噬菌体表面展示技术
中 国 生 物 工 程 杂 志
第23卷第7期
CHI NA BI OTECH NO LOGY
2003年7月
噬菌体表面展示技术
丁淑燕 苗向阳
1
2,333
1
1
3
1
朱瑞良 高玲美 邵建军
(1山东农业大学动物科技学院 泰安 271018 2中国农业科学院畜牧研究所 北京 100094
3中国农业大学农业生物技术国家重点实验室 北京 100094)
摘要 噬菌体展示技术(Phage Display T echniques ,PDT ) 是一种用于筛选和改造功能性多肽的生物
技术。自问世以来, 它已被广泛应用于生命科学的许多领域。对噬菌体展示技术的基本原理、噬菌体表面展示系统研究以及噬菌体展示技术的应用、展望等进行了探讨, 由此可以看出:噬菌体展示技术的进一步发展, 必将为生命科学及相关学科的发展带来深远的影响。关键词 噬菌体 展示技术 1985年,Smith 第一次证实丝状噬菌体fd 的基[1]
次要外壳蛋白融合并同时展表1990年,Smith [2]
术。, 并在其表面展示, 同时将其遗传密码信息整合到个体噬菌体的基因组中。这个技术的最大优点是直接将表达型与其基因型联系在一起, 再利用其配体的特异性亲和力, 将所感兴趣的蛋白质或多肽挑选出来。由此建立的噬菌体文库的滴度可达到10～10。它实现了基因型和表型的转换, 提供了高效率的筛选系统, 因而将会在众多基础和应用研究领域产生深远的影响。
6
12[3]
, , 。由于与固定相有的, 如此反复数轮淘选, 即可将无用的基因去掉而将有用的基因富集并分离出来。噬菌体展示技术是目前应用最为广泛的分子展示技术, 是利用细菌的病毒(如丝状噬菌体M13) 作为载体, 将基因和基因产物有机结合起来。
2 噬菌体表面展示系统研究
211 单链丝状噬菌体展示系统21111 P Ⅲ展示系统
[4]
丝状噬菌体是单链DNA
病毒,P Ⅲ基因编码病毒次要外壳尾丝蛋白, 每个病毒颗粒有4～5个拷贝。P Ⅲ区有2个位点可供外源基因片段插入, 即g Ⅲ基因氨基端(N 端) 和近N 端可屈伸臂区内, 当外源蛋白融合到P Ⅲ的N 端时, 噬菌体仍具有感染性。常用的P Ⅲ展示系统是将外源序列和P Ⅲ基因重组于噬菌粒上, 当辅助噬菌体超感染带有噬菌粒的细菌时, 完整噬菌体病毒才能被复制和包装。最终细菌释放2类颗粒:包装噬菌粒的噬菌体和辅助噬菌体, 每种颗粒表面均展示P Ⅲ分子和P Ⅲ融合蛋白。P Ⅲ易被蛋白水解酶水解, 在辅助噬菌体超感染时,P Ⅲ蛋白和P Ⅲ融合蛋白的竞争表达可以使每个噬菌体表面平均显示不到1个融合蛋白, 形成所谓的“单价”噬菌体。由于P Ⅲ单价表面展示体系可消除多价形成亲和力的作用, 有利于在免疫富集筛选过程中获得高亲和力克隆, 所以实验室常采用P Ⅲ展示系统递呈高亲
1 噬菌体展示技术的基本原理
噬菌体展示系统是将所克隆的基因与其所编
码的蛋白质以某种方式有机地结合在一起, 并使其基因表达产物在表面展示。由此建立的展示文库可通过淘选(Panning ) 将所需要的重组基因分离出来。所谓淘选, 是将展示文库作为流动相, 而将与欲选择的重组基因产物有特异性亲和力的靶分子固定在固相载体上, 洗去不能与固定相特异结合的
收稿日期:2003201221 修回日期:[1**********]国家自然科学基金资助项目(30070543) 北京市自然科学基金资助项目(5032012) 33通讯作者, 电子信箱:mxy32@sohu. com
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丁淑燕等:噬菌体表面展示技术
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和力的外源肽或蛋白。目前这一技术主要应用于抗体库的构建、生物大分子的表达和功能分析等方面研究。21112 PV Ⅲ及其它展示系统 PV Ⅲ基因编码丝状噬菌体主要衣壳蛋白, 每个病毒颗粒约有2700个拷贝。gPV Ⅲ的N 端可融合表达短肽(五肽或六肽) , 而较长的肽链则因形成空间障碍而影响噬菌体装配, 使其失去感染力,PV Ⅲ展示系统与P Ⅲ类似, 但是噬菌体上PV Ⅲ递呈的外源蛋白分子数目远远多于PIII , 且形成多价抗体, 从而降低重组衣壳蛋白拷贝, 因此可融合较大的多肽甚至抗体片段。由于gPV Ⅲ的拷贝数多, 该系统一般用于筛选
[5]
亲和力较低的抗体。
此外, 尚有丝状噬菌体P Ⅵ展示系统的研究报[6]
道。P Ⅵ蛋白的羧基端(C 端) 暴露于噬菌体表面, 可以作为外源蛋白的融合位点, 有利于研究外源蛋白C 端结构域(超二级结构) , 统展示效率比P Ⅲ和P Ⅷ212 T4T4T4噬菌体的小白S OC 的C 端融合而被展[7]
示。T4噬菌体与丝状噬菌体不同, 其病毒颗粒是在宿主细胞内组装, 不需要通过分泌途径, 因而其表面展示多肽和蛋白的范围广, 尤其适用于研究那些不能被大肠杆菌分泌的复杂蛋白质。目前应用较多的是小外衣壳蛋白(S OC ) 展示系统,S OC 分子量约为9kDa , 是T4衣壳组装所必需的, 而且不论是在体内还是体外, 它都具有与成熟的衣壳表面特定位点高亲和力的专一结合的能力, 其拷贝数约
4
为960Π衣壳或10Π多聚头部。利用1个阳性选择载体将融合有外源序列的S OC 融合基因同源整合入缺失S OC 的T4基因组中, 选择恢复溶菌酶生长不依赖性的噬菌体, 即可将外源肽或蛋白质展示于
[8]
噬菌体表面。有研究者在T4噬菌体的次要纤维蛋白fibritin 基因C 端插入编码乙肝病毒前S2区的53个和45个氨基酸的基因片段, 通过同源重组的方法将质粒中的融合fibritin 基因转移到T4噬菌体基因组中, 成功实现了外源蛋白表面展示。T4噬菌体展示系统容量大(35kDa 以上蛋白质) 、拷贝数高, 在分析抗原表位、细胞因子、受体及生物工程学等方面有相当大的应用潜力。其缺点是高价展示不适合高亲和力配体筛选。
λ噬菌体展示系统213
λ噬菌体是最早使用的克隆载体, 它在分子克
λ噬菌体展示系统是隆中始终起着重要的作用。
将外源序列插入噬菌体主要尾部蛋白PVC 端折叠
[9]
区(非功能区) , 或噬菌体头部组装必需的D 蛋白
[10,11]
λ噬N 端或C 端, 实现外源蛋白的表面展示。
菌体是在宿主细胞内完成装配, 无需将外源肽或蛋白分泌到细菌胞膜, 可展示有活性的大分子蛋白(100kDa 以上蛋白) 及对宿主细胞有毒性的蛋白, 适用范围极广。目前用该系统已成功展示了有活
ββ性的植物凝集素BPA 、2半乳糖苷酶、2内酰胺酶等
大分子蛋白, 其强大表达功能有望成为功能基因组
[11]
学研究的重要手段之一。
[12]
此外, 构建肽, 。该系统的。
3311 生产高效低价疫苗
将Ml3PVIII 基因克隆入p KK 23313质粒中, 将白色念珠菌特异表位基因插入到修饰后的质粒载体中, 并制备了杂合噬菌体, 展示此外源多肽, 将纯化的该表位抗原PA 免疫小鼠, 在有无佐剂存在的情况下均产生抗体, 小鼠脾淋巴细胞均明显增
[13]
殖, 无明显毒副作用。此法提示, 用噬菌体展示某些特异性抗原, 可获得低价高效的工程疫苗, 而且有研究显示, 在PVIII 基因外壳蛋白的N 末端展示的多肽, 其免疫反应的强度远远高于PIII 基因蛋白上的外源多肽, 而且此法产生的抗体特异性强, 因此是生产高效廉价疫苗的好途径。312 筛选酶抑制剂
噬菌体肽库是寻找抑制酶活性的肽段的理想
[14]
工具,Norgren 等利用噬菌体肽库技术筛选到了7种酶系中的6种抑制剂。酶的空间结构上有很多裂缝, 这些裂缝是酶的激活位点或别构效应的调节位点, 它们能结合特异性的配体。丝氨酸蛋白E 因子Ⅶa (FVIIa ) 是凝血机制的一个关键的调节因子,
[15]
Dennis 等从肽库中筛选到能非竞争性地抑制F Ⅶa 活性的肽段。这个肽段有很高的特异性和很强的亲和力, 并且对FVIIa 结构的分析表明, 此肽段结合在已知的活性位点之外的区域。肽段与此位点的结合后, 通过别构效应来抑制FVIIa 的活性。
30
313 构建噬菌体抗体库
中 国 生 物 工 程 杂 志
的大小。用这种方法,Dubaquie 等
[16]
第23卷完成了对类胰
抗体库是指免疫球蛋白可变区基因片段的重排而产生的各种抗体的总和。在免疫系统内的可变区发生重排后, 刺激B 细胞的形成, 每种B 细胞即为一个克隆, 其表面都呈现一种特异的抗体分子。噬菌体抗体库是在噬菌体的外壳蛋白N 端表面展示有抗体Fab (fragment antigen binding ) 或scFv (single chain Fv ) 。来自人外周血、脾或骨髓淋巴细
岛素生长因子的丙氨酸突变研究, 并测出它与两个
天然配体结合的位点。
316 应用于细胞信号转导的研究
细胞信号转导的物质基础是蛋白质之间以及蛋白质与其他分子间的相互作用。因此利用噬菌体展示技术可以鉴定信号蛋白识别结合位点, 绘制信号转导通路, 发现新的信号蛋白结合分子, 寻找信号蛋白相互作用的拮抗剂等。
[17]
胞cDNA , 用PCR 的方法扩增出抗体基因, 以分泌scFv 或Fab 的形式克隆到噬菌体载体中, 构建成人
源抗体库。近10年来, 对噬菌体展示的抗体片段的研究取得了很多成果。理论上讲, 任何抗原都可从天然抗体库中筛选到相应抗体。利用噬菌体展示技术对鼠抗进行人源化, 得到的抗体可用以治疗各种疾病。
314 构建cDNA 文库
4 噬菌体表面展示技术展望
噬菌体表面展示技术经历了十几年的发展和完善, , 已
、单区或更小片, 并, 同。噬菌体抗体库技术已显示出强大的生命力, 其潜在的应用价值正越来越受到人们的重视。较之杂交瘤技术, 其筛选范围广、容量大; 简单易操作、节省时间, 可直接获得抗体基因, 并易于改造成各种基因工程抗体。噬菌体抗体库技术绕过细胞杂交瘤这一步, 甚至不经免疫制备抗体, 使我们有可能模拟体内抗体生成过程构建高亲和力抗体。噬菌体表面展示技术之所以能得到迅速发展, 其根本原因是它可有效地实现基因型和表型的体外转换, 使研究者可以在基因分子克隆的基础上, 较准确地实现蛋白质构象的体外控制, 从而可获得具有良好生物学活性的表达产物
[18]
在噬菌体展示的cDNA 文库中段, 。一般可利用M13其E . coli 的噬菌体作为cDNA 。由于E . coli 只能有效表
达一部分真核蛋白, 而M13噬菌体和其他E . coli 噬菌体所能表达的真核蛋白更少。研究表明, 没有一个展示系统能够表达所有的真核细胞蛋白。无论如何, 噬菌体表面cDNA 库的表达将是研究蛋白质之间相互作用的有用工具。cDNA 库的噬菌体展示提供了一个应用免疫学方法进行筛选的条件, 取代了细胞内表达cDNA 文库, 然后挑选多个菌落的方法。
315 对蛋白质功能性表位的图谱分析
。噬
丙氨酸扫描分析法是对蛋白质功能性表位进行图谱分析的一种方法。利用丙氨酸突变移去侧链上除β碳原子以外的所有原子, 以此检测这个侧链的功能。用这种方法可以推断出每个侧链的功能, 但是对整个蛋白质的丙氨酸扫描非常费力, 因为必须构建大量的丙氨酸突变子模型, 并对这些突变子进行纯化, 然后才能对它们结构的完整性和亲合力进行分析。使用噬菌体展示的丙氨酸突变子能够大大地加快分析的过程。利用蛋白质与噬菌体的亲合, 这些蛋白质能很容易地分离纯化出来。并且利用抗噬菌体抗体来对结合在蛋白质上的噬菌体进行标记, 可以很容易地测出该蛋白质亲合力
菌体表面展示技术有着广泛的应用前景, 蛋白质三维结构预测、分子模拟技术及噬菌体表面展示技术的完善融合, 将推进分子相互作用、分子识别、受体作用、酶学机制以及生物疫苗等领域的研究进程。
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Ding Shuyan Miao X iangyang
1
2,3
Zhu Ruiliang G ao Lingmei Shao Jianjun
1 1
(1Animal Science and T echnology Department of Shandong Agricultural University T aian 271018) (2Institute of Animal Science of Chinese Academy of Agricultural Sciences Beijing 100094) (3S tate K ey Laboratories for AgroBiotechnology China Agricultural University Beijing 100094)
Abstract Phage Display T echniques (PDT ) is a biotechnique used for screening and reconstructing functional polypeptide. It has been widely applied to many fields of life science after its appearance. The research of display system on phage surface ,the principle ,the application and prospect of PDT were discussed. Therefore ,the development of PDT will bring profound in fluence on life science and related subjects.
K ey w ords Phage Display techniques