水生动物多倍体育种的研究进展_钱国英

第１７卷　第５期 浙江万里学院学报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｖｏｌ．１７　Ｎｏ．５　２００４年１０月　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏｃｔ．　２００４

　

　

水生动物多倍体育种的研究进展

钱国英，朱秋华，汪财生

（浙江万里学院，宁波　　３１５１００）　

　

摘 要：多倍体诱导及其特性研究是水产养殖研究领域的一个热点. 目前诱导多倍体的方法有冷休克诱导、

热休克诱导、静水压休克诱导、6－DMAP 诱导，细胞松弛素B （CB ）诱导等. 文章主要综述了水生动物多

倍体的研究进展.

关 键 词：三（多）倍体诱导；温度休克；静水压休克；细胞松弛素；６－甲氨基嘌呤

中图分类号：Q813　　　　　文献标识码：A 文章编号：1671－2250（2004）05－0097－05

收 稿 日 期：2004－09－15

基 金 项 目：浙江省重点攻关项目（２００３Ｃ２２０１２）

作 者 简 介：钱国英，浙江万里学院副院长，教授；朱秋华，浙江万里学院生命与环境学院副教授；汪财生，浙江万里学院生命与环境学院讲师。

１　　引　　言　

由于多年来人工繁殖所造成的近亲交配，使水生养殖动物的品质严重下降．　为解决这些问题，近年来国内外专家学者致力于多倍体育种技术研究，已取得了一些成果．　所谓多倍体育种（Polyploid breeding ）就是通过增加染色体组的方法来改造生物的遗传基础，从而培育出符合需要的优良品种，以达到人类利用的目的．　由于三倍体生物具有三套染色体组，减数分裂过程中染色体联合的不平衡导致三倍体生物高度不育，从而形成繁殖隔离．　三倍体生物的不育特性，使用于繁殖的能量和物质转到生长方面，表现为生长加快，个体较大，具有肉肥味美的特点和较高的经济价值．　因而三倍体育种在多倍体育种中起着十分重要的作用．　四倍体生物具有四套染色体组，减数分裂过程中可以形成染色体联合配对，具有正常的繁殖可能．　四倍体与二倍体杂交可产生三倍体，能够克服通过物理或化学方法诱导三倍体所带来的缺点，从而更加安全有效地获得三倍体．　本文拟对水生动物多倍体研究进展作一综述．　　

２　　多倍体形成机理　

多倍体是由于细胞内染色体加倍而形成的．　染色体的加倍可以通过保留受精卵的第二次成熟（减数）分裂或抑制受精卵的第一次卵裂来实现．　对于二倍体水生动物来讲，成熟卵处于第二次成熟分裂中期，当具有一组染色体的精子入卵后，刺激卵子继续完成第二次分裂，卵中原有的二组染色体中一组作为第二极体排出，受精卵成为正常的二倍体．　如果在精子入卵时，第二极体不能正常排出，则精卵原核结合成为三倍体受精卵．　如果正常的二倍体受精卵的第一次卵裂受阻，卵核分裂而细胞质膜不分裂，阻碍细胞表层收缩环沟的形成而使细胞质分裂停止，则产生四倍体．　　

染色体加倍处理时机的不同是造成胚胎不同倍数和成活的主要原因. 在三倍体处理时机的选择上可抑

［２］制第一极体释放（M Ⅰ），也可选择抑制第二极体释放（M Ⅱ）. Stanley等通过对美洲牡蛎多倍体的研

究发现M Ⅰ三倍体的生长速度明显高于M Ⅱ三倍体，并认为抑制第一极体能使母本所有的杂合度在子代中保留下来，而M Ⅱ则使部分母本的杂合度丢失，从而使M Ⅰ三倍体的生长速度加快. 然而，抑制第一极体释放（M Ⅰ），导致第二次减数分裂过程中染色体分离的复杂化，产生大量的非整倍体，使孵化率和幼［１］

９８　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　浙江万里学院学报 ２００４年１０月 体成活率下降. Guo在利用CB 抑制太平洋牡蛎第一极体的排出试验时，发现在减数分裂过程中染色体的分离有联合两极分离、随机三极分离、非混合三极分离和独立二极分离等多种分离形式，使所产生的胚胎除了二、三、四倍体的胚胎外，有半数以上的胚胎是非整倍体，从而使孵化率和成活率下降（通过抑制第二极体释放（M Ⅱ）的排放获得三倍体是目前普遍采用的方法）.

［４－６］关于四倍体的诱导，主要通过抑制第一极体、第二极体或二倍体受精卵的第一次卵裂，以及采用

细胞融合、人工雌核发育结合抑制两个极体等方法实现，但四倍体胚胎的成活率很低. 普遍来说，由二倍体卵子受精后，经人工诱导处理形成四倍体核的细胞，细胞核较大，细胞质不能满足四倍体核分裂所需的体积和能量积累，造成分裂细胞数目不足而引起长牡蛎四倍体胚胎不能存活. 有人认为如果能增大卵子的体积，就可能解决这个问题，因此采用体积显著大于二倍体卵子的三倍体卵子与正常二倍体精子受精后，用CB 抑制第一极体释放，成功培育出存活的长牡蛎四倍体[8]. 这种诱导机制，提出的假设是第一极体受抑制的三倍体卵子进行第二次减数分裂时发生了联合两极分离，三倍的染色单体参与形成第二极体而排放到卵子外，另外三倍的染色体留在卵子中与单倍体的精子染色体结合，产生四倍体. 对于镶嵌式胚胎发育的受精卵来说，其四倍体胚胎的成活率更低. ［７］［３］

３　　水产动物育种中多倍体诱导方法和实践　

三倍体因为其不育性，生长周期短的特点，成为遗传育种中的研究热点．　可是目前用物理、化学方法直接诱导三倍体的诱导率不稳定，且很难达到１００％；同时，理化手段对受精卵的处理也影响到孵化率和早期幼虫的存活率．　因此，如果通过人工诱导培育出四倍体，再与正常二倍体交配来生产的三倍体，即克服了以上的问题，同时理论上有获得１００％的纯的三倍体的潜能，这为水产动物三倍体苗种的大规模生产提供了一条有效途径．　类似的制种技术在鱼类、贝类和甲壳类已开始应用，并取得了很好的成果另外通过生物学方法，即远源杂交，用异源精子诱发受精卵产生多倍体在鱼类和牡蛎上已获得成功３．１　　物理方法　［１０－２１］［９］．　［２２，２３］．　

３．１．１　　温度休克诱导　　通过温度调控技术诱导多倍体是物理方法中简便而效果佳的方法之一．　温度休克分为冷休克（０～５℃）和热休克（３０　℃）．　一般冷水性动物宜用热休克，温水性动物宜用冷休克．　其处理的效果与处理开始时间、持续时间以及温度的高低有关．　不同种类动物有不同的最佳处理条件，表１列出了几种水生动物的最佳处理条件与结果．　由表１可以看出，温度休克的敏感性与种质的遗传特性和卵子的成熟度有关．　通过温度调控技术诱导四倍体，在鱼类遗传育种领域已得到广泛应用．　

表１　　几种动物温度休克的处理条件与结果［２４－２７］　

种类

太平洋牡蛎

中国对虾

河蟹

真鲷

白鲫

鲤鱼 处理温度/℃ 0～2 9 33 40 1.5 40 42 授精后处理时间/min 2 10 8 15 550 5 37.75～38.5 52～54 处理持续时间/min 15 30 25 1.5 1.5 5 1.6 1 三倍体率(%) 50 43.8 35.0 44.26 17 四倍体率(%) 52.69 68 65

［２８，２９］３．１．２　　静水压休克诱导　　静水压休克诱导能够促使第二极体保留和抑制第一次卵裂的最显著作用是：静水压处理破坏了有丝分裂器中的纺锤丝，即纺锤体和星体，从而暂时阻断了有丝分裂的进程．　这

是日本学者Onozato [30]在采用静水压休克诱导虹鳟鱼、马苏大麻哈鱼和大麻哈鱼雌核发育研究中，用静水压处理囊胚细胞后，纺锤体消失而首次发现的．　此外，静水压处理还使染色体发生了不同程度的凝缩，导致染色体在后来的发育过程中呈现不同的变化．　静水压处理不当还可能使受精卵的结构发生某些物理和化学变化，得到的子代不可避免地产生轻微的染色体畸变，造成发育受阻

理时对设备的要求，生产中应用较少．　　

桂建芳等［３１］［３１］．　由于上述原因，加上处在水晶彩鲫的实验中发现，适合于静水压休克的作用时间（即第二极体保留的压力敏感期）较短，只在受精卵受精后４～５　ｍｉｎ时，就是在卵子第二次成熟分裂中后期．　在这之前，为卵子启动期，施加压力会破坏卵子的激动和修整过程，造成发育受阻；其后，为压力不应期，此时第二次成熟分

第５期　　　　　　　　　　　　　　　　钱国英，朱秋华，汪财生：水生动物多倍体育种的研究进展 ９９ 裂态势也趋于明朗，压力对保留第二极体失去作用．　　

［３２］在两栖类中，Brieds 等在用静水压处理第二极体已排出、第一次卵裂还未完成的豹蛙的受精卵时，

发现雄原核的运动受到限制，认为静水压休克使受精卵中完整的微管系统受到损害．　　

３．２　　化学方法　

３．２．１　　细胞松弛素诱导法　　细胞松弛素B （CB ）导致极体的保留，是通过阻止卵子微丝环的收缩和极体的分离来实现的. CB处理比其他物理方法（如温度，水压等）能更有效地诱导三倍体的形成.

CB 可以诱导栉孔扇贝产生三倍体. 用不同的CB 浓度，在不同的水温下，对卵子受精后不同时间，用诱导处理不同的时间，可得到不同的三倍体率，最高为50%，最低为17%. 抑制第一极体产生三倍体的杂合性比抑制第二极体产生的三倍体杂合性高. 因此，就获得优良的经济形状而言，应在卵子第一次减数分裂时诱导三倍体. Stanley　［２］　在牡蛎和鱼类上的试验，也证实了这一点.

从胚胎的发育状况来看，CB 对于受精卵有一定的毒害作用. 一般认为，D 形幼虫的存活率与CB 浓度和处理时间直接相关，当增大保护剂DMSO （二甲基亚砜）的剂量时，受精卵的畸形数量减少. 因此在生产上应用CB 诱导三倍体贝类时, 应当加大DMSO 的剂量, 由普遍应用的1 mL DMSO:1 mg CB增加至2 mL的DMSO:1 mg的CB 或更高

吕惰芬等［３４］［６，３３］. 用CB 抑制栉孔扇贝的第一极体的排出，产生三倍体. 其最佳抑制时间是卵子受精后10min. 25ºC 下，卵子受精后10min ，0.05×10-6的CB 持续处理20 min，获得了50%的三倍体. 23 ºC 下，卵子受精后10 min，0.1×10-6的CB 持续处理15 min，得到39％的三倍体. 此结果与Downing 的三倍体诱导的高峰值，都发生于和刚好先于第一极体形成时期的结论相一致

　［３６］－６　［３５］. －６Tobariniz 在海湾扇贝的卵子受精后10 min，用0.05×１０和0.1×１０CB 处理20 min，分别得到了

66%和94%的三倍体率，在贝类的育苗中算是比较成功的例子.

姜卫国等［３７］用CB 抑制合溥贝母的第二极体，胚胎三倍体率达77％，而处理第一极体，三倍体率只

［２３］　有40％，在产生三倍体的同时，还产生二倍体，四倍体，五倍体及大量的非整倍体. Que等观察了抑

制第一极体诱导太平洋牡蛎三倍体卵的细胞学过程，发现CB 可阻止第一极体的排放，改变正常的第二次减数分裂过程中染色体的分离方式, 从而诱导出多倍体.

杨惠萍等利用CB 抑制栉孔扇贝受精卵的第一极体和第一次有丝分裂获得了三、四倍体. 20ºC 下，卵子受精后10 min，用质量浓度0.5 mg/L的CB 持续处理10 min和20 min，抑制第一极体排出，结果三倍体率和四倍体率分别为38.38％和8.42％；卵子受精后1 h，用质量浓度0.5 mg/L的CB 持续处理10，15，20，25 min抑制第一次有丝分裂，其四倍体率分别为21.36％，27.57%, 28.41％，29.35％. 根据D 形幼虫的成活，10 min的 CB处理时间为最好.

３．２．２　　６－甲氨基嘌呤诱导法　　6–DMAP 是一种蛋白激素酶抑制剂, 是影响磷酸激酶作用的嘌呤毒素类似物. 当6–DMAP 与微管蛋白二聚体结合以后，对微管正常的结构和功能起到了抗有丝分裂的作用，因此可以产生三倍体. 除了有效的抑制受精卵的染色体分离和原核的移动，6–DMAP 会造成染色质分散，从而使极体排放受阻，诱导出三倍体［４０］［３９］［３８］.

6–DMAP 抑制第二极体产生的三倍体主要发生于发育至第二次减数分裂中期的受精卵. 受精卵在第二次减数分裂的后期接受处理，可使部分受精卵的两个雌性原核和一个雄性原核融合和分离过程中发生异常. 杨爱国等［４１］实验证明，6–DMAP 有效抑制了栉孔扇贝受精卵的染色体分离和原核移动，并可造成染色质分散，从而使极体排放受阻，诱导三倍体.

［４２］严正禀等对50％受精卵出现第一极体的九孔鲍，用6–DMAP 不同的浓度进行不同持续时间的三

倍体诱导. 结果表明，6–DMAP 的诱导浓度为300 µmol/dm３、诱导持续时间为10 min时，其诱导的三倍体率达90％以上，胚胎时期孵化率高达85％；幼体的畸形率较低，为50％~55％. 关于鲍的三倍体诱导的

［４３］［４４］研究，Kudo 等和Arai 等都在做持续性的实验.

田传远 ［４５］等用6–DMAP 抑制太平洋牡蛎受精卵第二极体的释放，诱导产生三倍体，最高诱导率为93.8％. 他们选用了L 9（34）设计，进行三因素三水平的正交实验：6–DMAP 浓度，设浓度300，450和600 µmol/L等三水平；诱导时机（以受精卵出现第一极体的百分率为指标），设10％，30％和50％等三

１００　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　浙江万里学院学报 ２００４年１０月 水平；诱导持续时间，设10，15和20 min等三水平. 根据正交试验直观分析结果，得出诱导太平洋牡蛎三倍体各个因素得最优水平组合为：当30％受精卵出现第一极体时，将受精卵浸泡在含有6–DMAP 浓度为 450 µmol/L的海水中，处理10 min.

４　　应用前景　

快速生长与品质优良是品种选育的主要指标．　三倍体生物具备了这一特点，故其应用前景看好．　利用四倍体与二倍体杂交产生１００％的三倍体；结合雌核发育，性别转变和三倍体诱导技术培育全雌三倍体鱼；这些技术已在水产动物育种中有了很好的实践．　如在培育全雌三倍体红鳟和降海型马苏大麻哈鱼上，已达到实用化水平．　　

既能提高经济效益，又能避免对天然资源的干扰，是三倍体育种具有强大生命力的主要因素之一．　纵观已有的研究成果，如果进一步优化三倍体诱导的处理条件，提高成活率，将会有更多的三倍体在水产养殖业中出现．　　

　

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Advances on the Polyploidy Manipulation in Aquatic Animals

QIAN Guo-ying，ZHU Qiu-hua，WANG Cai-sheng

（Zhejiang Wanli University, Ningbo 315100）

Abstract: The polyploid induction and characterization of aquatic animals has become a research hotspot in aquaculture. In the present paper, several methods for polyploid induction in aquatic animals, such as, cold shock, heat shock, hydrostatic pressure shock, the use of 6－DMAP and cytochalasin (CB) were reviewed. The advance in aquatic polyploid research was also discussed. Key words: triploidy ；manipulation ；temperature shock；hydrostatic pressure；cytochalasin ；6－DMAP