热水浸提法提取铁皮石斛原球茎多糖的工艺
第50卷第18期
年期20第11189月
湖北农业科学Vol．50No.18Sep．，2011
HubeiAgriculturalSciences
热水浸提法提取铁皮石斛原球茎多糖的工艺
岑忠用，苏
江，梁冠兴
546300）
（河池学院化学与生命科学系，广西宜州
摘要：利用正交试验对铁皮石斛原球茎多糖提取的工艺条件进行优化，考察料水质量比、浸提温度、浸提时间和浸提次数4个因素对铁皮石斛原球茎多糖得率的影响。结果表明，铁皮石斛原球茎多糖的最佳提取工艺为浸提次数4次，浸提时间3h，料水质量比1∶60，浸提温度80℃，多糖得率为9．17％。在4个提取因素中，对铁皮石斛原球茎多糖提取影响最大的因素是浸提次数，其次是浸提时间，料水质量比和浸提温度影响都比较小，其中浸提次数不同水平间呈极显著差异，浸提时间、料水质量比和浸提温度对铁皮石斛原球茎多糖提取率影响不显著。关键词：铁皮石斛；原球茎；多糖；提取工艺中图分类号：R284．2
文献标识码：A
文章编号：0439－8114（2011）18－3807-04
HotWaterExtractionTechnologyforPolysaccharidesfromProtocormsof
Dendrobiumcandidum
CENZhong－yong，SUJiang，LIANGGuan－xing
（DepartmentofChemistryandLifeScience，HechiUniversity，Yizhou546300，Guangxi，China）
Abstract：TheeffectsoftheratioofDendrobiumcandidumtowater，extractiontime，extractiontemperatureandextractiontimesontheextrationwereinvestigatedtogettheoptimalextractionconditionsofpolysaccharidesfromprotocormsofDendro-biumcandidumbyhotwater．Theresultsshowedthattheoptimumextractionconditionwasasfollows：TheratioofDendro-biumcandidumtowater1∶60，extractingfourtimesat80℃for3h．Inthiscondition，theextractionrateofpolysaccharideswas9．17％．Amongthefourfactors，extractiontimeswasthemostinfluentialfactor，thenextwastheextractiontime．TheeffectsoftheratioofDendrobiumcandidumtowaterandtheextractiontemperaturewererelativelyless．Theeffectoftheex-tractiontimesontheextractionratewassignificant，whilethatofotherfactorswerenotsignificant．Keywords：Dendrobiumcandidum；protocorms；polysaccharides；extractiontechnology
铁皮石斛（Dendrobiumcandidum）属于兰科石斛属（Dendrobium），其主要药效成分为多糖，具有较强的抗肿瘤、增强免疫功能活性、清胃热、助消化等功能，铁皮石斛作为传统的中药材，其价值已被世
人所公认和推崇［1－7］。铁皮石斛的种子极小、无胚乳，自然条件下需与某些真菌共生才能萌发，很难用实生苗栽培，而传统的分株、扦插等方式的繁殖率极低，加上人为的过度采挖和破坏生境，野生铁皮石
收稿日期：2010－12－24
基金项目：广西教育厅科研项目（200809MS091）；广西高校重点建设实验室桂西北特色资源研究与开发实验室资助项目（桂教科研［2006］4号）作者简介：岑忠用（1977－），男（壮族），广西田东人，讲师，硕士，主要从事植物生理生化研究，（电话）[1**********]（电子信箱）zhongyong20＠163．com。
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佳，菌丝干重达10．88g／L，胞外多糖达2．88g／L。
参考文献：
［1］陈志杰，顾振新．灵芝主要活性物质及液体深层发酵技术研究进
展［J］．食品研究与开发，2008，29（3），186－190．［2］杨占涛，刘
超，李
月，等．灵芝多糖的研究现状［J］．安徽农业
科学，2008，36（20）：8651－8652，8739．
［3］鉏晓艳，张日俊．灵芝真菌的液体深层发酵技术［J］．饲料工业，
2005，26（8）：21－23．［4］卫
军，黄
鹤，刘风珠，等．灵芝液体发酵条件研究及保健饮
料的研制［J］．食用菌，2007（1）：61－63．
［5］宋超先．微生物与发酵基础教程［M］．天津：天津大学出版社，
2007．322－323．
［6］曹军卫，马辉文，张甲耀，等．微生物工程［M］．北京：科学出版社，
2007．
（责任编辑温亮）
3808湖北农业科学2011年
斛濒临灭绝［8，9］。为保护珍贵野生资源和满足市场需求，采用组织培养与快速繁殖技术获得铁皮石斛成为一种科学的解决方案。目前，铁皮石斛试管苗的繁殖一般要经过原球茎（Protocorm）阶段，而类原球茎实质上是正在生长分化的体细胞胚胎，具有植株同样的物质代谢和形态发育的潜能。目前，利用组织培养技术诱导铁皮石斛原球茎已获得成功，使用原球茎代替全植株作为药源成为可能。
由于多糖是铁皮石斛的主要药用成分，因此，多糖的提取是人们利用铁皮石斛的重要环节之一。为了进一步探索铁皮石斛多糖提取的方法，充分发挥铁皮石斛的作用，研究了热水浸提法在铁皮石斛原球茎多糖提取中应用的可行性，考察影响提取的主要因素，寻求最佳的提取工艺条件，为研究铁皮石斛原球茎多糖及其药理作用提供理论依据。
原球茎干品粗粉15g，用滤纸和脱脂纱布包好，先经石油醚（60～90℃）在索氏提取器中于85℃的水浴中回流脱脂1．5h，再用80％乙醇在95℃水浴中回流3.0h（提取分离干扰组分），取出滤纸包置于60
℃烘干箱中烘干，然后用细口瓶将滤纸包里面的原
球茎样品冲洗至150mL的圆底烧瓶中，加入100
mL去离子水，于沸水浴中提取2次，3h/次，趁热过滤，收集滤液，用旋转蒸发仪减压浓缩至50mL后，
加入少量活性炭进行脱色，过滤，滤液加4倍量
95％乙醇混合，静置过夜，离心，沉淀用50mL去离子水溶解重复醇沉1次。过滤沉淀用95％乙醇、无
水乙醇、丙酮、乙醚多次洗涤，在烘箱中60℃烘干，即得铁皮石斛粗多糖。
1．2．3换算因子的测定精确称取干燥的铁皮石
斛多糖100mg，放入100mL容量瓶中，定容至刻度，取10mL于100mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀。配制成0．1mg／mL的多糖溶液备用。吸取该多糖溶液0．5mL，加去离子水至2.0mL，按标准曲线的制作方法操作，测定吸光度。按测定标准曲线的方法测其吸光度。按下式计算换算因素：
1
1．1
材料与方法
材料
原料：取培养于1／2MS固体培养基的铁皮石斛
原球茎，先在105℃干燥箱中烘20～30min，再于
60～80℃烘干后，经粉碎、干燥恒重处理后备用。
试剂：苯酚（AR）、浓硫酸（AR）、80％乙醇和95％乙醇（AR）、石油醚（AR）、葡萄糖（AR）。
仪器：UV－1800型分光光度计（日本岛津公
司），索氏提取器（江苏金坛医疗仪器厂），HH－6恒温水浴锅（郑州杜甫仪器厂），AE240S型电子分析天平［梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司］，旋转蒸发器RE－52AA（上海亚荣生化仪器厂）。
F＝C／C1D
其中，C为多糖浓度（μg／mL）；C1为多糖中葡萄糖的浓度（μg／mL）；D为铁皮石斛多糖的稀释倍数，测得F＝1．49。
1．2．4铁皮石斛原球茎多糖的测定多糖含量采
用苯酚－浓硫酸的方法进行测定［10］。准确称取铁皮石斛原球茎干品粗粉1．000g用滤纸和脱脂纱布包好，先经石油醚（60～90℃）在索氏提取器中于85℃的水浴中回流脱脂1．5h，再用80％乙醇在95℃水浴中回流3h（提取分离干扰组分），取出滤纸包置于60℃烘干箱中烘干，然后用细口瓶将滤纸包里面的原球茎样品冲洗至150mL的圆底烧瓶中，按照提取的设定条件于水浴中提取，趁热过滤，收集滤液，用旋转蒸发仪减压浓缩至50mL后，将浓缩液移入100mL容量瓶中，定容，摇匀，即得铁皮石斛原球茎多糖溶液。精密吸取样品液2．5mL于25mL容量瓶中，定容，摇匀，取1．0mL置于试管中，加去离子水补足至2．0mL，加苯酚试剂1．0mL混匀，迅速滴加浓硫酸5．0mL，并迅速混匀，放置5min，于沸水浴中加热15min后，取出，流水冷却，然后按
1．21．2．1
试验方法标准曲线的制作
准确称取100mg葡萄糖，
以去离子水溶解并定容至100mL，此时葡萄糖浓度为1mg／mL。精确量取葡萄糖标准工作液（1mg／
mL）0．1、0．2、0．4、0．6、0．8、1．0mL，分别置于试管中，
各加去离子水使成2mL，则各管中葡萄糖的浓度分别为0．05、0．10、0．20、0．30、0．40、0．50mg／mL。在上述各管中加苯酚试剂（10g蒸馏苯酚溶于150g去离子水）1mL，摇匀，迅速滴加浓硫酸5．0mL，并迅速摇匀，静置5min，沸水浴15min，取出，流动水冷却至室温，另以2mL去离子水同样操作，作空白对照，用UV－1800紫外分光光度计在490nm处测定吸光度。以葡萄糖浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标，制作标准曲线并得其回归方程为A＝7．1507C－
1．2．1中的方法测定吸光度，由回归方程计算出样品
溶液葡萄糖的浓度。按以下公式计算样品中的多糖含量：
多糖含量（％）＝［（Cs×D×F×V）／W］×100%式中，Cs为样品溶液中葡萄糖的浓度（μg／mL），
0．0347（r＝0．9995），根据回归方程可计算出样品溶
液中葡萄糖的浓度。
1．2．2铁皮石斛原球茎多糖的提取与精制参照
李满飞等［10］的方法并作了改良，准确称取铁皮石斛D为样品溶液的稀释倍数，V为样品溶液的体积
第18期岑忠用等：热水浸提法提取铁皮石斛原球茎多糖的工艺3809
（mL），F为换算因子，W为样品的质量（g）。原球茎多糖得率为6．38％；浸提温度为80℃时，铁皮石斛原球茎多糖得率迅速上升，为7．49％；当浸提温度从80℃上升到100℃时，多糖得率仍呈上升趋势，但上升比较缓慢，提高幅度为0．83个百分点。从实际生产成本和能源损耗方面考虑，认为选择浸提温度为90℃较适宜。
8.50多糖得率//%
1．2．5单因素试验
1）料水质量比对铁皮石斛原球茎多糖得率的
影响。在恒定温度为80℃，浸提时间为3h，浸提次数为1次的条件下，分别设料水质量比（指铁皮石斛原球茎干品粗粉与水的质量比）为1∶40、1∶50、1∶60、
1∶70进行提取，并计算铁皮石斛原球茎多糖得率。
2）浸提温度对铁皮石斛原球茎多糖得率的影响。
在恒定料水质量比为1∶50，浸提时间为3h，浸提次数为1次的条件下，分别设浸提温度为70、80、90、
8.007.507.006.506.00
70
80
90浸提温度//℃
100℃进行提取，并计算铁皮石斛原球茎多糖得率。
3）浸提时间对铁皮石斛原球茎多糖得率的影
响。在恒定料水质量比为1∶50，浸提温度为80℃，浸提次数为1次的条件下，分别设浸提时间为1、2、3、
100110
4h进行提取，并计算铁皮石斛原球茎多糖得率。
4）浸提次数对铁皮石斛原球茎多糖得率的影
响。在恒定料水质量比为1∶50，浸提温度为80℃，浸提时间为3h，分别设浸提次数为1、2、3、4次进行提取，并计算铁皮石斛原球茎多糖得率。
图2
浸提温度对铁皮石斛原球茎多糖得率的影响
2．1．3
响
浸提时间对铁皮石斛原球茎多糖得率的影由图3可知，当浸提时间为1h时，铁皮石斛原
球茎多糖得率较低，为4．70％；当浸提时间为2h时，铁皮石斛原球茎多糖得率有较大幅度的提高，为
1．2．6正交试验设计在单因素试验的基础上，用
正交试验对铁皮石斛原球茎多糖浸提温度、浸提时间、浸提次数和料水质量比进行优化，选用正交试验表L9（34）对铁皮石斛原球茎多糖提取工艺进行正交试验设计。
6．39％，提高了1．69个百分点；当浸提时间为3h和4h时，铁皮石斛原球茎多糖得率仍上升，分别为8．48％和8．73％，但3h后上升缓慢。从实际生产效
率与成本的要求考虑，认为选择最适宜浸提时间不宜超过3h。
9.008.508.007.507.006.506.005.505.004.504.00
2
结果与分析
多糖得率//%
2．1单因素试验结果与分析
2．1．1料水质量比对铁皮石斛原球茎多糖得率的
影响
由图1可知，料水质量比从1∶40到1∶50水
平中，铁皮石斛原球茎多糖得率迅速上升，即从
5．81％上升到8．38％，增加幅度为2．57个百分点。但
是在料水质量比从1∶50到1∶70水平，铁皮石斛原球茎多糖得率上升缓慢，增加幅度仅为0．41个百分点。从实际生产成本综合考虑，认为选取料水质量比为1∶60为佳。
10.00多糖得率//%
012345
浸提时间//h
图3
浸提时间对铁皮石斛原球茎多糖得率的影响
2．1．4浸提次数对铁皮石斛原球茎多糖得率的影响
由图4可见，浸提2次和3次铁皮石斛原球茎多糖得率增加明显，得率分别为6．61％和8．30％，比浸提
9.008.007.006.005.004.00
1∶40
1∶50
1∶60
1∶70
1次和2次的分别增加1．40和1．69个百分点。浸提
超过3次以后，铁皮石斛原球茎多糖得率尽管有所增加，但是增加得很少，仅有0．58个百分点。从生产成本的角度考虑，浸提次数不应超过3次。
2．2正交试验结果分析
根据单因素试验分析结果，采用L9（34）正交试
料水质量比
图1料水质量比对铁皮石斛原球茎多糖得率的影响
验来优化提取工艺条件。试验因素及水平见表1，试验结果和分析见表2。由表2可知，4个提取因素对铁皮石斛原球茎多糖得率影响的大小顺序为浸
提
2．1．2
响
浸提温度对铁皮石斛原球茎多糖得率的影由图2可知，在浸提温度为70℃时，铁皮石斛
3810
10.009.008.007.006.005.004.003.002.001.000.00
湖北农业科学2011年
3
结论
热水浸提法中影响铁皮石斛原球茎多糖得率
多糖得率//%
的主要因素有料水质量比、浸提温度、浸提时间和浸提次数。在料水质量比、浸提温度、浸提时间和浸
1
2
3
4
提次数几个主要影响因素的单因素试验基础上，采用正交试验对热水浸提法提取铁皮石斛原球茎多糖工艺条件进行了优化。试验结果表明，最佳提取条件为温度80℃，料水质量比1∶60，浸提时间3h，浸提次数4次。在此条件下所得铁皮石斛原球茎多糖得率为9．17％，试验结果与前人研究结果相近［11］。热水浸提法是传统的多糖提取方法，这种提取方法成本较低，取材方便，提取条件易于控制，且提取率较高，在工业化提取铁皮石斛原球茎多糖上具有广阔的应用前景。
参考文献：
［1］董
群，方积年．多糖在医药领域中的应用［J］．中国药学杂志，
浸提次数//次
图4
表1
浸提次数对铁皮石斛原球茎多糖得率的影响
铁皮石斛原球茎多糖提取工艺正交试验因素与水平
浸提温度（B）浸提时间（C）浸提次数（D）
水平料水质量比（A）
℃8090100
h234
次
123
1∶501∶601∶70
234
表2
试验号
铁皮石斛原球茎多糖提取工艺正交试验结果
A[1**********].5823.9524.300.73
B[1**********].2623.6823.890.58
C[1**********].8024.4923.530.96
D[1**********].8325.3726.636.80
多糖得率//%
2001，36（10）：649－652．［2］FRANZG．Polysaccharidesin
123456789T1T2T3R
6.548.438.609.176.398.398.548.866.90
pharmacy：currentapplications
andfutureconcepts［J］．PlantMedical，1989，55：493－497．［3］杨虹，王顺春，王峥涛，等．铁皮石斛多糖的研究［J］．中国药学杂
志，2004，39（4）：254－256．
［4］张中建，阎小伟．铁皮石斛制剂免疫调节作用的实验研究［J］．食
品研究与开发，2004，25（2）：34－37．
［5］何铁光，杨丽涛，李杨瑞，等．铁皮石斛原球茎多糖DCPP1a－1的
理化性质及抗肿瘤活性［J］．天然产物研究与开发，2007，19（4）：
578－581．
［6］夏春东，廖学才，李守良．石斛药用概述［J］．实用中医药杂志，
1998，14（4）：45－49．［7］郭［8］徐
勇，程晓磊．石斛在恶性肿瘤治疗中的作用［J］．浙江中西医红，李晓波，王峥涛，等．海南、广东省石斛属植物资源与种结合杂志，2007，17（7）：454－458．
质保护研究［J］．中国野生植物资源，1999（5）：24－26．
［9］陈立钻，孙继军．珍稀濒危物种铁皮石解的保育与开发利用［J］．
中国林业，2003，11（22）：34－36．
［10］李满飞，徐国钧，平田羲正，等．中药石斛类多糖的含量测定［J］．
中草药，1990，21（10）：10－12．
［11］何铁光，杨丽涛，李扬瑞，等．铁皮石斛原球茎多糖提取最佳工
艺研究［J］．西北农业学报，2006，15（5）：240－243．
次数＞浸提时间＞料水质量比＞浸提温度；方差分析结果表明，浸提次数各水平间差异呈极显著水平，浸提温度、浸提时间和料水质量比对铁皮石斛原球茎多糖得率影响不显著。因此，选取各因素的最佳组合为A2B1C2D3，即在温度为80℃下，以1∶60的料水质量比，浸提3h，浸提次数4次为最佳提取工艺组合，此时多糖得率为9．17％。
（责任编辑郑威）