细胞培养正常版

一，名词解释

In vitro culture 体外培养:指从活体内取出组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适当的温度和一定营养条件下存活和生长的方法。包括细胞培养、组织培养、器官培养。

Cell culture细胞培养：指从体内取出单细胞或细胞群，在无菌适当温度和一定营养条件下生存和生长并维持其结构和功能的方法

Life span of culture cells培养细胞生命期：指细胞在培养中持续增殖和生长的时间，与细胞种类，生物学性状和供体的年龄等因素有关

Cell fusion 细胞融合：两个细胞或两个以上细胞合并形成一个细胞的过程。常用诱导物为：① 仙台病毒（RNA 病毒）② 聚乙二醇（PEG ）

“返祖”现象细胞分化特征减弱或不明显，形态和功能趋于单一化，发生转化，获得不死性，或变成具有恶性性状的细胞群

Immatality 永生性或恶性性，是细胞转化的标志之一，即细胞获得持久增殖能力。永生性的细胞能够长期传代不死，并多伴有核型的改变，不一定具有恶性，但都会进一步演变成恶性细胞。

Deadaption 不适应：表现为细胞在原体内时所拥有的分化特性在体外培养时减弱或不明显

Dedifferentiation 去分化或脱分化:即细胞失掉发生分化的能力。可能是基因变异所致。，导致细胞分化表达受阻，分化基因表达不充分，但并不意味着细胞分化能力完全丧失

Anchorage-dependent cells 贴壁性细胞或锚着依存性细胞：这类细胞在培养时能黏附在支持物表面生长，大多数培养细胞呈贴壁性生长，有赖于贴壁才能生长的细胞。

“铺路石样”：细胞紧密排列时，细胞呈多角形或六角形

Netting 拉网现象：在构成上皮细胞膜状生长的细胞群中一些细胞常相互分离卷曲，致使上皮细胞膜中形成网眼状空洞，可能与细胞分泌透明质酸酶有关

NIH3T3细胞：美国国立卫生研究院首先建系的小鼠成纤维细胞的无限细胞系，具有永生性，接触抑制，无异体接种致

5癌性，每三天传代一次，每次接种3×10细胞/ml

Nude mouse，裸鼠：是20世纪60年代作为无毛变种被发现，后来查明该类小鼠先天性胸腺缺陷，此性状由隐性遗传基因“nu ”传递。裸鼠缺乏T 细胞免疫反应，而移植瘤的免疫排斥反应主要有T 淋巴细胞完成，因此将肿瘤细胞移植在裸鼠体内，能成功建立移植瘤。

Fedder cell 饲细胞：也成滋养细胞，系成纤维细胞或其他细胞生长形成单层细胞后，再用大剂量的射线照射，使细胞失去增殖能力，但应具有活力和代谢能力，令其作为底物将其他细胞接种于其上，饲细胞的代谢产物有利于其他细胞的生长，通常用饲细胞培养特殊难培养细胞。

Saturation density饱和密度：在特殊情况下，培养容器所达到的最大细胞数，此后，细胞停止增殖，在贴壁生长的细胞以每平方厘米细胞数表示，在悬浮培养的细胞，以每立方厘米的细胞数表示

Contact inhibition接触抑制：当一个贴壁生长的正常细胞也另一个细胞相互接触式，便停止分裂增殖，相互之间紧密接触，但不存在交叉重叠的现象，称为接触抑制。作为区分正常细胞和癌细胞的标志之一

Density inhibition 密度抑制：细胞接触回合成片后，虽然发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能进行增值分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多是，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制，导致细胞分裂停止。

Apoptic body 凋亡小体：细胞凋亡后，降解的胞浆及胞核成分被包裹在膜性成分中而形成凋亡小体，嗜伊红染色阳性。 PCD 细胞程序性死亡：正常机体细胞在受到生理和病理刺激因细胞凋亡基因表达而出现的一种主动的死亡过程。特点是凋亡小体形成，不引发炎症反应。

BBS 平衡盐溶液：主要是由无机盐，葡萄糖组成，作用是维持细胞渗透压的平衡，保持pH 稳定，并提供简单营养 Hamf12：使用微量元素，适应在血清含量低的情况下的细胞培养，有利于培养细胞的分化，也适合于克隆化培养，无血清培养基中常用的基础培养基

MC-COY5：是一种为肉瘤细胞设计的培养液，发现它除适用于原代细胞培养，，组织活检体液细胞及淋巴细胞生长外，还特别适用于较难培养的细胞的生长

Serum freemedium无血清培养基：利用促细胞生长物质的组合与合成附加物，再与基本培养及混合，使构成无血清培养基，对细胞有良好的促生长效应

Scid mouse严重联合免疫缺陷小鼠：一种淋巴细胞分化过程受损的小鼠，因抗原R 基因重组异常，使B 淋巴细胞不能发育成熟，机体的体液细胞免疫功能均缺陷，难检测到免疫球蛋白的分泌，这样Scid 小鼠就成为异种移植的良好活体承载系统

Suspension culture悬浮培养：细胞或细胞聚集体悬浮于液体培养基中的一种培养方法

Primary culture 原代培养：也成为初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1-4周。此期

细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。

subculture 传代培养：当细胞增殖到一定密度后，需要分离出部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代。或将细胞从一个培养瓶转移到多个培养瓶的过程

传代（passage ）：细胞增殖达到一定密度时，需要分离出部分细胞并更换新营养液，适应细胞的继续生长和增殖，这一过程称为传代。

Mitotic index（MI ）细胞分裂指数：细胞群中每1000个细胞中的分裂数，用来描述指数增生期细胞的分裂数量，是判定细胞生长旺盛与否的一个重要指标。

细胞群体倍增时间是指培养物中细胞数量翻倍的平均时间。

Diploid Cells二倍体细胞：在细胞培养中呈二倍体核型的细胞群体称二倍体细胞

Diploid cell line 二倍体细胞系：正常细胞在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，这种细胞称二倍体细胞系

Stem line 干系：当某一核型的细胞，在该细胞群中居多数时，具有该数值染色体数的细胞群即称为干系，也叫主流系。 二倍体细胞培养法：能维持细胞保持二倍体状态的培养方法。

Cell line细胞系：初代培养物开始第一次传代培养后的细胞即称之为细胞系。

Clone: 是指由一个祖细胞分裂形成的细胞群体，其遗传学特征、生物学特征都应完全相同。

Colony （集落）：是指一个以上的祖细胞分裂增殖而聚集在一起的细胞团。由于是来自不同的祖细胞，故其遗传学特征、生物学特征不同，甚至差异很大

Cell cloning细胞克隆：又称为单细胞分离培养，即把单个细胞从群体中分离出来单独培养，是指重新繁衍成一个新的细胞群体的培养技术。

Cell strain细胞株：细胞经过克隆后，后裔细胞群来源于一个共同的祖细胞，即形成所谓的纯系，即细胞株。

Certified Cells 已鉴定的细胞：各种已被命名Cell line 和经过细胞生物学鉴定Cell Strain 具有以下特征：形态均

一、生长增殖稳定、生物学性状清楚。符合上述情况的细胞群即文献中常称之为已鉴定细胞

RPMI1640：是一种常用的细胞培养液，最初是针对淋巴细胞培养而设计的，后来发现它能广泛用于许多种类细胞的培养，包括正常细胞和肿瘤细胞的培养，最适合于悬浮细胞生长。

Coloning efficiency 克隆形成率：克隆细胞时，要把细胞先制成单细胞悬液，再接种培养在底物上，让细胞单独生长，适应性较强和活力较好的细胞能增殖形成细胞小群（colony ）克隆。细胞群单个细胞形成克隆的百分数称为克隆形成率，用于表示细胞生活力和独立生长能力

2Plating efficiency接种存活率：细胞被制成散在的悬液后，以低密度2-5个/cm接种到底物上贴壁并能存活生长形

成细胞小群的细胞的分数值，成为接种存活率

HAT medium：是有次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)、胸苷(T)和甘氨酸及双蒸水配制而成的完全培养基。可以选择性的杀死骨髓瘤细胞及自身融合细胞，可用于杂交瘤技术中单克隆抗体的制备

MTT test（四甲基偶氮唑盐检测法）用于多药耐药性的检测。检测原理：活细胞线粒体脱氢酶可以还原MTT 为蓝色产物，药物作用后，用96孔板在酶标仪上测570nm 的吸收值，能表示存活细胞的量。

Precancerous Cell 癌前细胞：受一定剂量致癌物处理的细胞群中，并非所有的细胞都必定受到损害，受到打击发生启动并进入转化发展阶段的细胞仅是一小部分，散在于那些未受损的正常细胞中，这些细胞称为癌前细胞。随着转化的不断进展，细胞接触后却不发生接触抑制，最后形成可见的转化灶。

Population Dependence 群体依赖性：单个细胞不是细胞永久存在的形式，不能长期生存。一个有活力的细胞终需经过繁殖形成群体，只有群体细胞才是培养细胞的基本存在形式。单个细胞虽能生长繁殖，但不如群体细胞生存能力强，细胞量多时比少时易于培养，说明细胞之间能相互沟通信息，呈现着相互依存性或群体依赖性。

Gene Transfection 基因转染：将基因导入体外培养细胞中，观察目的基因在体外细胞中的表达。可用于基因治疗即取出体内细胞导入基因后，再输回体内。

Gene transfer 基因转导：即把基因导入细胞的技术，或成导入，培养细胞是基因转导最适宜的对象。外源性基因能整合入受体细胞基因组中

Transgenic Technique转基因技术：是基因转导技术的一种，受体细胞是受精卵，向受精卵导入目的基因后，再置入宿主动物子宫，发育成个体；可在胚胎期检测基因表达，也可于生后再进一步观察目的基因在整体水平内的表达。 cell therapy细胞治疗指将正常或遗传改造过的人体细胞直接移植或输入患者体内，以达到替代受损细胞、治疗疾病的目的。

MDR 多药耐药基因：其产物是一种糖蛋白p-170，它能将进入癌细胞中的抗癌药物泵出细胞外

Stem cells, SC 干细胞：是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。按分化潜能大小来分类全能干细胞，多能干细胞，专能干细胞。

PDFG 血小板生长因子：来源与血小板和血清中的一种多肽，具有强烈刺激细胞分裂活动性，可以表示细胞增殖旺盛程

度。

染色是利用化学染料与细胞及各种细胞器发生化学作用或吸附作用，使各种细胞结构能够通过染色改变其折射率，从而清晰地显现出来。染色有单染和复染两种

TUNEL 法 细胞凋亡时，DNA 双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA 的3’-OH 末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT ）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA 的3’－末端，从而可进行凋亡细胞的检测。

诱发细胞转化基因：能诱发细胞发生无限增殖和包括恶变在内的转化作用，癌基因便是该类基因中最主要的基因。 功能性基因：该类基因表达时，能产生特定功能的产物，如β球蛋白基因便是典型的功能性基因。

二．填空 现代组织培养的进步主要体现在消化酶的应用和液体培养基的应用 体外浸润性生长实验通常不选用鸡胚的软骨组织作为实验对象，是由于组织中含有胶原酶抑制物 细胞培养液的除菌需用滤过消毒法 单细胞培养的主要方法学基础是胰蛋白酶的应用和液体培养基的应用 诱发细胞融合的物质是聚乙二醇，分子量是1000，最适pH 值是6.0，最适用浓度是50：1

鉴定CSC 细胞的金标准是看分选得到的CSC 能否在移植动物体内形成新肿瘤 传代的频率或间隔与下列因素有关：细胞性质、培养液性质（Serum 多少）、接种的细胞数量和细胞增殖速度等。 细胞传一代后，通常经历三个阶段1．潜伏期2. 指数增生期3. 停滞期

体外培养细胞形态大致分类：1．成纤维细胞型2．上皮型细胞3．游走型细胞4．多形型细胞 指数增生期是细胞一代中活力最好和最主要的时期，各种试验多在此期进行。 消化液常用胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠（EDTA ），可单独使用，也可按一定比例混合一起使用 提高细胞在体外培养的成功率，是细胞培养实验工作的首要问题。关键在于初代培养。 体外培养细胞的两大生命特征是分化增殖和生长发育。 体外培养永生性细胞和体内细胞相比有较大差异，主要表现为单一化和不死性 体外培养永生性细胞和二倍体细胞的主要区别是无限增殖性和非二倍体核型 诱发体外培养细胞转化的主要因素是物理因素、化学因素、病毒和癌基因 悬浮型细胞培养成功的标志：细胞增殖

细胞冻存保护剂甘油或DMSO ，主要原则是慢冻速融、保持最大存活率

污染种类1微生物：细菌、真菌、支原体和病毒2化学物质：影响细胞生存、非细胞生存所需的化学成分3细胞：非同种的其他细胞

上皮组织特征性生长状态：膜状生长（细胞紧密相连），细胞数量多时最为明显；不规则多角形，呈铺路石样；“拉网”现象

上皮细胞培养的3个要点：① 需特殊底物②需特殊培养基③如何纯化和延长上皮细胞生存期。 检测体外培养细胞是否具有恶性的实验有异体接种致瘤实验，浸润生长性检测，软琼脂培养，凝集实验 抗癌药物检测时实验组是加药的癌细胞，对照组是不加药的癌细胞和加药的正常的细胞

胰蛋白酶消化反复贴壁法依据：1肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁慢2 结合使用无血清或低血清含量培养基

提高肿瘤细胞培养存活率和生长率措施1适宜底物2生长因子3动物体媒介培养（裸鼠为佳）

细胞从正常到发生恶性转化大致经过以下几个阶段：1．诱发2.DNA 的损伤与修复3发展或表现

从基因表达的持续性上可分为（1）稳定表达（2）瞬时表达

三．简答与问答

如何理解体外培养细胞的单一化现象？

体内生长的细胞在一个动态的平衡的环境中，受周围环境细胞的相互作用，接受内环境调控，相互影响，发生分化，表达生物学特性。而在体外培养的细胞，失去神经体液的调节和细胞间的相互影响，缺少动态平衡的环境，因而发生去分化和脱分化现象，表现为①失去原有的组织结构和细胞形态②分化特征减弱或不明显，形态和功能趋于单一化，出现类似“返祖”现象。③发生转化，获得不死性，或变成具有恶性性状的细胞群。

一定浓度的CO 2对细胞培养的影响作用，应用CO 2培养箱的注意事项？

一定浓度的CO 2，通常用5%可以使培养液保持稳定的pH 值

注意事项：1维持一定的浓度2保持开放氏培养3定期消毒内置紫外灯、酒精4一定的湿度，避免培养液蒸发

简述HAT 系统选择杂交瘤细胞的原理？

杂交瘤技术主要有细胞融合，抗体筛选和克隆化培养三部分组成，这三部分紧密连接，组成一套完整的技术体系。HAT 系统为次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶核苷的缩号，是根据嘌呤和嘧啶生物合成途径设计的分离杂交瘤细胞的特殊培

养基。氨基喋呤能阻断核苷酸的主要IMP 合成途径，诱变的次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT ）缺陷骨髓瘤细胞或骨髓瘤之间的融合细胞也失去了利用外源性次黄嘌呤或胸腺嘧啶核苷的能力，无法合成核苷酸，因此在HAT 培养基上不能生存。而杂交瘤细胞含有从亲代脾细胞来的正常基因而得以生存

简述浸润性生长检测试验及注意事项？

浸润性生长时细胞浸入或穿透其他组织增值生长的能力，是检测恶性细胞的一项有意义的指标，检测方法乣其他正常组织和癌细胞共同培养，观察癌细胞像正常组织浸润生长的情况，体外浸润实验最常用的宿主细胞是鸡胚组织，包括皮肤，肾，肝，肺和心脏组织，也可用羊膜组织，甚至骨组织。

注意事项1宿主组织培养1-3天后，镜下观察到有细胞游离生长时加肿瘤细胞悬液2应用肿瘤细胞团比单细胞悬液好，更接近体内肿瘤状态，容易观察3通常培养5天后观察到肿瘤细胞侵入宿主组织块中，甚至全部取代组织块4肿瘤浸润的形态学观察：将浸润模型组织进行石蜡包埋，切片染色观察。

提高克隆形成率的方法？

1、培养基; 自制适应性培养基和条件培养基，即不含有细胞而已被细胞生活过或同化过的培养基2、血清:选胎牛血清，

o 用时应先做克隆形成率实验，选最佳者使用。灭活处理：56C ，0.5h 3、激素：含1-100/ml的胰岛素培养液能促进更

多细胞克隆的形成4、CO 2 ：CO 2对对绝大多数细胞克隆形成率都有提高，多用5%浓度，成纤维细胞和胶质细胞2% 5、适应性底物：无限细胞系用塑料底物，原代培养细胞用胶原层或血浆纤维蛋白质作为底物6、饲细胞：用于克隆细胞附着底物的细胞层，利于克隆的形成7、底物特殊处理：多用聚右旋赖氨酸处理培养瓶和培养皿底物，能提高血清培养人成纤维细胞的克隆形成率

二倍体细胞培养方法？

指使培养的细胞始终维持二倍体生物性状的培养方法，它与一般培养相同关键在传代，培养中用采取以下措施：① 严格控制pH 最好在CO 2培养箱中培养②换液时间不要间隔太长，切不要全部更新，尽量保留一部分旧培养液以弃掉1/2或1/3为宜③每次传代均一分为二④掌握好传代时机，细胞不能过于密集，应及时传代⑤传代后细胞如不用于实验，立即低温冻存

传代期细胞的特点？

传代是原代培养物贴壁生长长满培养器皿的生长面或悬浮培养状态下细胞密度足够大时进行，原代细胞一经传代即改称为细胞系，细胞系可以继续传代。细胞传代期是个整个培养过程的主要时期，持续时间最长。特点：① 细胞分裂增殖活动旺盛，细胞生长活跃。② 在传代期内，细胞逐渐进入去分化状态。③原本混杂的细胞，会以一种能力强的细胞逐渐处于优势，比例越来越大。④ 在传代培养期的早期，细胞尚能保持二倍体核型，随着传代次数的增多，细胞发生转化的概率增大。

求证某化学药物是否有抗癌作用，如何进行试验？

1细胞：根据已知药物的作用特点，选用相应细胞。本题药效不明，选Hela 细胞，取适量细胞用胰蛋白酶消化制备成单细胞悬液。分成等量若干份接种入多空塑料板中，用CO 2培养箱培养2、加药 ①对照细胞 根据药物的性质和要求选用与相应的二倍体细胞作对照，一切营养条件同试验细胞②加药时间 生长中加药常用，加药时间宜在接种细胞后约48小时③药物作用时间 应用持续作用法，一般为7天，必要时中间换一次培养液，对照组做相同处理，加等量BBS 3、观察：实验开始后，每天按一定时间取一组培养细胞进行观察①形态结构 观察药物对细胞膜、微绒毛、内质网、线粒体、染色质有无影响②生长增殖 了解生长增殖状况，计算细胞分裂指数③细胞死亡 观察细胞死亡数以判断药效4、结果分析：引起细胞死亡，说明有抗癌作用

简述细胞转化实验何总细胞选择的原则，常用细胞，转化因素？

1、选择的原则：要求所有细胞共有适当的转化率，如过于稳定则转化成功率低，实验难以成功。如细胞对外界环境过于敏感，易发生自身转化，则影响实验的可信性。

2、常用的细胞：（1）原代培养细胞①地鼠：胚胎成纤维细胞较好②人细胞：人成纤维细胞较好（2）传代细胞系，常见的有C3H/10T1/2

3、转化因素：⑴化学因素：MNNG ⑵物理因素：射线⑶病毒：SV40⑷癌基因：大约需要两个以上

镜下观察组织培养细胞时应注意什么？对经常出现的问题应如何处理？

1、一般形态：正常细胞透明度大，轮廓不清。 不良时，轮廓增厚，胞质中出现空泡脂滴和其他颗粒状物，空隙变大，不规则，出现这种情况需要全面分析2、细胞增殖生长状态：初代培养或原代培养时，有一长短不同的潜伏期，当细胞分裂时数量增多，形成生长晕或连接成片则进入增值状态。 成纤维细胞易生长，上皮细胞呈；拉网状，要及时传代。

3、培养液：成红黄色，可能是CO 2积累增多，更换营养液，细胞生长旺盛时2-3天换一次，生长慢是3-4天换一次4、微生物污染：一旦污染及时处理

基因转导的实验流程？

比较胰蛋白酶vs 胶原酶生物活性的异同？

胰蛋白酶 胶原酶

消化特性 适应于消化软组织 消化纤维多的组织

使用浓度 0.01～0.5% 0.1～0.3μg/ml

消化时间 0.5～2h 1～12h

pH 8～9 6.5～7.0

作用强度 强烈 缓和

细胞影响 时间过长有影响 无大影响

血清抑活 有 无

Ca2+和Mg2+ 有影响 无影响

多空塑料培养板克隆细胞的主要过程及注意事项?

先制备出1-2细胞/ml低密度的细胞悬液。然后向多空塑料培养板各孔中分别接种细胞悬液0.5-1ml ，则每个孔平均含1个细胞，镜下检测每孔所含细胞数，标记下含单细胞的孔，置温箱中培养，数日后凡在已标记的孔中有生长增殖的细胞群即为克隆细胞，具体步骤：1消化：取健康待克隆细胞，吸出瓶内培养液，加消化液2、低密度细胞悬液的制备：用消化法制备出分散成单个的细胞悬液，然后将其稀释至细胞密度为1-2细胞/ml 3、接种：用加样器向塑料培养板每孔中加0.1-0.3ml ，置于CO 2温箱中培养4、标记：培养6-12小时后用倒置显微镜观察和标记含单个细胞的孔，置于CO 2温箱中继续培养，待孔内细胞增至500-600个时，进行分离培养5、分离扩大培养：选取生长良好的单细胞克隆孔，用胰蛋白酶将其消化成单个细胞后，加入培养基后移入令瓶或皿中，置于CO 2温箱中继续培养。用于常规培养法培养 注意1, 、观察并确定孔内仅含有一个细胞后，方可进行标记，凡不确认含一个细胞的孔者，不进行标记2、标记时要挑选含有健康细胞的孔3、也可接种到其他底物中进行细胞克隆

试述现代组织细胞培养的主要标志性进展？

1、培养液的改变：培养基由原来的天然动物血浆改进为应用人工合成培养基2、培养容器的改变：由试管培养改进为多种类型的培养瓶3、培养方法的改变a1948年，Sanford 创立了单细胞分离培养法b 、蛋白酶消化分离组织，分离细胞c 、液体培养基的应用d 、细胞培养用的多种材料都已经系统化和商品化e 、低温冷冻技术的应用，将以建立的多种细胞系和细胞株长期冻存4、细胞培养技术广泛应用于生物学和医学研究a 应用理化因素揉法出遗传缺陷的细胞株b 、杂交瘤细胞制备单克隆抗体c 、检测环境中可疑致癌物，癌基因转染和细胞转化等d 、基因工程的生产手段，用于生产多种生物制品

试述鉴定细胞是否具恶性性质的常用技术和注意事项？方法学如何？

1、软琼脂培养：正常细胞不能形成克隆而恶性细胞能形成。方法①琼脂制备②无菌制备DMEM ③底层琼脂制备④消化细胞⑤上层琼脂制备。注意①琼脂与细胞相混合时，温度不超过40o C ②细胞密度小于等于35个/cm2③计数细胞数大于20个细胞克隆。制备单细胞悬液④选择对数生长期细胞2、浸润性生长检测3、异种动物接种致瘤性：向异种动物体内接种备测细胞悬液，观察其是否能生长成瘤，以说明其致瘤性 受体动物以裸鼠最好。方法①实验前一天细胞免疫，制备细胞悬液，生理盐水洗1-2次②细胞计数③裸鼠一侧或双侧腋下、皮下接种0.2ml ④待肿瘤体积达10cm 后观察1-2个月解剖，固定，包埋，切片染色。注意①选择对数生长期的细胞②接种细胞数量不足，瘤细胞和恶性转化细胞不能形成移植瘤，形成假阴性③区别非特异性的局部反应4、ConA 凝集实验：癌细胞结合性较正常细胞强，比较集中5、核型分析：核型大多为异倍体，染色体形态异常6、细胞骨架和电镜分析7、癌基因和抗癌基因的分析

正常干细胞和肿瘤干细胞的不同点？

1肿瘤干细胞没有分化为完全成熟细胞的能力, 其分化程序异常。肿瘤细胞倾向于积累复制错误, 而正常干细胞的发育机制要防止这种现象的出现。2干细胞可以在某一时间内连续分裂, 也可在较长时间内处于相对静止状态, 干细胞的自我更新具有反馈机制调节, 增殖和分化处于平衡状态, 有序的; 而在肿瘤干细胞中, 这一调节机制并不存在, 它的增殖分化是无序的, 失控的。3干细胞的增殖具有自稳定性, 当组织处于稳定状态时, 平均一个干细胞产生一个子代干细胞和一个特定分化细胞, 其干细胞总数保持恒定。而肿瘤细胞无自稳定性的特点

如何评价细胞培养技术在检测药物效应中的应用？

优点1直接应用人体细胞作为实验对象（用动物进行检测存在着物种上的差别，不同种动物对同一种药的耐药性有很大差别）2如检测的药物具有组织特异性时，可选用相应的细胞3细胞生长在瓶皿中，加药后药物与细胞直接接触或直接注入细胞内，获得的实验结果比较迅速，比动物经济4结合使用多种方法技术检测药物效应多方面揭示药物特性5 与动物试验相比较为经济

描述两幅图内容，并进行比较？

一、 培养细胞的生命期（Life Span of Culture Cells）

指细胞在体外培养中持续增殖和生长的时间，与细胞的种类、生物学性状和供体的年龄等因素有关。(一) 原代培养期（primary culture）初代培养是指从活体内取出组织细胞开始体外培养到第1次进行传代之前的时期，一般持续1～4周。 特点：1．细胞群是异质性的（heterogeneous ），即各细胞的遗传性状互不相同，相互依存性强。 2．细胞呈活跃的移动，可见 细胞分裂，但不旺盛，细胞的结构和功能与体内仍很相似。3．克隆形成率低4. 多呈二倍体核型。5. 是检

测药物很好的实验对象。(二) 传代期：传代是原代培养物贴壁生长长满培养器皿的生长面或悬浮培养状态下细胞密度足够大时进行，原代细胞一经传代即改称为细胞系，细胞系可以继续传代。细胞传代期是个整个培养过程的主要时期，持续时间最长。 特点：① 细胞分裂增殖活动旺盛，细胞生长活跃。② 在传代期内，细胞逐渐进入去分化状态。③ 原本混杂的细胞，会以一种能力强的细胞逐渐处于优势，比例越来越大。④ 在传代培养期的早期，细胞尚能保持二倍体核型，随着传代次数的增多，细胞发生转化的概率增大。(三) 衰退期：正常二倍体细胞传代到一定的代数时，细胞的生命活动明显减弱，细胞虽然生存，但增殖缓慢或不再增殖，培养物很难长满培养空间，即便是及时更换新营养液也无济于事。此期细胞轮廓增强，胞质出现颗粒、空泡和脂滴等，最终细胞发生程序化死亡（PCD 或Apoptosis ）。

细胞转化：可发生三期中任何一点，多发生在传代期或衰退期，细胞发生转化的标志：① 获得永生性（也称不死性）或恶性性，即细胞获得持久增殖能力，称无限细胞系（Infinite cell line）或连续细胞系（Continuous cell line）。② 细胞核型改变，由二倍体变成异倍体

二、 组织细胞培养一代的生长过程

细胞传一代后，通常经历三个阶段：1．潜伏期(latent phage) ：是细胞对传代操作所致损伤的恢复期以及对新的生长环境的适应期。不论从活体组织制备细胞悬液进行原代培养，还是在进行传代操作时，都要使用蛋白酶等消化酶处理，细胞之间以及细胞及支持物黏附与连接的分子被破坏，细胞受到损伤。接种到培养器皿后，先经过一个短暂的悬浮期，接着细胞贴附在支持物上，称贴壁，悬浮期结束。该期细胞修复损伤，“熟悉”环境，恢复生长，但很少分裂2. 指数增生期：是细胞增殖最活跃，细胞活力最旺盛的阶段，分裂相增多，培养物中的细胞数量呈指数增长。指数生长期内细胞分裂相数量（即细胞增殖活性）可以作为判断细胞生长是否旺盛的重要标志。一般以细胞分裂指数（Mitotic Index，MI ）和细胞群体倍增时间表示。3. 停滞期：又称平顶期，细胞数量达到饱和密度后，不再分裂增殖，进入停滞期。细胞数量维持在某一水平上，生长活动停滞，但仍有代谢活动，该期培养液中营养物质渐趋枯竭，代谢产物积累，pH ↓。应及时传代，否则细胞发生中毒，形态老化，重者脱落死亡。传代应越早越好。

动物细胞培养的基本步骤？

1、准备，无菌条件。切取拟培养的动物器官或大组织块2、用Hanks 液漂洗，洗去血污3、 剔除多余成分4、将所有组织用盐科剪剪碎切成约1mm3大小的组织块 5、蛋白酶溶液消化用于组织培养 6、机械方法吹打组织块7、离心、制成细胞悬液8、计数、调节细胞密度9、 用于分离细胞培养

基因转导的试验流程？

1目的基因筛选和克隆2重组表达载体3转染靶细胞，进而进行阳性细胞筛选，阳性细胞克隆培养4若转染成功则出现绿色荧光，若培养后成活则转染成功存活

下图描述的是什么实验，应用如何，注意什么，各步骤的相关内容？

该实验室用于肿瘤细胞培养中除去成纤维细胞时用的胰蛋白酶消化反复贴壁法，利用肿瘤细胞较成纤维细胞贴壁慢且能在低血清培养基上能生长。

该实验适用于肿瘤细胞的培养。

实验中应注意1无菌操作2控制温度在适宜范围内3细胞消化分离时所用时间应适当，定时分离培养4低速离心，避免损伤细胞。

步骤1代表培养肿瘤细胞2代表加入培养基和酶后，进行培养3代表将2培养的细胞进一步加培养基进行培养4代表EDTA5离心管离心6克隆培养

单层细胞 → Hanks 液冲洗 →加无血清培养基吹打细胞制成单细胞悬液 → A 培养瓶→ 37℃静置5～20min →全部培养液移入B 培养瓶→ 37℃静置5～20min →全部培养液移入C 培养瓶，A 、B 培养瓶补充完全培养液继续培养，次日观察。A 瓶主要为成纤维细胞，B 瓶为两类细胞混杂，C 瓶则主要为肿瘤细胞。