实验室自建分子诊断项目基本要求专家共识

实验室自建分子诊断项目基本要求专家共识

实验室自建方法（laboratory developed tests, LDTs ）是指由实验室内部研发、确认和使用、以诊断为目的的体外诊断方法。仅限于本实验室内使用，不得在市场销售，也不得转移到其他实验室使用。做好实验室自建分子检测项目

（laboratory －developed molecular tests, LDMTs ），使其既能满足临床日益增长的分子诊断需求，又符合我国行政管理规范的要求。

LDMTs 的监管要求

1. 实验室资质以及环境要求

（1）实验室资质：分子诊断实验室应通过卫生计生行政部门认可的临床基因扩增实验室审核验收，并在有效期内。

（2）实验室环境要求：要求达到国家相关临床基因扩增实验室要求。

2. 人员要求

（1）开展LDMTs ，实验室应该有相应团队（应至少包括具有检验等相关专业的博士学位并具有相关研究经验和工作基础的研究人员1名，临床相关专业中级以上医师1名，检验相关专业中级以上检验技师1名）。

（2）自建分子诊断项目负责人应至少具有副高级以上专业技术职称、博士学位、并从事分子诊断工作至少3年。

（3）分子诊断实验室操作人员应经过有资质的培训机构培训合格取得上岗证。（4）签发分子病理报告的医师应至少具有中级病理学专业技术职务任职资格，并有从事分子病理工作的经历。

3. 管理要求

（1）开展LDMTs 项目之前，应有相关临床科室的申请、医务机构的审批以及医院伦理委员会的同意。

（2）应通过相关行政管理机构组织的同行专家委员会的评议，或经所在地省、自治区、直辖市人民政府相关行政部门审核同意。

（3）通过初次评议的项目在试运行一年后，宜申请相关行政管理机构组织的同行专家委员会的再评议，通过再次评议的项目，正式运行。

（4）通过再次评议的项目，宜接受每3年一次的复评审，用以监督该项目的运行情况。

（5）停用项目的标准和措施：一旦造成医疗纠纷或进入司法程序，相关单位的LDMTs 项目应立即停止使用，并进入紧急审核程序，通过相关行政管理机构组织的同行专家委员会的评议后，项目方可恢复检验。

（6）实验室须建立相应的程序和管理制度。

质量控制的基本要求

（一）应不低于国家标准、行业标准、地方法规要求，如《医疗机构临床实验室管理方法》、《CNAS －CL36医学实验室质量和能力认可准则在分子诊断领域的应用说明》等。

（二）开展LDMTs 项目临床应用检测之前，应进行性能确认。

（三）实验室自建分子诊断项目中，涉及的市售试剂耗材的质量保证，应不低于国家标准、行业标准和地方法规要求。

（四）定性检测项目，每次实验应设置阴性、弱阳性和/或阳性质控物。如为基因突变、基因多态性或基因型检测，则应包括最能反映检测情况的突变或基因型样品，每批检测的质控至少应有一种基因突变或基因型，并建议在一定周期内涵盖所有的基因型。

（五）定量检测项目，每次实验应设置高值、中值和低值质控物。

（六）应参加通过认可的能力验证计划提供者提供的能力验证计划。

（七）在没有能力验证提供的情况下，通过与其他实验室（如已获认可的实验室、使用相同检测方法的实验室、使用配套系统的实验室）比对的方式确定检验结果的可接受性时，应满足如下要求：

1. 规定比对实验室的选择原则。

2. 样品数量：至少5份，包括正常和异常水平或不同常见基因突变或基因型；频率：至少每年2次。

3. 判定标准：至少应有≥80%的结果符合要求。

4. 实验室使用两套及以上检测系统检测同一项目时，应有比对数据表明其检测结果的一致性，比对频次每年至少1次，样品数量不少于20份，浓度水平应覆盖测量区间，计算回归方程，系统误差应

次至少5份临床样品）进行检验人员的结果比对、考核并记录。使用不同生物参考区间的检测系统间不宜进行比对。

LDMTs 的方法学确认的技术指标

1. 准确性（accuracy ）：

准确性的评估可以使用参考物质进行评定，或者与另一种临床上有连续性并被普遍接受的方法（所谓" 金标准" ）进行比对。在缺乏金标准的情况下，可以引用参考文献作为指导。用于确认的标本通常选用与临床检测同类的标本。样品数n≥20，浓度应覆盖测量区间。定性结果一致性宜大于90%，定量结果一般可接受为不能超过对照方法平均含量的3个标准差或者15%变异度。

2. 精确性（precision ）：

因需考虑安排不同的操作者、不同批号的试剂以及不同型号的仪器来进行多次的重复操作，一般建议确认一项分子检验方法的精密度大致需要20个工作日。在选择待测标本用于确认实验时，一般用高和低2个不同含量标本来进行，并接近检测限。标本类型、取样与储存条件应尽量符合待测的临床标本。目前尚缺乏统一的国际参考标准来确定临床诊断实验室可普遍接受的精密度范围。对于定性试验，判断结果的一致性，一般符合率应该大于90%。对于定量试验，一般确认实验可接受的精密度为不能超过已知靶分子平均含量的3个标准差或者15%变异度。FDA 建议变异度不能超过20%。CNAS 的要求则以能力验证/室间质评评价界限（靶值±0.4对数值）作为允许总误差（TEa ），重复性精密度

3. 参考范围（reference range ）：

对于大部分检测项目，正常参考范围与异常值范围都是在前期研究中就已经明确，目的是为了给特定患者群体确定正常数值范围。对于定性试验，参考范围可以是阴性、正常、无克隆性增生，或者其他能够表明检测结果是否正常的用词。需要注意的是，某些检测项目是没有参考范围的。如对于HCV 阳性样本的HCV 基因分型检测，就无法在所有HCV 已知基因型中选出一个" 正常" 的基因型。

4. 可报告范围（reportable range ）：

对于定性测试，应包括所有的报告结果（如野生型纯合子、突变型杂合子或纯合子）。对于定量试验，实验室必须明确定量分析中的分析测量范围（analytic measurement range, AMR ）是指待测样品在未被稀释、浓缩或其他不属于常规检查步骤部分的预处理条件下，一种方法可直接测量待测样品值的范围。因为可以稀释样品，报告范围可能大于AMR 。

5. 分析灵敏度（analytic sensitivity ）：

定性实验中，分析灵敏性常用" 最低检测限（limit of detection, LoD ）" 来表达。这种检测低限指能连续在同一个标本中测到靶核酸的可能性在统计学上概率≥95%。定量实验中，多用" 定量限（limit of quantitation, LoQ ）" 来表示。与LoD 不同，LoQ 表示一个能够检测出的靶物质在标本中的最高和最低的量。对于某些分子检测方法来说，LoD 与LoQ 相同。但由于LoD 不需要考虑是否在线性范围内，所以LoD 常常比LoQ 还要低。

分析灵敏度的确认方法是通过一系列稀释已知含量的靶病原体或分子来分析最低检测限。在同一个实验条件下并用同一个批号的制剂，重复测定已稀释至最低浓度的标本，重复测定来自临床的5个标本，60个结果，CV 值小于指定标准视为接受。

6. 分析特异性（analytic specificity ）：

评价分子检测方法的交叉反应性，首先要获得尽可能多的可能与特定待测靶分子发生交叉反应的分子核酸序列并加以分析。如果在所测的标本中存在某些结构和核酸序列相近的病原体或内源性生物分子，应对这些病原体和生物分子进行验证评价。干扰物的作用是抑制正常PCR 反应，使结果偏低，从而造成假阴性。最常见的验证方法之一是在验证实验的过程中加入一个已知的PCR 反应对照。在测定过程中，如果PCR 反应对照未发生扩增或扩增产物量低于预期值范围，即可证实有干扰抑制物在该标本中存在。

7. 临床验证（clinical validity ）：

临床验证是确定某种分子检测技术检出核酸分子诊断疾病的能力。临床验证的目的是评价这种新的分子检测技术是否适合于特定的临床疾病的诊断。临床敏感性不同于分析敏感性：分析敏感性主要指参考方法检测结果为阳性的结果中，用实验方法得到阳性结果的一致性；临床敏感性主要指结果为真阳性的人群中真正罹患某种疾病或异常的比例，强调实验结果与临床诊断的一致性。同样的，临床特异性也不同于分析特异性，分析特异性主要指参考方法检测结果为阴性的结果中，用实验方法得到阴性结果的一致性。临床特异性主要指实验结果为真阴性的人群中真正没有罹患某种疾病或异常的比例[12]。也强调实验结果与临床诊断的一致性。值得注意的是在评价某些罕见的疾病，由于阳性病例的数量有限，实验室进行临床敏感性评价存有一定难度，这时可以引用文献报道的临床敏感性和特异性作为理论支撑。正常对照容易收集，比较容易实现临床特异性的评价。分子诊断项目分析前、中、后质量按相关要求执行，国家有相关规定的按相关规定执行。