可溶性蛋白的测定-考马斯亮蓝法
考马斯亮蓝G-250法 【原理】
考马斯亮蓝G-250(GooMAssIe BrIllIAnT Blue G-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色,在稀酸溶液中,当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色,前者最大光吸收在465nM,后者在595nM。在一定蛋白质浓度范围内(1~100μg),蛋白质与色素结合物在595nM波长下的光吸收与蛋白质含量成正比,故可用于蛋白质的定量测定。 【仪器与用具】
721分光光度计;10Ml量筒1个;研钵;烧杯;量瓶;移液管:1Ml 3支,0?1Ml 3支;10Ml具塞刻度试管14支。 【试剂】
标准蛋白质溶液:用牛血清白蛋白配成含蛋白质100μg/Ml的标准蛋白溶液; 90%乙醇; 85%磷酸(W/V);
考马斯亮蓝G-250溶液:称取100mg考马斯亮蓝G-250,溶于50Ml 90%乙醇中,加入85%的磷酸100Ml,最后用蒸馏水定容到1000Ml,贮放在棕色瓶中,此溶液在常温下可放置1个月。 【方法】
1 标准曲线(蛋白质含量为0~100μg/Ml)的绘制
取6支具塞试管,按表2-1数据配制含0~100μg/Ml的牛血清蛋白质液各1Ml。
表2-1不同蛋白质含量的牛血清蛋白质液配制表
在每支试管中加入5Ml考马斯亮蓝G-250溶液,盖塞,反转混合数次,放置2Min后,用1CM光径比色杯在595nM下比色。以蛋白质浓度为横坐标,以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。 2. 样品提取液中蛋白质浓度的测定 (1)待测样品制备:
称取新鲜玉米籽粒2g放入研钵中,加2ml蒸馏水研磨成匀浆,转移到离心管中,再用2ml蒸馏水分次洗涤研钵,洗涤液收集于同一离心管中,放置0.5-1h以充分提取,然后再4000r/min离心20分钟,弃去沉淀,上清液转入10ml刻度试管中,并以蒸馏水定容至刻度,即得待测样品提取液。 (2)测定:
另取2支10ml具塞试管,吸取样品提取液1.0Ml,放入具塞试管中(每个样品设置两个重复),加入5Ml考马斯亮蓝G-250溶液,充分混合,放置2Min后在595nM下比色,记录吸光值,并通过标准曲线查得蛋白质含量。 3结果计算
样品中蛋白质的含量(Mg/g)=C×VTV1×FW×1000(2-2) 式中C:查标准曲线值(μg);VT:提取液总体积(Ml); FW:样品鲜重(g); V1:测定时加样量(Ml)。