细菌总数培养基的制作

正文：

1. 引言：西安未央湖游乐园是以集休闲、娱乐为一体的现代大型游乐园，占地近千亩，其中水域面积480亩，是西北最大的人工湖。　西安未央湖游乐园开业七年来，已接待600余万人次，成为三秦人民休闲度假的首选之地，随着未央湖游乐园的不断发展和环境美化，将吸引更多的游客来此观赏。既然湖水是未央湖的一大风景，那我们就很有必要去了解一下湖水水质。

由于实验条件的有限，对大肠杆菌群数的测定虽已有很多快速，高效的测定方法本实验采用多管发酵技术．多管发酵技术：MTF技术被用作水质检测至今已有80年历史,其核心是将水样进行系列10倍稀释,分别接种到有培养液的试管中，在35℃培养48h，观察产气、产酸和细菌生长情况。阳性样本还需进行确认试验方能确定。其优点是不需昂贵设备，经过基本微生物学培训的技术员即可操作，特别适用于膜过滤技术不便进行的有色和混浊水体的检测。缺点是耗时费力，每种水样都需要作系列稀释，加上后续确认试验大约需要9h以上而且属于半定量试验，其技术特点决定了该法有时还会低估水样中大肠杆菌群的数目。本试验用多管发酵发来测定未央湖湖水中大肠杆菌菌群数。

2. 原理：人的肠道中存在三大类细菌：①大肠菌群（Gˉ菌）②肠球菌（G+菌）③产气荚膜杆菌（G+菌）。大肠杆菌是指能在37℃，24h之内发酵乳糖产酸产气，并营好氧及兼性厌氧的革兰氏阴性的无芽孢杆菌的统称。

大肠菌群的检验方法主要包括多管发酵法和滤膜法。前者可用于各种水样（包括底泥），但操作较繁，所需时间长；后者主要适用于杂志较少的水样，操作简单迅速。由于大肠菌群的数量大，在体外存活时间于肠道致病菌相近，且检验方法比较简单，故被定为检验肠道致病菌的指示菌。

大肠菌群包括四种细菌：大肠埃希氏菌属（模式种：大肠埃希氏菌）、柠檬酸细菌属（包括副肠道菌）、肠杆菌属及克雷伯氏菌属（包括产气气杆菌）。这四种菌都是监性厌氧、无芽孢的革兰氏阴性杆菌（Gˉ菌），有相似的生化反应，都能发酵葡萄糖产酸、产气，但发酵乳糖的能力不同。

多管发酵法是以最大可能数（most probable number）,简称MPN来表示的实验结果。大量的实验证明，该方法的检测结果有可能大于实际的数量，但只要每个稀释度试管的重复数目增加，就能减少这种误差。因此，在实验过程中，应根据要求的数据准确度来确定重复度的树目。

3. 材料方法：

3.1水样采集与保存：从本校附近的未央湖取水300ml左右，水样采取后迅速送回实验室在冰箱中保存。水样采

集时间是2007年11月24日。

3.2水样分析：研究大肠菌群数，采用多管发酵法，复发酵法．

3.3仪器设备：(1)显微镜

(2)放大镜

(3)高压蒸汽灭菌器

(4)恒温培养箱

(5)冰箱

(6)试管,平皿(9ml),锥形瓶(300ml),吸管(1ml,10ml)等等(需干燥灭菌)

(7)载玻片,接种环,酒精灯

(8)电子天平

3.4培养基

1乳糖蛋白胨培养基(供多管发酵法的复发酵用)

(1) 成份：蛋白胨2.5g，牛肉膏0.75g，乳糖1.25g，Nacl 1.25g，1.6%溴甲酚紫乙醇0.25ml，蒸馏水250ml.

(2) PH=7.2-7.4

(3) 制备：按配方分别称取上述成份加热溶于250ml蒸馏水，调整pH=7.2-7.4加入1.6%的溴甲酚乙醇溶液0.25ml。充分混匀后分装于试管内，每管10ml，另取一小倒管装满培养基倒放入试管内，塞好棉塞，包扎。置于高压灭菌锅内以0.7kg/cm2（115℃）灭菌20min,取出置于阴冷处备用。

3.4.2三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液（供多管法发酵用）

（1）成份：蛋白胨7.5g,牛肉膏2.25g,乳糖3.75g,Nacl3.75g,1.6%溴甲酚紫乙醇

溶液0.75ml,蒸馏水250ml。

（2）pH=7.2-7.4

(3)制备：按配方分别称取上述成份加热溶于250ml蒸馏水，调整pH=7.2-7.4加入1.6%的溴甲酚乙醇溶液0.75ml，充分混匀后分装于试管内，每管5ml。在每管中倒放入装满培养基的小导管。塞好棉塞，包扎，置于高压灭菌锅内以115℃灭菌20min，取出置于阴冷处备用。

3.4.3伊红美蓝培养基

（1）成份：蛋白胨2.5g，乳糖2.5g,磷酸氢二钾0.5g,琼脂5g, 蒸馏水250ml., 2%伊红5ml,美蓝水溶液3.25ml。

（2）制备：先将琼脂加至200ml蒸馏水，加热溶解，后加入磷酸氢二钾及蛋白胨乳糖使之溶解,再调pH=7.2-7.4,再加入伊红,美蓝水溶液, 置于高压灭菌锅内以（115℃）灭菌20min,储存于冷暗处备用。

3.4.4普通培养基制备

(1) 蛋白胨1.5g，牛肉膏0.75g，Nacl 0.75g，琼脂3g, 蒸馏水250ml.

（2）pH=7.6

（3）制备：将上述成份依次倒入装有250ml蒸馏水的烧杯中溶解，待全部溶解后，加水补足因加热蒸发的水量，用10%NaOH调整pH为7.6。塞上棉塞，包扎好待灭菌。

3．4．5革兰氏染色试剂

草算鞍结晶紫，革氏染液，无菌水，95%的乙醇，番红染液。

3．5实验原理

（1） 大肠杆菌群乳糖发酵法，大肠杆菌可在有胆盐存在条件下生长，通常可在37±1摄氏度发酵乳糖并产酸和产气。本方法有3 个步骤组成，即乳糖蛋白发酵实验（初发酵），平板分离培养，三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵实验（复发酵），后2步骤，耗时需72小时。

（2） 伊红美蓝法：革兰氏阳性芽孢杆菌在44.5±0.2摄氏度温度下能生长并发酵乳糖产

酸产气，选择伊红美蓝培养基进一步鉴别湖水中的大肠杆菌。

（3） 细菌菌数总数测定：细菌种类很多，有各自的生理特征，必须用适合他们的培养基才能将他们培养出来，然而，在实际工作中不易做到，通常用一种适合大多数细菌生长的培养基培养细菌，以他们的菌落数表明有机污染程度。

实验步骤：

（1） 全组人员商讨实验原理步骤，分配工作。

（2） 计算所需试管数目。

（3） 取水样。

（4） 制备上述三种培养基（方法见前面），并将培养液注入试管，普通10ml（7个），三倍浓缩5ml（3个），捆好，待灭菌。

（5） 水样稀释：先取10ml灭菌的移液管取10ml原水样，并和4管9ml无菌水排列好，按原水样，10-1（2个），10-2（2个）依次编号，再用1ml无菌移夜管吸取原水样于10-2标号的含9ml无菌水的试管中，摇匀即为10-2浓度菌液，同样方法用1无菌移液管吸取1浓度的无菌液于标号含9无菌水的试管中，摇匀即为10浓度菌液，其余10-1，10-2浓度，均按以上方法配制。

（6） 配置琼脂培养皿7个，包括原样水（2个），10-1（2个），10-2（2个），蒸馏水1个（对照用）。琼脂培养皿的制作采用倒平板法：取1支1mL无菌移液管分别取0.5mL菌液于相应编号的培养皿内加热融化培养基，当培养基冷至45℃左右时，右手拿装有培养基的锥行瓶，左手拿培养皿，以中指、无名指和小指拖住皿底，拇指和食指夹住皿盖，靠近火焰，将皿掀开，到入培养基后将培养皿平房在桌上，顺时针和逆时针来回转动培养皿，使培养基和菌液充分混合，冷凝后即成平板，倒置于30℃培养24～48h,观察结果。

（7） 初步发酵，将灭好菌的培养液从试管中取出，将水样注入试管中，向普通试管中注入原样水1ml（2个），10-1ml（2个），10-2ml（2个），蒸馏水1ml（1个），然后向小导管（7个）内注入普通培养基，分别倒置于以上试管中向三倍浓缩试管中注入10ml原样水（2个）。10ml蒸馏水（1个）对照。同样方法取3个小导管注入三倍浓缩培养液中，分别倒置于试管中，以上10支试管送至37摄氏度恒温箱内培养。

（8） 取出已经培养好的试管里的细菌，对试管进行观察，并记录结果发现：产酸且产气的原样水+三倍浓缩（2个），产酸10-1（2个），10-2（1个），原样水（2个），表明为阳性。制备伊红美蓝培养基，取有变化的试管里的细菌进行接种、划线于伊红美蓝培养基上，进行培养。同时将琼脂培养皿取出，观察细菌菌落数并记数，发现：蒸馏水（1个细菌群落），原样水（65个细菌群落，26个细菌群落）,10-1（7个细

菌群落，7个细菌群落），

10-2（1个细菌群落，3个细菌群落）。

（9） 取出培养好的伊红美蓝培养皿，观察分别挑取不同培养皿内的细菌，对其进行染色，显微镜观察并判断其阴阳性，发现并取培养出的大肠杆菌接种于乳糖培养基及三倍乳糖培养基中进行复发酵。

（10）观察复发酵结果：产酸产气（10ml原水样+三倍浓缩，1ml原水样+普通）

（11）清洗仪器。

实验结果计算：

（1） 细菌总数：蒸馏水（1个细菌群落），原样水（65个细菌群落，26个细菌群落）,10-1（7个细菌群落，7个细菌群落），10-2（1个细菌群落，3个细菌群落）。

由原水样计算菌落总数：65×2=130 26×2=52

由10-1浓度计算细菌总数：7×1/（0.5/10）=140

由10-2浓度计算细菌总数：1×1/(1/20)=200 3×1/(1/200)=600

（2） 大肠杆菌总数：

大肠菌群检验表（单位：个·L-1）

10 1 0.1 0.01 水中大肠菌群数·L-1

10 1 0.1 0.01 水中大肠菌群数·L-1

- - - -

- - - + 90

- - + - 90

- + - - 95

- - + + 180

- + - + 190

- + + - 220

+ - - - 230

- + + + 280

+ - - + 920

+ - + - 940

+ - + + 1800

+ + - - 2300

+ + - + 9600

+ + + - 23800

+ + + + >23800

注：水样总量11.11mL(10mL,1.0mL,0.1mL,0.01mL)

+表示有大肠菌群，-：表示无大肠菌群。

对照以上表格得湖水中大肠菌群数为2300。

国家标准中规定总大肠杆菌≤10000，而我们测定的未央湖湖水的总大肠杆菌为2300，远小于国家标准，即未央湖水完全符合国家标准。

注意事项：（1）要保证水样在采集、运输、保存过程中不受污染。

（2）实验过程中所 用的玻璃仪器均要灭菌。

（3）带菌培养基应在灭菌后再弃去，其他均遵守实验室安全制度。

(4) 检验开始前要充分摇匀混合水样，这样可以确保细菌在水样中均匀分布，以保证湖水大肠杆菌数量的准确性，这对检验结果的真实性是十分重要的。

(5)

结果与分析：经过实验结果与国家标准比较后，可得出未央湖湖水水质基本符合国家标准。测量一个湖水，特别像未央湖这么大一个湖，应该在湖的不同点采样，多处采样，多次测定才能比较准确地测定湖水水质指标，但是由于实验条件有限，所以在次只能取一个点来测量，由此测量结果未必准确，但可以大概地反映湖水的水质。

本次实验中，并不是所有培养基的试管都出现产酸

产气，可能原因有以下几方面：

1． 水样浓度太低

2． 采集水样时没有用专门的水样瓶，而是用锥形瓶代替水样瓶

3． 由于实验条件的限制，没有完全按标准发去做，平行试验太少

4． 原水样与10-1浓度培养后均表明有大肠杆菌存在，即本次实验还是比较成功的。在镜检中，均发现了阳性菌及阴性菌存在，说明大家对革兰氏染色掌握比较好。

讨论：由于人们生活水平的提高，越来越多的河水、湖水遭受到不同程度的污染，很多河湖水的综合污染指数逐年呈上升趋势，这就给环境工作者带来了巨大挑战，如何治理，如何控制，最主要的是从源头治理，而不是仅仅从末端治理。而近年来人们最担心的是湖水的富营养化，但是水中的大肠杆菌群数始终是一个显著的污染指标。除了大肠杆菌外，我们还应该注意湖水的其他水质指标，比如水中重金属的含量，还有水的色、嗅、味等指标。而其中湖水中的含Ｃ、Ｎ、Ｐ比例失调也将会引起很大的污染。

本次实验数据与结果只是作为实验测定而用，由于实验条件等个方面的原因，次报告并不能完全代表未央湖实际湖水的水质指标，其实际指标还有待近一步的测定。

参考文献

环境工程微生物学第二版，周群英、高延耀篇著 高等教育出版社出版

环境工程微生物学, 王国惠 主编 化学工业出版社出版 2005.7

污染控制微生物试验，马放、任南琪、杨基先 主编 哈尔滨工业大学出版社出版 2006.1

环境微生物学，乐毅全、王士男　化学工业出版社　2005.