粪便细菌DNA的提取
04-10
粪便细菌DNA 的提取
1. 0.2-0.5g 粪便置于Ep 管中(冰水浴),加入1mlPBS ,漩涡振荡混匀,200xg
离心5min ,取上清,冰水浴;
2. 向沉淀中加入1mlPBS ,重复步骤1;
3. 混合两次上清,用300g 离心5min ,弃沉淀;
4. 两次上清用10000rpm 离心8min ,沉淀菌体;
5. 所得沉淀用1mlPBS 洗涤至上清无色;
6. -20℃过夜;
7. 向Ep 管中加入500ulDNA 提取液,6ul 蛋白酶K ,37℃摇床160rpm 摇40min ,
再加入56ul20%SDS,65℃条件下水浴2h ,每隔15-20min 轻摇Ep 管;
8. 等体积酚/氯仿抽提,8000rpm 离心10min ,取上层水相,重复两次,除净蛋
白;
9. 0.6倍体积异丙醇沉淀DNA ,12000rpm 离心10min (4℃);
10. 用70%乙醇洗涤DNA 沉淀两次,自然干燥;
11. 沉淀中加入15ulTE ,在37℃孵育箱中孵育30min 。
DNA 提取液(pH8.0)
100mmol/L Tris-HCL
100mmol/L Na 2EDTA
100mmol/L 磷酸钠
1.5 mol/L NaCL
1% CTAB(100ml 提取液含CTAB1g )
Tips :
● 此DNA 可在4℃贮存6个月,-20℃保存时间更长,但要注意避免反复冻融,以免剪切
高分子量DNA 。
● 混匀时不要用力振摇,以免DNA 断裂。
● Tris 饱和酚:氯仿:异戊醇=25:24:1