荧光计数法

操作步骤：

1. 取1mL 发酵液于9mL 的0.85%生理盐水中震荡、悬浮。

2. 避光条件下，取1mL 悬浮液，分别加入100μL 的PI 染料和100μL Super Green I染料，

摇匀，避光放置15min.

3. 用孔径为0.22μm 的黑色聚碳酸酯滤膜抽滤悬浮液，使菌体留在滤膜上。

4. 将滤膜放在载玻片上，盖上盖玻片，然后放于1000倍油镜下观察。

荧光观察步骤：

1. 打开明场电源开关

2. 打开汞灯电源开关

3. 将样品置于载物台上，用样品夹夹好

4. 将荧光光路shutter 打开，需保护样品时关闭shutter

5. 光路选择拉杆推至最里边

6. 根据样品的标记情况将荧光滤块转盘转到相应的位置

7. 通过两组减光滤片调节激发光强度

8. 从低倍镜开始观察，调焦，找到预观察视野，

9. 依次换到高倍镜头，观察样品

10. 拍照时光路选择拉杆完全拉出

关机注意：

1. 关闭汞灯电源（注意：汞灯需使用半小时以上方可关闭，关闭半小时以后方可再次

开启）

2. 将透射光调到最小，关闭明场电源开关

3. 将镜头转到低倍镜，取出样品，若使用过油镜用干净的擦镜纸擦拭镜头

4. 确认数据已经保存，关闭软件

5. 拷贝数据

6. 关闭电脑，登记使用时间、荧光数字等使用情况

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∙ • 一、荧光染料PI （碘化丙啶） • 二、PI(Principle Investigator的缩写)

一、荧光染料PI （碘化丙啶）

PI 分子结构

荧光染料PI （碘化丙啶）是一种可对DNA 染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测，英文全称是Propidium Iodide ，分子式为C27H34I2N4，分子量为668.40。它是一种

溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA 后释放红色荧光。尽管PI 不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。PI 经常被用来与Calcein-AM 或者FDA 等荧光探针一起使用，能同时对活细胞和死细胞染色。PI-DNA 复合物的激发和发射波长分别为535 nm 和615 nm。常用于流式细胞仪分析和显微镜观察，检测细胞凋亡(apoptosis)或细胞坏死(necrosis)。

保存条件：

4℃避光保存。

注意事项：

1. 对人体有刺激性，请注意适当防护。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

PI-dsDNA 复合物的激发光和发射光波

长

PI 荧光染料

细胞核荧光染料PI 碘化丙啶（简称PI ）是一种常用的细胞核荧光染色剂。它不能透过完整的细胞膜，但PI 能透过凋亡中晚期的细胞和死细胞的膜而将细胞核染红，PI 在绿色光（540nm 波长）的激发下，会在600nm （红色光）处发出明亮的荧光，与细胞核中的DNA 结合的PI 发出的荧光，与未结合的PI 相比，强度会增强20-30倍

无毒核酸电泳染料SUPER Green I 使用方法 ∙

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SUPER Green Ⅰ（10,000× DMSO溶液，电泳级） SUPER Green Ⅰ核酸染料特点 来源:生物谷 时间: 2010-5-24 浏览人数: 1646 ● 无毒性：属花箐类染料，容易生物降解，无致癌毒性。

● 灵敏度高：至少可检出20pg DNA，高于EB 染色法25～100倍。

● 信噪比高：样品荧光信号强，背景信号低。

● 操作简单：无须脱色或冲洗，即可直接用紫外凝胶透射仪或可见光透射仪观察。

● 适用范围广：可适用于多种凝胶电泳方法：琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳、脉

冲电场凝胶电泳和毛细管电泳等。

● 使用方便：对分子生物学中常用的酶（如：Taq 酶、反转录酶、内切酶、T4连接酶

等）没有抑制作用。

● 经济：价格比银染便宜。

SUPER Green Ⅰ使用方法简介

1．胶染法（用法同EB ） （推荐方法，见图1）

（1） 制胶时加入SUPER Green I 核酸染料。冷却胶至50℃左右，每100mL 胶中加入3～5μL SUPER Green

I 核酸染料。

（2） 按照常规方法进行电泳即可。

u 注：此方法染色可以准确确定片段分子量，用量相对较少。1mL 染料大约可以做300块100mL 的胶。

2．点染法 （见图3）

（1） 该方法适于琼脂糖凝胶电泳和PAGE 凝胶电泳。

（2） 工作液的配制：用电泳缓冲液将10000×的SUPER Green Ⅰ稀释100倍，即为SUPER Green Ⅰ工

作液。SUPER Green Ⅰ工作液可以置2～8℃保存一个月以上。

（3） 制胶：按常规方法制胶，不含任何染料。

（4） 样品染色：向分析样品中加入SUPER Green

Ⅰ工作液和载样缓冲液，室温

放置10分钟，使SUPER Green Ⅰ与样品中DNA 充分结合。SUPER Green Ⅰ工作液加入量为总上样量的

1/10。

（5） DNA Marker染色：将5μL DNA Marker和5μL DNA Marker稀释液和1μLSUPER Green Ⅰ工作液混

匀，室温放置5分钟，使SUPER Green Ⅰ与DNA 充分结合。

（6） 上样、电泳：按常规操作。

u 注：用点染法染色时，灵敏度最高，染料用量最少。但大片段稍有滞后现象，如果需要更准确确定分子量（与Marker 相比），建议使用胶染法。

3．泡染法

（1） 按照常规方法进行电泳。

（2） 用PH 7.0～8.5 的缓冲液（如：TAE ，TBE 或 TE ），按照10000﹕1的比例稀释SUPER GreenⅠ

浓缩液，混匀，制成染色溶液。

（3） 将染色溶液倒入合适的聚丙烯容器中，放入凝胶，用铝箔等盖住容器使染料避光。室温振荡染色10～30分钟，染色时间因凝胶浓度和厚度而定。聚丙烯酰胺凝胶直接在玻璃平皿上染色，将配好的工作溶液轻轻地倒在胶板上，让工作液均匀地覆盖整个胶板，并染色30分钟。玻璃平皿必须预先经过硅烷化溶液处理

（避免染料吸附在玻璃表面上）。

u 注：用泡染法染色时，可以精确确定核酸片段分子量。但染料用量是三种方法中用量最大的。

4. 点染＋胶染法（见图2）

此法结合方法1和方法2，灵敏度最高，对于低浓度样本比EB 检测更灵敏。

几种染色方法特点比较

SUPER Green Ⅰ使用注意事项

（1） 在SUPER Green Ⅰ点染法中，电泳时间不要超过2小时，否则SUPER Green Ⅰ会从DNA 上分离

出来，会产生弥散状条带。

（2） 用点染方法染色时，条带稍有滞后现象，如果需要确定片段精确分子量（和Marker 对比），建议使

用胶染法（方法1）。

（3） 在常规用酒精沉淀核酸的过程中，SUPER Green Ⅰ可以全部从双链核酸上去掉。

（4） 如果想对用 SUPER Green Ⅰ染过的胶进行 Southern blots，建议在预杂化和杂化溶液中加入

0.1%～0.3% 的SDS 。

（5） 在紫外照射透视下，与双链 DNA 接合的 SUPER Green Ⅰ呈现绿色荧光。如果胶中含有单链 DNA

则颜色为橘黄而不是绿色。

（6） SUPER Green Ⅰ对玻璃和非聚丙烯材料具有一定亲合力。建议在稀释、贮存、染色等使用过程中用

聚丙烯类容器。

EB 和SUPER Green I胶染法对比图。每孔道分

别上DNA marker 2000 10μL，5μL及2.5μL。

图1 胶染法

EB胶染和SUPER Green I胶染＋点染对

比图。每孔道分别上DNA marker 2000 10μL，5μL及2.5μL。 图2 胶染＋点染法

EB 和SUPER Green I点染法对比图。分别加1/10

体积上样的染料，室温静置5分钟，之后每孔道

分别上DNA marker 2000 5μL，2.5μL及1.25μL。

图3 点染法