微生物遗传育种学

一、名词解释（3*5）

1、PCR:聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA 片段的核酸合成技术。

2、操纵子：操纵子(operon)：原核生物能转录出一条mRNA 的几个功能相关的结构基因及其上游的调控区域，称为一个操纵子 （Operon ）。

3、启动子(promoter)：真核基因启动子是RNA 聚合酶结合点周围的一组转录控制元件，包括：至少一个转录起始点及一个以上的功能组件。

4、冈崎片段:冈崎片段是由于解链方向与复制方向不一致，其中一股子链的复制，需待母链解出足够长度才开始生成引物接着延长。这种不连续的复制片段就是冈崎片段。

5、营养缺陷型：指某一菌株在诱变后丧失了合成某种营养成分（生长因子）的能力，使其在基本培养基上不能生长，必须加入相应物质才能生长的突变体。

6、准性生殖：是一种类似于有性生殖但比它更为原始的一种生殖方式。可使同一种生物的两个不同来源（即同种不同株）的体细胞经融合后，不通过减数分裂而导致低频率的基因重组。准性生殖常见于某些真菌，尤其是半知菌中。

7、限制性核酸内切酶(restriction endonuclease):识别并切割特异的双链DNA 序列的一种内切核酸酶。

8、密码的简并性：密码的简并性是多个密码子编码同一个氨基酸的现象。

9、转座子 (transposons ):转座子是可以从一个染色体位点转移至另一个位点的分散的重复序列。转座子也包括含有两个反向重复序列的侧翼，内有转座酶基因，并含有抗生素耐药基因等其他基因。

10、诱变育种：人为地采用物理、化学的因素，诱发有机体产生遗传物质的突

变，经选育成为新品种的途径。

二、是非题（2*5）

三、选择题（3*5）

1、限制性内切酶的种类、识别位点、功能、区别

根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制与修饰系统主要分成三大类。

Ⅱ型酶所占的比例最大，相对来说最简单，它们识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割 DNA 。

Ⅰ型限制与修饰系统的种类很少，一般是同源二聚体（homodimer ），反应只需Mg2+ 的存在才能发挥活性。能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA 分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。

Ⅲ 型限制与修饰系统的种类更少，有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序。它在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对则是任意的。

2、杂交特点和差异

Southern 杂交：Southern 印迹杂交是进行基因组DNA 特定序列定位的通用方法。用DNA 作为探针杂交DNA 。检测目标DNA 的存在与否。

Northern 杂交：在变性条件下将待检的RNA 样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot 相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。用DNA 或RNA 探针杂交RNA 。检测目标RNA 的存在与否。

Western 杂交：是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。用抗体和目的蛋白结合进行杂交。检测目标蛋白的存在与否。

Eastern 杂交：没有eastern 杂交。

3、四种生殖差异和特点

（一）有性杂交：有性杂交，一般指不同遗传型的两性细胞间发生的接合和随之进行的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种育种技术。

（二）准性杂交：准性生殖是一种类似于有性生殖，但比它更为原始的一种两性生殖方式，这是一种在同种而不同菌株的体细胞间发生融合，它可不借减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子。

（三）原生质体融合：通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定的重组子的过程，称为原生质体融合

（四）遗传转化：受体菌直接吸收供体菌的DNA 片段而获得后者部分遗传性状的现象，称为转化或转化作用。

4、SOS 反应涉及到的最重要的酶的作用

SOS 反应（SOS response）也称应急反应，指染色体DNA 受到严重损伤时细胞做出的应激反应。

LexA ：一种阻遏蛋白，结合于SOS 系统中各基因的操作子上，关闭这些基因；

RecA ：有3种活性：重组活性；单链DNA 结合活性；蛋白酶活性（活化需单链DNA ，只作用于少数蛋白，LexA 是其中之一）。

5、四种突变的差异

突变：遗传物质核酸中的核苷酸序列突然发生了稳定的可遗传的变化。

（一）按突变发生原因分类

自发突变(spontaneous mutagenesis) ：未经任何人为的处理而自然地发生的突变，称为自发突变。

诱发突变(induced mutagenesis) ：由人们有意识地利用物理或化学手段引起的突变称为诱发突变。

诱发突变的频率要远远高于自发突变频率

（二）、按变化范围分突变类型

突变可以发生在染色体水平或基因水平，发生在染色体水平的突变称为染色体畸变，发生在基因水平的突变称为基因突变。

染色体畸变（chromosome aberration)：染色体数目的变化或染色体结构发生较大片段的异常改变。

染色体结构的变化：染色体结构的改变，多数是染色体或染色单体遭到巨大损伤产生断裂，而断裂的数目、位置、断裂端连接方式等造成不同的突变，包括染色体缺失、重复、倒位和易位等

（1）缺失 deficiency ：是染色体片段的丢失。

细胞学效应：缺失环

遗传学效应：这种突变往往是不可逆的损伤，其结果会造成遗传平衡的失衡。

（2）重复 repetition ：是染色体片段的二次出现。

细胞学效应：重复环

遗传学效应：这种突变有可能获得具有优良遗传性状的突变体。

（3）倒位 inversion ：是指染色体的片段发生了180°的位置颠倒

细胞学效应：倒位环

遗传学效应：造成染色体部分节段的位置顺序颠倒，极性相反。

（4）易位 translocation ：是指一个染色体的一个片段连接到另一个非同源染色体上。

基因突变是指一个基因内部遗传结构或DNA 序列的任何改变，包括一对或少数几对核苷酸的缺失、插入或置换，分为碱基置换和移码突变。

点突变point mutation ：单碱基对的置换

多位点突变：突变超出一个基因范围。

碱基置换：DNA 链上一个碱基对为另一碱基对所取代叫碱基置换

移码突变：在DNA 序列中由于一对或少数几对核苷酸的插入或缺失，而使其后全部遗传密码的阅读框架发生移动，进而引起转录和转译错误的突变叫移码突变。

（三）按突变是否引起遗传编码特性的改变分类

一类是引起遗传性状改变 ：——错义突变（missense mutation ），无义突变（nonsense mutation）和移码突变

一类是不改变遗传性状的突变 ——同义突变（synonymy mutation ）和沉默突变（silent mutation）。

错义突变 missense mutation：突变后的密码子编码另一种氨基酸。个别碱基的改变导致多肽链上某个氨基酸为另一种氨基酸所取代。

无义突变 nonsense mutation：突变后的密码子变为终止密码。

同义/沉默突变 silent mutation ：突变后的密码子编码的仍是同一种氨基酸。（碱基序列发生改变而氨基酸序列未发生改变的突变称为同义/沉默突变）。

沉默突变的发生是由于遗传密码的简并性。

同义突变和沉默突变不会导致编码特性的改变，但往往会引起限制酶切割位点的变化，造成DNA 限制片段长度的多态性。

（四）、按突变的表型变化效应分类

野生型 wild type：表现该物种正常表型的生物。

突变型 mutant ：由于突变导致其正常的表型发生了改变的生物。

形态突变型morphological mutant ：引起细胞个体形态和菌落形态发生改变的突变型。是一种可见突变。

生化突变型：引起特定生化功能的丧失而无形态学效应的突变型。包括营养缺陷型、抗性突变型、糖代谢突变型等。

营养缺陷型 auxotrophic mutant：由于代谢过程的缺陷而不能合成某种与合成初级代谢物有关的基因产物的缺陷型。

抗性突变型 resistant mutant ：由于基因突变而产生的对某种化学药物、致死物理因子或噬菌体具有抗性的变异菌株

抗药物突变型：对原本敏感的药物具有一定的耐性。

抗噬菌体突变型：对原本敏感的噬菌体产生抗性。

致死突变型 lethal mutant：由于基因突变造成个体死亡的突变型。杂合状

态的显性致死和纯合状态的隐性致死都导致个体的死亡

条件致死突变型：在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下没有致死效应的突变型。如：温度敏感突变型 temperature-sensitive mutant

调节突变型：丧失对某一基因或操纵子表达能力调节的突变型。

产量突变型:所产生的代谢产物的产量明显有别于原始菌株的突变株称产量突变型

6、M RNA翻译位点：A 、P 、E 的功能

细菌核糖体上一般存在3个氨酰-tRNA 结合位点，即

A ，P ，E 位点。只有fMet-tRNA 能与第一个P 位点结合，

其他所有tRNA 都必须经过A 位点，然后到达P 位点，

再由E 位点离开核糖体。

7、基因型的书写格式（大小写）

１）每个基因座位用斜体小写的三个英文字母表示。trp--色氨酸基因,

2) 产生同一表型的不同基因，在三个字母后用大写斜体英文字母表示：trpA 和trpB

3）同一基因不同突变位点，在基因符号后加阿拉伯数字。trpA23， trpA46

4) 在基因符号的右上角加+或-表示该基因功能存在缺陷：his+---组氨酸野生型； his- ---组氨酸缺陷型；在基因符号的右上角叫r 或者s 表示对药物的抗性或敏感性： strs ---链霉素敏感野生型； strr ---链霉素抗药性突变型。

5) 基因的表型和产物用三个正体英文字母表示, 其中第一个字母大写。Ara+

8、培养基：SM 、CM 、MM 选择的差异（P97）

（1

）仅含糖类、无机氮和其他一些无机盐类的合成培养基，在育种上能够满足

野生型生长需要的培养基，叫做MM 。

（2）当产生营养突变后，就必须在MM 上补加某种生长因子，一般是氨基酸、维生素和嘌呤、嘧啶等化合物，这种补充培养基简称SM 。（这种培养基只能供合成该种因子的变株生长，而其他的缺陷型仍不能生长）

（3）在MM 中同时添加了蛋白胨和酵母膏，一般的营养缺陷型都可以在上面生长，这样的完全培养基称为CM 。

（4）野生型能在MM 、CM 中生长；缺陷型在CM 、SM 上生长良好，而在MM 上则不生长；缺陷型通过回复突变或基因重组成原养型菌株，能在MM 、CM 中生长。

三、简答题（5*4）

1、基因工程的四个主要步骤 169

一是取得符合人们要求的DNA 片段，即目的基因；

二是将目的基因与质粒或病毒DNA 连接成重组DNA ；

三是将目的基因导入受体细胞；

四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来，目的基因的检测与鉴定。

2、遗传重组、转化、转导的差异及名词解释。

凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为遗传重组。

受体菌直接吸收供体菌的DNA 片段而获得后者部分遗传性状的现象，称为转化或转化作用。

通过缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的小片段DNA 携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。获得新遗传性

状的受体细胞，就称转导子。分离得到的DNA 进入细菌细胞中以后的重组。

3、基因型的书写形式（P29）（前文）

4、诱导育种一般流程（P84）

1、出发菌株的选择；

2、诱变菌株的培养；

3、诱变菌悬液的制备；

4、诱变处理；

5、后培养；

6、高产突变株的分离和筛选。

5、点突变对氨基酸序列有什么影响

点突变指单碱基对置换，也称点变。置换的方式有两种：① 转换：一种嘌呤转换了另一种嘌呤，或一种嘧啶置换另一种嘧啶；② 颠换：嘌呤和嘧啶之间的互换。转换和颠换如发生在基因的蛋白质编码系列中根据基因转录和翻译产生的蛋白质可把点突变分为三种：

（1）同义突变：基因的蛋白质编码系列中发生单个碱基对的置换突变，但

没有改变最后产生的蛋白质的结构，这类突变称为同义突变或中性突变。

（2）错义突变：突变后，单碱基对置换形成的密码子，编码另一种氨基酸，最终产生另一种蛋白质，就有可能影响、改变或丢失原有蛋白质产物的功能，或获得新的功能。

（3）无义突变：指一个编码氨基酸的密码子，在点突变后成了一个终止密码子，使多肽合成提前中止，产生了缺失原有羧基片断的肽链。

6、菌种的保存方法、特点、描述

1．传代培养保藏法 又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4—6℃冰箱内保存。

2．液体石蜡覆盖保藏法是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。

3．载体保藏法是将微生物吸附在适当的载体；

4．寄主保藏法，用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物。

5．冷冻保藏法，可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。

6．冷冻干燥保藏法，先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。

四、图例分析（10*1）

1、真菌的无性生殖、有性生殖（P146）

2、mRNA 转录和修饰

五、论述题（10*3)

1、如何用影印平板法筛选营养缺陷型。

1）将诱变剂处理后的细胞群涂布在一完全培养基平板上，经培养长出许多菌落。2）用特殊工具——“印章”把此平板上的全部菌落转印到另一基本培养基平板上。3）经培养后，比较前后两个平板上长出的菌落。如果发现在前一培养基平板上的某一部位长有菌落，而在后一平板上的相应部位却呈空白，说明这就是一个营养缺陷型突变株。

2、大肠杆菌为例，乳糖操纵子控制基因表达的过程。P19

1、乳糖操纵子的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z 、Y 、A 三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列O ，一个启动子P 和一个调节基因I 。

2、阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，I 基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O 处，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。所以，乳糖操纵子的这种调控机制为可诱导的负调控。

3、CAP 的正性调节：在启动子上游有CAP 结合位点，当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时，cAMP 浓度升高，与CAP 结合，使CAP 发生变构，CAP 结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP 结合位点，激活RNA 聚合酶活性，促进结构基因转录，调节蛋白结合于操纵子后促进结构基因的转录，对乳糖操纵子实行正调控，加速合成分解乳糖的三种酶。

4、协调调节：乳糖操纵子中的I 基因编码的阻遏蛋白的负调控与CAP 的正调控两种机制，互相协调、互相制约。

3、基因编码A 表达蛋白B ，B 与C 能发生反应，设计一个实验使基因A 在大肠杆菌中实现表达与检测筛选。

1. 目的片段的获得：可以采用PCR 的方法获得目的片段；然后经过电泳并回收目的片段

2. 获得目的片段的回收片段后，可以用目的基因内没有而侧翼序列中有的限制性内切酶进行消化并产生粘性末端。

3. 用同样的限制酶切割载体（载体的获得需要对包含目的载体的大肠杆菌进行培养后提取质粒。），当然前提是载体的多克隆位点中包含步骤2中使用的酶的切割位点。

4. 用连接酶将目的片段连入表达载体中，然后转化大肠杆菌

5. 筛选和繁殖重组的载体

6. 产物的鉴定。

4、色氨酸的操纵子与衰减子的调控机制。

1．色氨酸操纵子结构：色氨酸操纵子包含操纵基因O ，启动子P ，及5个结构基因A 、B 、C 、D 、E 。E 与O 之间有一段前导序列L 。色氨酸操纵子上游存在调节基因R ，编码阻遏蛋白。

2. 阻遏调控：当培养基中无色氨酸时，R 编码的阻遏蛋白不与O 结合，结构基因表达催化合成色氨酸的酶。当培养基中有大量色氨酸时，阻遏蛋白与色氨酸结合而改变构象，形成活性阻遏物，与O 结合，阻遏结构基因转录。

3. 衰减调控：Ｌ中含有4段特殊序列：序列1编码一个前导肽，前导肽的第10、11位是色氨酸；序列2-3或序列3-4可形成茎环结构。3-4茎环结构是一个转录终止子结构，称为衰减子。

4. 当色氨酸缺乏时，前导肽的翻译停滞于色氨酸密码处，序列2-3形成茎环结构，使序列3、4不能形成衰减子结构，结构基因得以完全转录；当色氨酸充足时，核糖体快速翻译前导肽，并对序列2形成约束，使序列3-4形成衰减子结构，下游的结构基因不被转录。

5、细菌氨基酸序列外显子突变表型变化并分析原因。

由于一个氨基酸对应多个密码子，就算发生变化的碱基位于处显子上，它转录而产生的mRNA 所对应的密码子虽然改变，但翻译而来的氨基酸可能不变。