its Correlation with Storage Characteristics
GAO Qi1,3, ZHANG Ying1,2,*, LIU Ze1, ZHANG Zheng-Zhu3,*, WU Yue-Jin2, YU Shan-Lin4, ZHANG Chen3, TENG Bin1, WU Jing-De1, and JIANG Lan1
1
Rice Research Institute, Anhui Academy of Agricultural Sciences / Anhui Province Key Laboratory of Rice Genetics and Breeding, Hefei 230031,
China; 2 Anhui Province Key Laboratory of Ion Beam Bioengineering, Chinese Academy of Sciences, Hefei 230031, China; 3 Tea and Herbs Key Laboratory Safety, Anhui Agricultural University, Ministry of Agriculture, Hefei 230036, China; 4 Shandong Peanut Research Institute, Qingdao 266100, China
Abstract: Based on colorimetric determination method reported for rice lipase, we established a new method improving and op-timizing the measurement for peanut seed lipase activity, with the optimum sampling amount of 5 mg and substrate concentration of 30 mg mL–1. The method was validated to be accurate, specific and well repeatable. The lipase activities of 216 peanut germ-plasm resources were detected, with significant difference (P
Keywords: Peanut; Lipase activity; Quantitative determination; Storage characteristics
花生是重要的食用植物油资源和经济作物, 其食用植物油年产量占世界总量的近14%, 居世界第
4位; 我国花生种植面积仅次于油菜和大豆, 但总产和单产一直位居全国油料作物之首, 占油料作物总
本研究由安徽省自然科学基金资助项目(11040606M97), 安徽省优秀青年基金项目([1**********])和安徽省水稻遗传育种重点试验室开放基金项目(SD2009-4)资助。
*
通讯作者(Corresponding authors): 张瑛, E-mail: [email protected]; 张正竹, E-mail: [email protected], Tel: 0551-2160182,
0551-2160453
第一作者联系方式: E-mail: [email protected]
Received(收稿日期): 2011-02-12; Accepted(接受日期): 2011-05-27; Published online(网络出版日期): 2011-06-28. URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20110628.1011.021.html
第9期
高 奇等: 花生种子脂肪酶活力定量测定及其与储藏特性的相关性 1677
产的50%左右[1-2]。花生种子中脂肪含量平均达到50%左右, 特别是不饱和脂肪酸的含量很高, 占油脂的80%以上, 适宜制造各种营养食品[3-5]。
花生在储藏过程中极易发生氧化、酸败、霉变、走油等现象, 食用变质的花生或花生制品会对人体造成伤害, 诱发各种病变[6]。花生种子储藏过程中, 脂肪代谢过程是其品质劣变的重要原因。脂肪酶是脂肪分解代谢中第一个参与反应的酶, 对脂肪的转化速率起着调控的作用, 脂肪酶首先识别并攻击脂肪酸链中的酯基, 并导致脂肪水解反应的发生[7-8]。
然而, 长期以来, 关于油料作物种子脂肪酶的研究主要集中于种子萌发过程和形成期脂肪酶活性的变化[11]。张弛等[12]和翟征秋等[13]分别研究了硒和重金属铬、铜对花生种子萌发前后脂肪酶活力变化的影响, 申琳等[14]则研究了花生种子萌发过程中蛋白酶、脂肪酶及SOD、CAT酶活性变化。但对于油料作物干种子特别是储藏过程中脂肪酶作用的研究尚未见报道。
张瑛等[15]发明一种简易、高效的作物种子脂肪酶定性比色法并应用于水稻干种子检测。刘洁等[16]在其基础上进一步深入研究, 提出了水稻干种子脂肪酶活力精确定量分析技术, 可以快速、准确地检测出水稻种子脂肪酶活力。本文将该方法应用到花生种子脂肪酶活力检测, 并对方法进一步优化, 对花生种子材料的脂肪酶活性进行了大规模筛选和花生储藏过程中脂肪酶作用的初步探索, 为进一步探讨花生种子脂肪酶在其储藏过程中作用提供了方法和材料的准备。
1 材料与方法
1.1 试验材料
对照材料皖花4号由安徽农业科学院作物所提供, 216份花生种质资源材料由山东花生所提供。吡啶、醋酸铜、正辛酸均为分析纯, 购自国药集团化学试剂有限公司; 异辛烷为分析纯, 购自上海凌峰化学试剂有限公司; 橄榄油、吐温-20为化学纯, 购自国药集团化学试剂有限公司; Tris为分析纯, 购自Sigma公司; 水为去离子水; 其他试剂均为分析纯。电子天平(上海天平仪器厂)、A11型分析研磨机(德国IKA)、TGL-16G型离心机(上海安亭科学仪器厂)、HSZ-H型水浴振荡器(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)、STS-3型脱色摇床(上海琪特分析仪器厂)、721W型分光光度计(上海光学仪器厂)、
ZRX-258D智能人工气候箱(杭州钱江设备有限公司)、LRH-400-GS人工气候箱(发芽箱)(广东省医疗器械厂)、研钵、容量瓶、离心管等。
1.2 花生脂肪酶活力检测方法
根据刘洁等比色法[16]略修改、优化。
1.2.1 原理 以橄榄油作为底物, 在给定时间内, 脂肪酶酶活高低与其催化水解底物生成的脂肪酸物质的量成正比, 再利用铜离子与脂肪酸形成铜皂[17], 在715 nm测其吸光度以鉴定脂肪酶反应体系生成的脂肪酸量。
1.2.2 底物微乳液的制备 将橄榄油和Tween-20按1∶1 (W/W)混合, 经磁力搅拌器搅拌均匀, 得底物微乳液。
1.2.3 粗酶浸提液的制备 选取新鲜饱满、表皮光滑、无病斑和损伤的花生果数粒, 剥壳去皮去胚, 将子叶粉碎。称取5 mg (优化过程见结果2.1.1), 用研钵研碎, 加入1 mL Tris-HCl缓冲液研磨成匀浆后转移至25×200试管中, 再用1 mL缓冲液冲洗研钵两次, 并将缓冲液转移至试管中。
1.2.4 脂肪酸显色剂的配制 称取5 g乙酸铜, 溶解于100 mL去离子水中, 再加3 mL吡啶, 混匀即得脂肪酸显色剂。反应生成的游离脂肪酸与醋酸铜溶液形成的铜皂加入吡啶后, 随着溶液pH值的增大, 铜皂的吸光度大大增加, 在pH 6.0~6.2范围内, 铜皂的吸收最强。因此, 必须控制醋酸铜-吡啶的pH在6.1处[15]。
1.2.5 脂肪酶活力的测定 将3 mL微乳液底物加入25×200试管与粗酶浸提液混合, 在HSZ-H型水浴振荡器中37℃, 用封口膜封口, 160转水浴振荡20 h。反应完毕后, 把反应液转移到15 mL具盖试管中并加入7 mL异辛烷, 将试管置STS-3型脱色摇床充分振荡30 min。其后把试管置试管架上静置10 h, 待其分层后, 移取上层有机相6 mL分装于A、B两只5 mL离心管中, 各3 mL。每只离心管中分别加入0.75 mL脂肪酸显色剂, 在STS-3型脱色摇床上充分振荡混匀10 min, 使其显色后, 8 000×g离心10 min。合并A、B两管淡蓝色上清液, 在715 nm处测定吸光度。上清液吸光值的高低对应于脂肪酶活性的高低。对照管试验方法同上, 用pH 7.5的Tris-HCl缓冲液3 mL代替3 mL酶液。比色时, 脂肪酶活性管和对照管均用纯水调零。
1.2.6 脂肪酸吸光度标准曲线的绘制 配制一系列不同浓度的正辛酸/异辛烷溶液6 mL等量分装于
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2只5 mL离心管中, 各加0.75 mL脂肪酸显色剂, 于STS-3型脱色摇床充分振荡混匀10 min。离心后取两管上层有机相合并后在715 nm以异辛烷作参比测定吸光度, 试验重复3次, 以平均吸光度作为结果。用Microsoft Excel进行数据处理, 绘制脂肪酸标准曲线如图1所示。
图1 脂肪酸吸光度标准曲线
Fig. 1 Standard curve of absorbancy of fatty acid
该标准曲线相关系数较好, 数据偏差很小, 回归方程y = 0.6716x+0.0789 (R2=0.9987)可以代表吸光度和游离脂肪酸浓度之间的关系。
1.2.7 脂肪酶活力的定义与计算 假设用上述方法测得某样品管OD值为Y, 对照管OD值为Y0查标准曲线可得该反应体系中游离脂肪酸浓度的变化, 以上述反应条件下样品中含的脂肪酶在24 h内消化底物所生成0.001 mg脂肪酸作为一个酶活力单位U, 则该样品的脂肪酶活力为A = [(Y–Y0–0.0789)/ 0.6716]/0.001, 单位为U。
由于底物橄榄油亦可以在水浴过程中分解生成游离脂肪酸, 所以应设对照管排除橄榄油的本底干扰作用。用脂肪酶活性管Y与对照管Y0的差值代表产生的脂肪酸引起的吸光度变化, 即脂肪酶的相对活性。将(Y–Y0)代入上述回归方程可得该样品管中游离脂肪酸浓度的变化量, 再根据本文中对脂肪酶酶活的定义可以得到样品脂肪酶的总活力。
1.3 取样量对脂肪酶活力检测的影响
分别取皖花4号花生粉1、3、5、10、15、20和30 mg, 底物浓度为30 mg mL–1
, 其他试验步骤同上。另设一组对照管, 每个浓度梯度各设3个平行酶活性管, 取测定平均值, 以酶活性管与对照管的OD值代入公式计算该样品脂肪酶的活力。
1.4 取样量与提取液蛋白质浓度的相关性
取皖花4号花生粉0.5、1、5、10、15、20和25 mg, 加Tris-HCl缓冲液3 mL研磨成匀浆, 离心后取1.5 mL上清液, 加Tris-HCl缓冲液1.5 mL稀释,
在波长260 nm和280 nm处分别测吸光度。
蛋白质浓度(mg mL–1)=(1.45×A280–0.748×A260) ×2 式中A280和A260分别是蛋白质溶液在280 nm和260 nm波长下测得的吸光度, 2为溶液的稀释倍数。试验重复3次, 取平均值。用Microsoft Excel处理数据。
1.5 酶液浓度对脂肪酶活力检测的影响
称取120 mg皖花4号花生粉加Tris-HCl缓冲液10 mL研磨成匀浆后离心得到粗酶液, 再分别用缓冲液稀释24、12、8、4和2倍, 即设置粗酶液浓度分别为0.5、1、1.5、3、6和12 mg mL–1浓度梯度, 底物浓度为30 mg mL–1, 其他试验步骤同上。另设置一组对照管, 每个浓度梯度各设3个平行酶活性管, 取测定平均值, 以酶活性管与对照管的OD值代入公式计算该样品脂肪酶的活力。
1.6 底物浓度对脂肪酶活力检测的影响
分别配置底物(橄榄油的微乳液)浓度为1、5、10、20、30和40 mg mL–1的微乳液, 称取皖花4号花生粉5 mg, 其他试验步骤同上。每个浓度梯度各设3个平行酶活性管, 取测定平均值, 另设一个对照管, 以酶活性管与对照管的OD值代入公式计算该样品脂肪酶的活力。
1.7 脂肪酶活性差异材料筛选
以216个花生种质资源为材料, 按田间编号分为21组, 每组加入皖花4号作为对照, 利用优化后的方法进行脂肪酶活性检测, 每个样品测定设置2个重复, 取平均值, 另设置一对照管, 以酶活性管与对照管的OD值代入公式计算该样品脂肪酶的活力。 1.8 人工加速老化试验
选取扩繁后的2份高脂肪酶活性和2份低脂肪酶活性材料各100 g, 装入尼龙纱网袋中, 设3个重复, 于42.5℃、湿度87.5%的恒温恒湿箱进行人工加速老化。在5、10、15、20和25 d, 每次20 g, 定期取样进行发芽试验。
1.9 花生种子发芽试验
采用GB/T3543.4-1995中规定的的纸间法(BP) [18], 选用滤纸作为芽床, 在培养皿中铺2层滤纸后将种子置其上, 再在种子上覆盖1层滤纸。将芽床用纯水充分润湿, 放于恒温培养箱中, 恒定温度27℃, 保持芽床湿润, 干时加水。每处理20粒种子, 3次重复。每天观察记载发芽种子数, 当胚根长≥种长时视为发芽种子, 结果取3次重复的平均值。试验期间如有发霉种子将其取出, 发霉严重时更换芽床,
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置床6 d后统计发芽率。
发芽率=正常发芽种子数/种子总数×100%。
2 结果与分析
2.1 脂肪酶活力检测试验条件的探索
2.1.1 取样量对脂肪酶活力的影响 由图2可知, 花生取样量少于5 mg时, 酶活力与花生取样量呈正比。当取样量达到5 mg后酶活力逐渐趋于平稳, 上升幅度变缓。表明5 mg花生中的酶量在20 h内可以将绝大部分底物彻底分解。因此, 最适取样量为5 mg。 2.1.2 取样量与提取液蛋白质浓度的相关性 由图3可见, 在取样量增加到25 mg时, 提取液的蛋白浓度与取样量仍为正比关系(R2 = 0.9979), 说明试验中使用的取样量未超出缓冲液的提取能力范围, 试验结果明显。
图2 取样量对脂肪酶活力的影响
Fig. 2 Effect of sampling amount on lipase activity
图3 取样量对提取液的蛋白浓度的影响
Fig. 3 Effect of sampling amount on extract protein
concentration
2.1.3 酶液浓度对脂肪酶活力的影响 由图4可知, 酶浓度低于1.5 mg mL–1时, 酶活力与酶浓度呈正比。当酶浓度达到1.5 mg mL–1后酶活力逐渐趋于平稳, 上升幅度变缓。表明当酶浓度达到1.5 mg mL–1以后, 在20 h内可以将绝大部分底物彻底分
解。因此, 酶液浓度应小于1.5 mg mL–1使酶活力与酶浓度始终保持正比关系, 1.5 mg mL–1的酶液3 mL所用样品粉约4.5 mg左右, 与上述结果基本一致。 2.1.4 底物浓度对脂肪酶活力的影响 从图5可以看出, 底物浓度增加, 脂肪酶活力也增加, 在底物浓度低范围内, 脂肪酶活力与底物浓度呈正比, 当橄榄油浓度增加到30 mg mL–1时, 酶活基本稳定不再增加, 最适底物浓度为30 mg mL–1。
图4 酶液浓度对脂肪酶活力的影响
Fig. 4 Effect of enzyme concentration on lipase activity
图5 底物浓度对脂肪酶活力的影响
Fig. 5 Effect of substract concentration on lipase activity
2.1.5 方法的精密度试验 应用优化得到的最适条件对皖花4号脂肪酶活性检测平行试验7次, 测得酶活力分别为157.354、162.55、148.364、153.984、163.253、161.12和151.669。对结果进行统计计算后得到相对标准偏差(RSD)为3.4%, 小于5%, 证明该方法稳定性好、重复性好, 可以作为花生脂肪酶活力检测的基本方法。
2.2 花生种子脂肪酶活性差异材料的筛选
利用上述优化的脂肪酶检测方法获得216个花生资源材料脂肪酶活性直方图(图6), 脂肪酶活性呈曲线分布, 变幅为35~525, 最大峰值落在150附近, 主要分布区域在75~375。
由表1可得, 样品平行组内重复的无差别的概率P=0.1968>0.05, 说明平行组间差异不显著, 结果较为稳定, 重复性较好, 样品间的无差别的概率P=0.0000
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脂肪酶活性有很大差异。综合考虑试验组别、平行间稳定性等因素后, 筛选得到特异性脂肪酶活性材料见表2。
差异打下良好的基础。
图6 不同花生种子材料脂肪酶活力分布
Fig. 6 Distribution of lipase activity in different peanut seeds
表2中左侧5个材料花生种子酶活较高, 右侧5个材料花生种子酶活较低, 2组平均酶活力相差超过3倍, 为比较不同脂肪酶活性材料在储藏中的变化
2.3 人工加速老化试验
选取脂肪酶活性高的花生种子99号和175号, 脂肪酶活性低的花生种子106号和221号扩大种植, 收获后按国标纸间法进行发芽试验, 发芽率结果如图7。
从图7可以发现, 脂肪酶活性高的花生种子99号和175号在人工加速老化过程中的发芽率下降趋势更大, 明显高于脂肪酶活性低的花生种子106号和221号的下降趋势。在人工加速老化15 d后, 高脂肪酶活性材料发芽率下降至20%左右, 而低脂肪酶活力的材料106号发芽率仍保持在45%, 221号材料仍保持了93.33%的高发芽率。在人工老化25 d后, 高脂肪酶活性材料发芽率下降至5%左右, 而低脂肪酶活力的材料发芽率仍保持在30%左右, 为高脂肪酶活性材料发芽率的5倍。SPSS软件相关性分析表明, 花生脂肪酶活力与人工加速老化25 d种子发芽率的平均值呈负相关(相关系数为0.8875)。
表1 不同花生种子脂肪酶活力差异的显著性分析
Table 1 Significance analysis of lipase activity in different peanut seeds
变异来源 Variation source 重复 Repeat
材料数 Material number 试验误差 Test error 总和 Total
自由度
df 1
平方和 Squares 4358.57
均方 Mean square 4358.568
F值 F-value 1.677
P值 P-value 0.1968
215 2928386.46 13620.402 5.240 0.0000** 215 558904.81 2599.557 431 3491649.84 8101.276
表2 花生特异性脂肪酶活性差异材料的酶活性
Table 2 Lipase activity of peanut seeds with different specific lipase activities
高酶活材料 Material with high lipase activity
平行1 Repeat 1
平行2 Repeat 2
平均酶活 Mean lipase activity
低酶活材料 Material with low lipase activity
平行1 Repeat 1
平行2 Repeat 2
平均酶活 Mean lipase activity
45 334.0042 355.6903 344.8472 106 77.5942 66.8350 72.2146 28 357.8796 376.5812 367.2304 221 74.9217 86.6311 80.7764 148 404.4722 350.3984 377.4353 192 89.3944 102.7087 96.0515 175 423.1893 496.0624 459.6258
8 92.1158 104.1705 98.1432
99 480.2435 457.8451 469.0443 38 109.9853 116.9523 113.4688
3 讨论
脂肪酶催化脂肪水解生成大量的游离脂肪酸。一方面, 游离脂肪酸增多使油脂酸败、酸价增高、油脂风味变差, 加工过程中的得率减少, 损失加大, 生产成本增高。游离脂肪酸发生断裂后, 不饱和键形成氧化物, 分解为低级脂肪酸和醛类、酮类等物质[9-10]。另一方面, 游离脂肪酸增多会导致酸中毒, 造成种子芽率降低。因此, 研究脂肪酶对解决油料 作物种子储藏变质问题十分重要。
花生因其含油分高, 在高温、高湿、机械损伤、氧气、日光及生物的综合作用下, 极易发生酸败变质, 降低种子的发芽率, 不仅影响其食用品质, 往往也影响其商品价值。目前延长花生储藏时间的方法多是控制其含水量或仓库温湿度等外界环境条件, 对种子自身变化则鲜有探讨[19]。如前言所述, 对花生脂肪酶的研究多集中于种子萌发过程和形成期脂肪酶活性的变化, 干种子脂肪酶活力较低, 用已有
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图7 42.5℃、相对湿度87.5%的高温、高湿人工加速老化试验
Fig. 7 Accelerated aging test under 42.5℃ of high-temperature and RH87.5% of high humidity
的方法难以检测
[20]
。
本文优化了花生干种子脂肪酶检测的方法, 其中, 取样量的精确化是本研究的关键, 试验获得5 mg的最适取样量(图2), 并确定了最适底物浓度量30 mg mL–1 (图5), 筛选出脂肪酶活力高、低各5个的两组材料(表2), 其中低脂肪酶活力的221号材料表现特别突出, 在人工加速老化20 d后, 仍然保持了80%以上的高发芽率。
方法上, 首次将比色法应用于花生种子脂肪酶活力的检测, 克服了传统的碱滴定法灵敏度低的缺点, 对原有方法加以优化和改进, 使其适应于大规模材料的筛选。精密度试验表明, 本方法分辨率高、稳定性强, 经济适用, 方便推广。通过大规模的种质筛选得到差异显著的特异性材料, 并利用人工加速老化试验初步证实了脂肪酶活力差异影响花生种子的耐储藏性, 为延长花生储藏期的研究开辟了一条新的思路。
4 结论
比色法可以有效地测定花生脂肪酶活力, 测定的最适试验条件是取样量5 mg、底物浓度30 mg mL–1
; 216个花生材料间脂肪酶活力差异显著, 筛选出了特异性脂肪酶活力材料; 在人工加速老化条件下, 脂肪酶活力高的花生种子的发芽率下降趋势明显高于脂肪酶活力低的花生种子, 由此初步表明脂肪酶活力低的种子具有较好的耐储藏特性。
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欢迎订阅2012年《中国农业科学》中、英文版
《中国农业科学》中、英文版由农业部主管、中国农业科学院主办。主要刊登农牧业基础科学和应用基础科学研究论文、综述、简报等。设有作物遗传育种; 耕作栽培·生理生化; 植物保护; 土壤肥料·节水灌溉·农业生态环境; 园艺; 园林; 贮藏·保鲜·加工; 畜牧·兽医等栏目。读者对象是国内外农业科研院( 所)、农业大专院校的科研、教学人员。
《中国农业科学》中文版总被引频次、影响因子连续多年居全国农业科技期刊最前列或前列位次。1999年起连续10年获“国家自然科学基金重点学术期刊专项基金”资助; 2001年入选中国期刊方阵双高期刊; 1999年获“首届国家期刊奖”, 2003、2005年获“第二、三届国家期刊奖提名奖”; 2004—2006年连续荣获第四、五届全国农业优秀期刊特等奖; 2002年起7次被中信所授予“百种中国杰出学术期刊”称号; 2008年获中国科技信息研究所“精品科技期刊”称号, 及武汉大学中国科学评价中心“权威期刊”称号; 2010年荣获“第二届中国出版政府奖期刊提名奖”。在北京大学《中文核心期刊要目总览(2008年版)》中位居“农业综合类核心期刊表”首位。2010年1月起中文版改为半月刊, 将有更多最新农业科研成果通过《中国农业科学》及时报道。
《中国农业科学》英文版( Agricultural Sciences in China)2002年创刊, 2006年1月起正式与国际著名出版集团Elsevier合作, 海外发行由Elsevier全面代理, 全文数据在ScienceDirect平台面向世界发行。2010年1月起英文版页码增至160页。2010年Agricultural Sciences in China被SCIE收录, 拟于2012年1月更名为Journal of Integrative Agriculture。
《中国农业科学》中文版大16开, 每月1、16日出版, 国内外公开发行。每期224页, 定价49.50元, 全年定价1188.00元, 国内统一刊号: CN11-1328/S, 国际标准刊号: ISSN0578-1752, 邮发代号: 2-138, 国外代号: BM43。
《中国农业科学》英文版大16开, 每月20日出版, 国内外公开发行。每期160页, 国内订价36.00元, 全年432.00元, 国内统一刊号: CN 11-4720/S, 国际标准刊号: ISSN 1671-2927, 邮发代号: 2-851, 国外代号: 1591M。
邮编: 100081; 地址: 北京 中关村南大街12号《中国农业科学》编辑部 电话: 010-82109808, 82106280, 82106281, 82106282, 传真: 010-82106247 网址: http://www.ChinaAgriSci.com E-mail: [email protected]