黄酮标准曲线绘制的实验报告

黄酮标准曲线绘制的实验报告

1.总黄酮的测定

1.1 实验仪器 电子天平AR2140;

紫外可见分光光度计UV2754; 型数控超声波清洗器KQ3200DB; 超级恒温槽;

Rotavapor R200 旋转蒸发仪 ; FD21C250 冷冻干燥机2 1.2 试剂及药品 芦丁 标准品

硝酸铝 国产分析纯（配成5 %） 亚硝酸钠 国产分析纯（配成10 %） 氢氧化钠 国产分析纯配成（配成1mol/L）

95%乙醇，无水乙醇 国产分析纯（配成60%乙醇 50%乙醇）

DPPH·（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，二苯代苦味肼基自由基） Vc（Ascrobic acid，维生素 C，抗坏血酸） 没食子酸对照品：基准纯。

大青叶子 采摘于海南大学东坡湖畔 1.3实验步骤：

1.3.1准备工作及波长的确定

样品60℃烘干粉碎机粉碎，过20目筛，装入试剂瓶中备用。根据查阅文献总黄酮在波长为510nm处吸收值最大。 1.3.2参照品芦丁标准溶液的制备

精密称取120 ℃干燥至恒重的芦丁标准样品37.5mg置于100mL烧杯中,用60%乙醇溶解后定容至25mL 容量瓶中,摇匀，即可得1.5mg/mL的芦丁标准溶液。 1.3.3标准品的测量及绘制标准曲线

精密吸取芦丁标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL ,分别置于10mL 容量瓶中，并定容至刻度线。得到0.0mg/ml、0.15mg/ml、0.3mg/ml、

0.45mg/ml、0.6mg/ml、0.75mg/ml、0.9mg/ml的标准品溶液，分别取1ml到试管中各加5 %亚硝酸钠溶液0.3mL 摇匀,放置6min ,加10%硝酸铝溶液0.3mL 摇匀,放置6min ,加1mol /L氢氧化钠溶液4mL ,再用60%乙醇溶液稀释至刻度,放置15min 后,分别在510nm 处测定其吸光度（Tai,Cai&Dai,2011）。（以试剂空白做参比）

以吸光度A 为纵坐标,浓度c为横坐标,绘制标准曲线。用最小二乘法进行线性拟合,得c与A 的线性回归方程以及相关系数R2。

序号

1

2 3 4 5 6 7

浓度（ug/ml）

0 15 30 45 60 75 90

吸光度 0 0.180 0.349 0.546 0.727 0.884 1.063

表1-1： 芦丁标准曲线测定数据

图1-2：芦丁标准曲线

1.3.5样品的测试

根据查阅文献总黄酮在波长为510nm处吸收值最大。取黄酮提取液， 取提液2ml至10ml的比色管中用60%的乙醇定容至刻度线则稀释5倍。取稀释好的溶液4份1ml置入10ml的比色管中，其中一份用60%的乙醇定容，作为参比溶液。其余各份各加5%亚硝酸钠溶液0.3mL 摇匀,放置6min ,加10%硝酸铝溶液0.3mL 摇匀,放置6min ,加1mol 氢氧化钠溶液4mL ,再用60%乙醇溶液稀释至刻度,放置15min后,分别在510nm处测定其吸光度。代入标准曲线回归方程可得浓

度数据（以芦丁为参比）,三次结果取平均值。经换算后得样品中总黄酮含量。

样品总黄酮含量(mg/g)=X*n*V1/( V *W)

式中：X—测出的浓度，mg/ mL;（直接代入，不用换算。）

n—稀释倍数，量纲为1; VI—样液总体积，mL; V—测定时取样体积，mL; W—样品质量，g。

2.总分含量的测定

2.1 实验仪器

ALZO4型电子分析天平:上海梅特勒一托利多仪器有限公司; DELA犯O型pH计:上海梅特勒一托利多仪器有限公司; 723可见分光光度计:上海菩华科技仪器有限公司; DK一512型电热恒温水浴锅:上海森信实验仪器有限公司; 容量瓶(250mL，10OmL，25mL)、比色管管(10mL); 烧杯、移液管、吸耳球。 2.2试剂及药品

没食子酸对照品：基准纯，购于上海分析试剂厂，置50℃真空干燥箱真 空中干燥4 h。乙醇为工业级，蒸馏水，其他试剂均为分析纯。 2.3 Folin—Ciocalteu比色法测定总酚酸含量 3.3.1 Folin—Ciocalteu试剂的配制

称取20 g钨酸钠和5 g钼酸钠于圆底烧瓶中，用140 ml蒸馏水溶解，加入10ml 85％的磷酸溶液和20 ml浓盐酸，文火回流10 h，然后加入3 g硫酸锂及15 ml双 氧水，加热沸腾15 min至亮黄色，不得带微蓝和绿色。冷却，移入250 ml容量瓶中，定容，贮于棕色瓶中，4℃冰箱保存。 2.3.2对照品溶液制备

准确称取15．00 mg干燥的没食子酸，加蒸馏水适量，超声溶解，放冷，以蒸馏水定容至50ml，制成0.3mg/mL没食子酸的溶液，作为对照品溶液。

将0.3mg/mL的没食子酸标准溶液分别配制成0.0mg/mL，0.03mg/mL，0.06mg/mL，0.09mg/mL，0.12mg/mL，0.15mg/mL、0.18mg/mL、0.21mg/mL的溶液，分别取1mL置于10mL的容量瓶中，加入2 ml福林试剂，充分摇匀，加入0．75ml 7.5％

碳酸钠溶液．混匀，以蒸馏水稀释至刻度。振荡一下，静置2h(Guo&Wei,2011)。同时制作空白管。为消除供试品溶液本身颜色的干扰，同时制作不加显色剂的对照管。于765 nm波长处测定吸光度值。 2.3.3标准曲线的制备

以吸光度A 为纵坐标,浓度c为横坐标,绘制标准曲线。用最小二乘法进行线性拟合,得c与A 的线性回归方程以及相关系数R2。

序号

0 1

2

3

4

5

6

7

浓度

（ug/ml） 0 3 6 9 12 15 18 21

吸光度（WL765.0） 0

0.132 0.284 0.411 0.582 0.712 0.843 1.013

表3-1：没食子酸标准曲线测定数据

图3-1：没食子酸标准曲线

2.3.4样品的测定

取提液2ml至10ml的比色管中用60%的乙醇定容至刻度线则稀释5倍。取稀释后溶液1ml四份,分别置于10mL比色管中，加入2 ml福林试剂，充分摇匀，加入0．75ml 7.5％碳酸钠溶液．混匀，以蒸馏水稀释至刻度。振荡一下，静置2h。同时制作空白管。为消除供试品溶液本身颜色的干扰，同时制作不加显色剂的对照管。于765 nm波长处测定吸光度值。 总酚酸含量计算：

多酚含量（mg/100g）=

X(mg)稀释倍数

100

0.5总酚酸称样量（g）

3.清除 DPPH·的能力的测定 3.1.实验仪器、药品及试剂

2.1.1 实验仪器

ALZO4型电子分析天平:上海梅特勒一托利多仪器有限公司; DELA犯O型pH计:上海梅特勒一托利多仪器有限公司; 723可见分光光度计:上海菩华科技仪器有限公司; DK一512型电热恒温水浴锅:上海森信实验仪器有限公司; 容量瓶(250mL，10OmL，25mL)、比色管(10mL); 烧杯、移液管、吸耳球。 3.1.2试剂及药品

DPPH·（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，二苯代苦味肼基自由基）； Vc（Ascrobic acid，维生素 C，抗坏血酸）为分析纯； 无水乙醇，蒸馏水

3.2.1配制DPPH溶液

配制0.06mMDPPH试剂，放入冰箱4℃进行冷藏，以备用。

3.2.2参照品Vc标准溶液的制备

准确称取17.6mgVc到100mL的烧杯中用无水乙醇溶解后，置于50mL的容量

瓶中定容至刻度线及可以得到2mmol/L的母液，分别量1、2、3、4、5、6ml至10ml的比色管中用无水乙醇定容至刻度线，则可以得到0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1mmol/L、1.2mmol/L的溶液。从以上比色管中分别取0.1ml溶液置于试管中再加入3.9ml的DPPH，反应30min,在517nm测出吸光值(Thoo&Ho,2010)，用无水乙醇代替待测液作为对照，用无水乙醇作空白，重复三组。

清除率=[(Ac-Ai)/Ac]×100%

式中，Ac：0.1 mL 无水乙醇加 3.9mL DPPH 溶液的吸光度；

Ai：0.1 mL 待测液加 3.9mLDPPH 溶液的吸光度。

3.2.3标准曲线的绘制 3.2.2测试数据及标准曲线的绘制

序号 0 1 2 3 4 5 6

C（mmol/L）

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

吸光度 0.529 0.424 0.32 0.209 0.11 0.02

清除率/% 0 14.92 30.90 46.73 63.62 78.69 92.39

表3-1：VC标准曲线测定数据

以吸光度A 为纵坐标,浓度c为横坐标,绘制标准曲线。用最小二乘法进行线性拟合,得c与A 的线性回归方程以及相关系数R2。

图3-1：VC含量与吸光度的关系

图3-1：VC含量与清除率的关系

3.2.4样品的测定

取提液4ml至10ml的比色管中用60%的乙醇定容至刻度线则稀释2.5倍。取稀释后溶液0.1mL三份,分别置于10mL 试管中，再分别加入配置好的DPPH溶液3.9mL,摇匀，反应30min后，分别在517nm处测定其吸光度。代入标准曲线回归方程可得浓度数据（以Vc为参比）,三次结果取平均值。经换算后得样品自由基清除率。

4. 清除ABTS+自由基能力的测定

4.1ABTS+自由基的配制

准确称取0.19215gABTS于50mL的容量瓶中，用无水乙醇定容，摇匀，浓度7mmol/L；7mmol/LABTS+.与2.45mmol/L的高硫酸钾等体积混合，在室温、避光黑暗的条件下静置过夜反应12~16h，形成 ABTS+ 自由基储备液。该储备液在室温，避光的条件下稳定。用前用无水乙醇稀释成工作液，于波长734nm处测得其吸光度为0.7000（±0.02），再装入棕色试剂瓶中，放入冰箱4℃进行冷藏，以备用。

4.2标准曲线的绘制

4.2.1参照品Vc标准溶液的制备及测试

准确称取8.8.mgVc到100mL的烧杯中用无水乙醇溶解后，置于50mL的容量瓶中用无水乙醇定容至刻度线及可以得到1mmol/L的母液，分别量1、2、3、4、5、6、7、8ml至10ml的比色管中用无水乙醇定容至刻度线，则可以得到0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L的溶液。从以上比色管中分别取0.1ml溶液置于试管中再加入3.9ml的DPPH，反应30min,在517nm测出吸光值，用无水乙醇代替待测液作为对照(Zhu&Lian,2011)，用无水乙醇作空白，重复三组。

清除率=[(Ac-Ai)/Ac]×100%

式中，Ac：0.1 mL 无水乙醇加 3.9mL ABTS+ 自由基溶液的吸光度；

Ai：0.1 mL 待测液加 3.9mLABTS+ 自由基溶液的吸光度。

4.2.2测试数据及标准曲线的绘制

序号 C（mmol/l） 吸光度 清除率/%

1 0 0.00

2 0.1 0.57 12.04

3 0.2 0.493 23.92

4 0.3 0.422 34.88

5 0.4 0.351 45.83

6 0.5 0.276 57.41

7 0.6 0.2 69.14

8 0.7 0.118 81.79

9 0.8 0.035 94.60

表4-1：Vc浓度与吸光值和清除率的数据

图4-1Vc浓度与其吸光值的关系

图4-2：Vc浓度与其清除ABTS能力的关系

5.还原能力的测定

5.1实验试剂

磷酸盐缓冲溶液（配成PH6.6 0.2mol/l）; K3Fe(CN)6溶液（配成1%）; 三氯乙酸（配成10%）； FeCl3（配成0.1%）； 没食子酸 无水乙醇

5.2标准曲线的绘制 5.2.1试剂的配制

磷酸盐缓冲溶液(pH6.6 0.2mol/L)：准确称取7.16g的磷酸氢二钠至100mL的烧杯中用蒸馏水溶解后，置于100mL的容量瓶中用蒸馏水定容，即可得到0.2mol/L的磷酸氢二钠，同样的方法配制0.2mol/L的磷酸二氢钠。准确量取37.5mL的0.2mol/L磷酸氢二钠溶液和62.5mL的0.2mol/L磷酸二氢钠溶液至烧杯中，用pH校正既可以得到磷酸盐缓冲溶液(pH6.6 0.2mol/L)。 5.2.2标准溶液的配制及测试

用没食子酸做标准曲线其浓度范围在50—300ug/ml，准确称取50mg没食子酸到100mL烧杯中用无水乙醇溶解后，置于容量瓶中用无水乙醇定容至刻度线，得到0.5mg/ml的母液，在分别取1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL至10mL的容量瓶中用无水乙醇定容至刻度先，得到50ug/ml、100ug/ml、150ug/ml、200ug/ml、250ug/ml、300ug/ml的溶液，取不同浓度的待测液或样品1ml于试管中，依次加入PH6.6磷酸盐缓冲溶液（0.2mol/l）2.5ml和1% K3Fe(CN)6溶液2.5ml后混合均匀，混合液于50℃水浴20min,再加入10%的三氯乙酸2.5ml。于（3000r/min）离心10min,取2.5ml的上清液再依次加2.5ml蒸馏水和0.1%的FeCl3 0.5ml混合均匀，静置10min在700nm处测定吸光值，通过在700nm下的吸收值来测量提取物的还原能力，吸光值越高表明还原力越强，EC50的计算是吸光值为0.5时的浓度（Roy&Laskar,2011）。

5.2.3测试数据及标准曲线的绘制

Test set

1 2 3 4 5 6 7

gallic acid concentration

ug/ml

0 50 100 150 200 250 300

Absorbency 0 0.59 1.1 1.527 2.073 2.579 3.1

表5-1：没食子酸的质量浓度和吸光值的数据

图5-1：没食子酸的质量浓度与其吸光值的关系

6.超氧自由自测定

6.1实验试剂

1实验试剂

Tris-Hcl缓冲液（配制PH8.20 50mmol/L） 邻苯三酚(配制3mmol/L) VC 无水乙醇

6.2标准曲线的绘制 6.2..1试剂的配制

Tris-HCl（pH8.2 50mmol/L）缓冲溶液：取0.6057g三羟甲基氨基甲烷（Tris），蒸馏水溶解定容至50mL容量瓶；取0.309mL分析纯盐酸溶液至100mL的容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，即得0.1mol/L盐酸溶液；分别取配置好的Tris50mL和0.1mol/L盐酸溶液22.9mL于100mL容量瓶中，蒸馏水定容至刻度，用pH计进行校正即可以得到Tris-HCl（pH8.2 50mmol/L）缓冲溶液。邻苯三酚：配制10mmol/L的稀盐酸，取0.310mL分析纯盐酸溶液至1000mL的容量瓶中用蒸馏水定容至刻度线；取焦性没食子酸0.0095g，至25mL的容量瓶中用10mmol/L的稀盐酸溶液定容至刻度线。 6.2.2标准溶液的配置及测试

精密称取Vc标准样品0.0300g置于100mL烧杯中,用纯净水溶解后定容至100mL 容量瓶中,即可得0.3mg/mL的Vc标准溶液。

将0.3mg/mL的Vc标准溶液分别配制成0.0mg/mL，0.03mg/mL，0.06mg/mL，0.09mg/mL，0.12mg/mL，0.15mg/mL，0.18 mg/mL,0.21 mg/mL,0.24 mg/mL,0.27 mg/mL,0.3 mg/mL的溶液，分别加入4.5mL的Tris-HCl（pH8.2 50mmol/L）缓冲溶液于10mL的试管中，再加入1mL不同浓度样品或待测液，25℃反应10min，再加入25℃预热的邻苯三酚0.1mL（3mmol/L用10mmol/L的盐酸配制），迅速摇匀，于325nm出测定，加入邻苯三酚即开始计时，每隔30s读取一次，至5min，做好记录。邻苯三酚的自氧化速率以无水乙醇代替样品，Tris-HCl缓冲溶液作空白。

清除率%=[(△Ac-△Ai)/△Ac]×100%

式中，△Ac：邻苯三酚自氧化速率；

△Ai：加入待测液后邻苯三酚自氧化速率。 6.2.3测试数据及标准曲线的绘制

序号 1 2 3 4 5 6

吸光值 1st 0.142 0 0.032 0.015 0.012 0.007 0.006

5th 0.411 0 0.246 0.179 0.13 0.074 0.025

自氧化速率

0.06725 0 0.05350 0.04100 0.02950 0.01675 0.00475

抑制率 0 20.45 39.03 56.13 75.09 92.94

时间min 邻苯三酚0.1ml 浓度ug/ml 0

30 60 90 120 150

表6-1：Vc的质量浓度与吸光值和抑制率的的数据

图6-1：Vc的质量浓度与其清除超氧自由基关系