傅里叶变换红外光谱分析技术在预防医学领域的应用_杨姣兰

光谱学与光谱分析第22卷,第4期　　　　　　　

SpectroscopyandSpectralAnalysis2002年8月　　　　　　　

Vol.22,No.4,pp610-614

August,2002　

傅里叶变换红外光谱分析技术在预防医学领域的应用

杨姣兰,罗　添

中国预防医学科学院环境卫生与卫生工程研究所,北京　100050

摘　要　本文从环境污染、生命科学、应用开发及最新红外分析方法四方面阐述了傅里叶变换红外光谱分析技术在预防医学领域的具体应用:在环境污染领域主要叙述了气红联用(GC/FTIR)技术在环境复杂有机污染体系分析中的优势、局限性及解决途径;在生命科学领域主要叙述了红外光谱分析技术在蛋白质二级结构、膜蛋白、脂、核酸及细胞、组织等复杂体系研究中的具体应用;另外,还介绍了近红外光谱分析技术在食品、化妆品及保健药品等领域的具体应用及几种最新红外分析方法。

主题词　傅里叶变换红外光谱分析技术;环境污染;生命科学;近红外光谱分析技术中图分类号:O657.33　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-0593(2002)04-0610-05

　　预防医学研究的重要任务之一是通过不断创建、引进和应用新的、先进的技术来阐明化学、物理、生物等环境因素对机体的整体、器官、细胞、亚细胞结构、蛋白质、核酸的多终点、多靶位、多层次、多

水平的交互作用机理及可能产生的近、远期影响,以生物标志物和预警体系为重点提出环境因素的限量阈值和预防措施。

随着计算机与傅里叶变换红外光谱技术的不断发展,其中具有指纹特性的中红外光谱法已广泛应用于生物大分子和环境污染等领域;而近红外光谱法因其快速、无损、多组分的同时测定而成为2000年匹兹堡会议上反应强烈的四项新技术之一,广泛应用于食品、药品等领域。

下面从环境污染、生命科学、应用开发及最新红外分析方法四方面来阐述傅里叶变换红外光谱分析技术在预防医学领域的应用。

GC/FTIR的灵敏度较低(5～20ng级),比GC/MS(10～100pg级)低约二个数量级。

可供检索的Sadtler增强型EPA蒸气相图谱库数量为3240张光谱,与GC/MS的6多万张质谱图相比要少得多。对沸点为350℃～500℃中等挥发性有机组成的鉴定有困难。

围绕光管式气红联用技术灵敏度低的问题,仪器公司与分析化学家们都做了不懈的努力:

在仪器公司方面:推出了Tracer接口方式和基体隔离接口方式。两种接口方式的检测限可达10～100pg级,但都价格昂贵,推广困难。

而分析化学家们则进行了如下探索:

双冷井进样技术:即在GC/FTIR系统前,设有双冷井进样单元。其优点是:可大大提高灵敏度。缺点是:操作麻烦,价格昂贵,不适于低沸点组分。

预前柱技术:即在GC进样室内,装一根预前填充柱以化学方法除去大容量进样的全部溶剂。其优点是:可提高灵敏度1-2个数量级。其缺点是:工作量大。

不分流进样方式:其优点是扩大了检测范围。缺点是分离效果较差。

顶空进样技术:其特点是样品预处理简单,可大体积进样,在一定程度上改善了灵敏度,适用于挥化有机组份的分离鉴定。

如何应用各种技术,可视具体情况而定。周文敏等曾采用不分流进样/Cu2+预柱-毛细柱GC/FTIR的方法分析了长江大冶段河水中的痕量有机污染物,经谱库检索,鉴定出28种有机污染物,其中属美国EPA公布的优先污染物占12种。

1　在环境污染领域[1～3]

1.1　气相色谱-傅里叶变换红外光谱联用(GC/FTIR)技术在环境污染领域的主要应用

工业废水中复杂有机污染物的分离鉴定。气溶胶中包含的有机有害物质的分析鉴定。

工厂抛弃的化学废物,或受工业污水、农药、除莠剂污染的土壤中有机污染物的分离鉴定。

急性中毒事件中对未知毒物样品的组成和结构进行剖析,为进一步分析鉴定提供线索。

香烟烟气、卫生香烟气、蚊香烟雾化学成分的分离鉴定。化妆品中香精油挥发组分、食品中挥发组分及植物精油、药用挥发油组分的定性、定量分析。

但在环境痕量复杂有机污染物的定性鉴定和定量分析方面气红联用技术还受到如下几方面的限制:　收稿日期:2001-06-13,修订日期:2001-10-08

　作者简介:杨姣兰,女,1968年生,中国预防医学科学院环境卫生与卫生工程研究所副研究员

第4期　　　　　　　　　　　　　　　光谱学与光谱分析

此法比常用的GC/FTIR灵敏度提高了1～2个数量级,但它不能用于胺类化合物的分析。

总的说来,GC/FTIR与GC/MS是互补的两大分离分析技术,各有所长,GC/MS的灵敏度高,同时对碳氢化合物同系物的指认特别有效;而GC/FTIR对分子特征官能团的鉴定和有机污染物同分异构体的鉴定具有绝对优势,其灵敏度低的缺点可通过提高样品的富集倍数来改善。因此,在实际问题中选用哪一种技术,主要由信息内容来定。而对于环境中复杂有机污染体系的分析鉴定,常需GC/FTIR与GC/MS的联合使用。如Carlton等[3]利用GC/FTIR与GC/MS技术,建立了一种描述个体颗粒物暴露的微量分析方法,即收集个体24h的气溶胶样品,联合使用GC/FTIR与GC/MS技术对其中的26种多环芳烃进行了定性鉴定和定量分析。

1.2　利用污染物中特征官能团的特征分子振动的红外吸收,进行污染物的分析测定

1.Ying,Levine等人借助于长光程气体池及采用最小二乘法的LSF程序,研究了12种常用涂料溶剂的检出线,远低于工业卫生临界值TLV;Paluszkiewicz等利用可变长光程气体池分析了汽车尾气中的碳氢化合物,并经过毒理实验建议将C2H4定为一种致癌危险物。

2.美国环保局采用红外分光光度法,国际标准化组织(ISO)采用红外光谱法,利用油类物质中CH3,CH2,Ar的C-H伸缩振动,分别在波数2960,2930,3030cm-1处有特征吸收而进行水体中总油、矿物油的分析。

3.可将气溶胶样品收集在特氟隆滤材或KBr,ZnSe盐片上直接进行无机组分的红外光谱分析。

4.土壤腐植酸的红外光谱研究。

611

　　Byler等曾利用曲线拟合去卷积谱方法求得若干种纯蛋白的二级结构的含量,并与X-射线衍射法所得的结果作了比较,结果相当一致。孙素琴等利用计算机辅助解析FTIR光谱法研究稀土离子与钙调蛋白的相互作用。Dubols等人运用FTIR的方法研究了温度和压力对AmyloidA(淀粉样蛋白A)解聚作用的影响。CyrilRuckebusch等人对牛血红蛋白水解反应的反应进程进行了红外光谱法研究。2.2　膜蛋白的研究

可以定量分析细胞膜蛋白二级结构的变化及应用偏振FTIR技术测定膜蛋白不同二级结构在生物膜脂双层中定向的改变。如孙素琴等利用显微红外光谱技术探讨了自由基对

人红细胞膜蛋白的损伤,结果表明,自由基破坏了红细胞膜蛋白的二级结构而发生重构,且不能恢复正常。FTIR光谱还用于研究一些肽,如信号肽和通道形成肽等。还可用于研究膜运转蛋白,包括ATP酶、葡萄糖转运蛋白和离子通道蛋白等。如Alvarez等对人的红细胞葡萄糖转运蛋白的FTIR光谱研究表明:它的二级结构以α-螺旋为主,并且螺旋取向是垂直于膜的平面的,结合底物D葡萄糖导致螺旋取向的微小变化,这表明了这种结合导致蛋白构象的变化。ParvezIHaris等人运用FTIR,对一种与门控钾离子通道蛋白相关的,人工合成的S4多肽进行了构象分析,结果表明:将其溶解在2%H2O的三氟乙醇(TFE)中,肽类主要以α-螺旋形式存在,但当转移到水溶液中时,它的构象就发生了变化,主要以随机卷曲结构形式存在。有机溶剂TFE能够促进分子间的反应,因此经常作为一种诱导和稳定α-螺旋结构的溶酶。2.3　脂的红外光谱分析

应用红外光谱可以解决的问题是:膜磷脂分子构型、构象、结构的变化、蛋白在膜磷脂构型、构象变化中的作用,靠近蛋白处的脂的物理状态,是否膜蛋白与脂相互作用时对脂的化学结构或物理状态有特定的选择性,它是否控制膜上酶的功能。如:M.Cortijo等应用红外光谱研究了蛋白和脂的相互作用和膜蛋白在膜内的排布,其中包括各种内源蛋白如钙ATP酶等与模型膜的作用,还研究了天然基质膜,确定了内源蛋白在模型膜和天然膜内的构象,提供了内源蛋白对膜脂构象影响方面的有用信息。周群等利用傅里叶变换显微红外光谱法研究了羟自由基对红细胞膜脂损伤的作用机理,结果表明:自由基损伤后,C双键减少,C双键增加,P

含量改变;说明:碳氢链不饱和度降低,甘油基骨架的取向发生变化,极性区分子的结构发生变化。2.4　核酸的红外光谱分析

可以应用红外光谱法跟踪DNA右手螺旋和左手螺旋之间的结构转变;研究DNA和RNA的金属毒物加合物,并指认反映这些核酸中结构、构像变化的红外光谱的变化。如Hiro-humiArakawa等应用FTIR技术研究了Cr(Ⅲ),Cr(Ⅵ)离子

-与小牛胸腺DNA的键合作用,结果表明:CrO2与DNA的4

[8]

2　在生命科学领域

[1,4～9]

2.1　可进行蛋白质二级结构的定量分析与蛋白质构象变化的研究

各种蛋白质在FTIR谱图上一般表现出9个特征吸收带,对蛋白质进行二级结构的研究主要依靠AmideⅠ,AmideⅠ带主要在1700～1600cm-1区域内,它能给出α-螺旋、β折叠及无规卷曲等多种结构信息。对AmideⅠ带各峰的指认,目前尚无统一的标准,根据仪器、使用方法的不同,所指认的结果略有不同,Surewicz等提出的蛋白质二级结构的指认标准见表1。

Tab.1　TheStandardofassignment

波数/(cm

-1)

二级结构α-螺旋β结构β结构无序结构转角

1650～16581620～1640

16751640～1648

1665,1670,1683,1688,1694

PO2阴离子是以水合氢键形式结合。而在生理代谢系统中实际是以Cr(Ⅲ)-DNA的键合形式存在,当Cr(Ⅲ)与DNA的摩1,N-7上;当

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供科学依据。

2.5.2　细菌的分类与鉴别

细菌的红外光谱表达的是其自身物质的指纹信息,因此使用这种新技术可以研究亚种,甚至研究变种、血清族、血清型存在差异具有明显的优势。通过对已测定过的许多细菌的红外光谱的比较发现:区分和鉴别细菌最灵敏、最有效的光谱区域是900～1200和1200～1500cm-1两个区域。Naumann等通过对金黄色葡萄球菌和产气夹膜梭状芽孢杆菌的红外光谱的比较指出二者的区别至少有50～60处。现已有关于乳酸菌、放线菌、李斯特杆菌、链球菌、梭菌、军团菌等的FTIR光谱应用。另外,Naumann等人已建立了一整套关于各种细菌菌属和菌种的红外光谱数据库作为标准进行细菌的分类与鉴定。MichanelKummerle等人运用FTIR的方法建立了一整套酵母的标准化的样品制备方法,基于332个已鉴定的酵母菌种,建立了光谱数据库。KHong等人用FTIR的方法,建立了对于细菌细胞中Polyhydroxyalkanoates(PHA)的无损定性分析方法。AoifeC.McGovern等人利用红外对发酵过程中大肠杆菌表达的异种蛋白进行了定量分析。

Cr(Ⅲ)与DNA的摩尔比为1:10至1:4时,DNA发生缩合。另外,红外光谱的结果还显示Cr(Ⅵ)与Cr(Ⅲ)都不能引起DNA构象改变的指示峰836cm-1(脱氧核糖-磷酸盐伸缩振动)发生移动。

2.5　细胞和组织等复杂体系的红外光谱研究2.5.1　癌变细胞、癌变组织的红外光谱分析

利用傅里叶变换红外光谱技术可对正常人的组织、细胞和各种肿瘤组织、细胞进行对比研究,从分子水平揭示细胞癌变的可能机理及推断病程进展各期,为肿瘤疾病的早期诊断展现良好的前景。如慈云祥、沈世杰等人进行了乳腺癌变组织的Fourier变换红外光谱研究,彭卿等进行了胃肠道正常组织与相应肿瘤组织结构的FTIR光谱研究,刘金绪等进行了关于宫颈癌变细胞红外光谱测定方法的研究,孙素琴等进行了肺癌细胞组织内蛋白质二级结构的Micro-FTIR研究。通

过对各种肿瘤组织及正常细胞的红外光谱研究发现:谱图的变化主要集中在950～1500cm-1,2800～3050cm-1及AmideⅠ带,通过谱图解析可总结出如下规律:(1)癌变细胞中,糖原相对于核酸的含量大幅度下降;(2)核酸分子中磷酸二脂基团的氢键结合力大为增高;(3)蛋白质中一些氨基酸残基上C—OH基团的氢键遭受破坏;(4)细胞膜脂中亚甲基链结构和有序性发生改变。而且通过对发育分化异常细胞的光谱分析发现了相似的变化规律。总的来说,红外光谱法用于癌变细胞的鉴别及病程进展的诊断还处于数据积累阶段,尚无完整的谱库可供检索,但我们可根据癌变细胞与正常细胞红外谱图的差异性,从分子水平探讨致病机理,为早期阻断提

分析对象

马铃薯、玉米、大米、面粉、

生面团、食用面糊等肉类(如牛肉、猪肉、鸡肉、羊肉、鱼、香肠等)

烟草酒类乳制品食用油

饮料类(可乐、果汁等)

咖啡茶叶水果

烘焙食品(饼干、面包等)

化妆品制药

3　在应用开发领域

[10,11]

　　可利用近红外光谱分析技术进行食品、化妆品、保健药品的原位无损的定性鉴定和多组分的同时定量分析。

下面以表格方式来归纳近红外光谱分析技术在食品、化妆品、保健药品方面的应用,见表2。

定量测定的化学成分和定性分析的信息

Tab.2　Theapplicationsfornearinfraredspectrumanalysisinfood,cosmetic,drug

蛋白质、淀粉、脂肪、水分、各种氨基酸等组分及产地、季节鉴别、品质分级等。蛋白质、脂肪、水分、各种氨基酸等组分,以及新鲜及冷冻程度、产品种类、真伪

鉴别等。

总氮、尼古丁、总糖、还原糖、水分、香料、添加物、产地鉴别、等级分类等乙醇、含糖量、有机酸、含氮量等组分及真伪鉴别蛋白质、乳糖、脂肪、乳酸、灰质、含固量等脂肪酸、含水量、氧化程度、真伪鉴别咖啡因、糖分、酸度等,真伪鉴别

咖啡因、绿原酸、水分、产地鉴别、品质分级总氮、游离氨基酸、水分、茶多酚、咖啡碱、品质分级酸度、糖分、维生素、硬度、水分、品质分级蛋白质、脂肪、水分、淀粉、面筋面粉的烘烤性等

油脂混合物分析、原料纯度、香料、腊成分鉴别、均匀程度等

主要成份定量分析、水分、结晶测试、粉末粒径分析、原料鉴定、硬度、分解度、混合程序鉴定、塑料包装鉴别

　　应用近红外光谱分析技术进行定性鉴定一般采用峰位鉴别、模式识别(即聚类分析)、指纹鉴别和数据库鉴别等四种鉴别方法。而运用近红外光谱分析技术进行定量分析,其关键是建立预测效果优秀的数学模型。中国农业大学已成功地研制了近红外远程分析的网络系统,该网络系统配有近红外分析的各种软件并具有建立与优化近红外分析数学模型的能力。

在食品领域:应用近红外光谱分析技术分析食品中的蛋白质、水分、含油量、脂肪、纤维素、淀粉等化学成分在国外已是非常成功的技术,1986年就已经有了相关的专著《NearIn-fraredSpectroscopyinFoodAnalysis》,1992年的近红外分析手册《HandbookofNIRAnalysis》上的第7,8,16章均是关于近红外光谱分析技术在食品中的具体应用。同时,该技术已为食品工业管制所广泛应用,许多实验方案和计算方法已成为

第4期　　　　　　　　　　　　　　　光谱学与光谱分析

AOAC(AssociationofOfficialAnalyticalChemists)的标准方法,举例而言,采用近红外光谱法分析干蔬菜中水的含量已成为AOAC的标准方法(32043～32046);而采用近红外光谱法快速测量葡萄酒中乙醇的含量也已成为饮料工业中的品管方法之一。另外,用近红外光谱法分析各种小麦中的蛋白质已成为AACC(AmericanAssociationofCerealChemist)的标准方法(39-10);用近红外光谱法分析各种小麦及面粉中的水份、蛋白质也已成为ICC(InternationalofCerealChemist)的推荐方法(Nr.202)。

在药品分析领域:自1990年以来因仪器厂商与药物分析专家的通力合作,已促使美国食品药物管理局(FDA)、欧洲和加拿大药物局正式用近红外光谱分析技术取代繁琐费时的品管分析方法的可行性,部分测试项目已被FDA批准为标准方法。美国USP(UnitedStatesPharmacopia)也着手讨论制定标准的近红外分析方法。清华大学分析中心、中国药科大学分析计算中心已大量地应用近红外定量技术研究中成药的主成分,并建立了相应的定量分析数学模型。如刘荔荔采用近红外漫反射光谱法,运用偏最小二乘法,定量测定了西洋参中掺入人参的量,数学模型的校正标准差SEC为0.357,决定系数R2为99.95,预测标准差SEP为0.269;方法的相对标准偏差RSD为1.3%(n=7),平均回收率为100.3±2.6%。

在化妆品及洗涤剂方面:为提高分析速度,减少浪费,国外一些大的企业正积极探索近红外在化妆品质和洗涤剂质管分析中的应用。对原料、香料、油脂混合物及混合均匀度进行分析,同时定性分析可鉴定商品的真伪。

尽管近红外光谱分析技术有其独特的优势,但同时也存在局限性即:

有机成分分析检测限比较低。无机成分的分析比较困难。

613

与食品有关的两种酵母混合体系和两种乳酸菌混合体系,作者采用偏最小二乘法PLS,综合考察光谱范围内光谱的变化信息与相应细菌细胞数量间的相关关系,建立相应的定量模型。研究结果表明:在95%的置信水平下,酵母混合体系定量分析结果的相对误差小于4%,乳酸菌混合体系定量分析结果的相对误差小于16%。而常规平板定量方法允许的相对误差约为30%。另外,这种方法具有简便、快速的特点,从而显示出了这种方法用于微生物混合体系定量分析的巨大潜力。但它不能用于恒量、微量微生物混合体系的定量分析,如何解决这一问题,还有待进一步的研究探索。4.2　FTIR光谱的一种新的应用———CMIA

CMIA(carbonylmetalloimmunoassay)———羰基金属免疫分析法,是一种新的、无放射性的免疫方法。它是以金属羰基复合物作为示踪剂(tracer),以傅里叶红外光谱法作为检测方

法。这种方法是建立在这种复合物的特定的光谱性质基础之上的,它是在1800～2200cm-1的光谱范围内有较强的吸收带———而蛋白质和有机分子在此无吸收。AnneVessieres等人建立了这种方法,作者首先对FTIR光谱仪进行了优化,应用了液氮冷却的半导体材料检测器,随后引入示踪剂和多克隆抗体,再定量的检测这些示踪剂,建立了单一的CMIA方法和两联或三联的CMIA方法。4.3　光纤系统

FTIR光纤系统因其造价低、柔性好、感应器的体积小、适用于观察范围受限制的区域而具吸引力,但定量分析比较困难。FTIR光纤技术的发展为药学家提供了许多检测的新途径,尤其是体内的直接检测。对于体内样品,在方便的地方,如眼睛和嘴巴,通过插入光纤探测器就能够进行特定药品分子的FTIR指纹测定。这样就可以使我们对于药代动力学和药效动力学之间关系的研究水平大大提高。

总之,傅里叶变换红外光谱分析技术在预防医学领域有着广泛的应用,随着大量数据的积累和数据处理方法的不断进步,傅里叶变换红外光谱分析技术在预防医学领域的应用将在深度和广度上不断向前发展。

文

献

4　最新FTIR分析方法

[12,13]

4.1　FTIR光谱法定量分析微生物二元混合体系的组成

Oberreuter等人首次应用FTIR光谱法分别定量分析了

参

　[1]　吴瑾光.近代傅里叶变换红外光谱技术及应用,1994.　[2]　林　

考

实用傅里叶变换红外光谱学,1991,253.,吴平平,周文敏,王俊德等.

　[3]　AnnmarieGCarlton,etal.AerosolScienceandTechnology,1999,31:66.

　[4]　HirohumiArakawa,etal.TheJournalofBiologicalChemistry,2000,275(14):10150.

　[5]　SHENShi-jie,LIUBing-yu,LIQing,MAXi,andSONGZhan-jun(沈世杰,刘炳玉,李　清,马　溪,宋占军).SpectroscopyandSpectralAnalysis,(光谱学

与光谱分析),2000,20(1):28.

　[6]　DNaumann,DHelm,HLabischinski,Nature,1991,351(6321):81.　[7]　DMByler,etal.Spectroscopy,1986,1(3):29.

　[8]　ZHOUQun,SONSu-qin,ZHANGSheng-jun,etal(周　群,孙素琴,张声俊等).光谱学与光谱分析),1998,18(2):SpectroscopyandSpectralAnalysis,(

162.

　[9]　KHong.AppliedMicrobiologyandBiotechnology,1999,51:523.　[10]　BGOsborne.HandbookofNIRAnalysis,1992,527.　[11]　HandbookofNIRAnalysis,1992.

　[12]　H.Obeerreuter,etal,LettersinAppliedMicrobiology,2000,30:85.

　[]ofis,

614　　　　光谱学与光谱分析　　　　　　　　　　　　　　　第22卷

TheApplicationsforFourierTransformInfraredSpectrumAnalysisTechniqueinPreventiveMedicineField

YANGJiao-lan,LUOTian

InstituteofEnvironmentalHealthandEngineering,ChineseAcademyofPreventiveMedicine,Beijing　100050,China

Abstract　ThispaperexpatiatedtheapplicationsforFouriertransforminfraredspectrumanalysistechniqueinpreventivemedicinefieldfromfouras-pectsofenvironmentalpollution,lifescience,andthelatestinfraredanalysismethodsandnearinfraedanalysistechnique.Intheenvironmentalpollu-tionfield,itmainlydescribedtheadvantages,thelimitationsandthesolutionsofthecombinedapplicationsforgaschromatographandFouriertrans-forminfraredspectrum.Inthelifesciencefield,itdescribedtheapplicationforFouriertransforminfraredspectrumanalysistechniqueonproteinsec-ondarystructure,membraneprotein,phospholipid,nucleicacid,cell,tissue.Inaddition,italsointroducedafewlatestinfraredanalysismethodsandtheapplicationsfornearinfraredspectrumanalysistechniqueinfood,cosmetic,drug.

Keywords　Fouriertransforminfraredspectrumanalysistechnique;Environmentalpollution;Lifescience;Nearinfraredspectrumanalysistechnique

(ReceivedJune13,2001;acceptedOct.8,2001)　　

更正

　　(一)我刊2002年第22卷第1期145页表中化学类:“位次”第4行“化学通报”,应为“化学学报”。

[40,44][40～44]

(二)2002年第22卷第2期332页第一行“……分析的综述”应为“……分析的综述”。(三)2002年第22卷第3期第367页中有关作者单位“溥华大学物理系……”应改为“清华大学物理系……”。

特此更正,并向作者致以歉意。

(本刊编辑部)