小麦种子中_淀粉酶酶学性质的研究

第22卷第12期化工时刊

　　　　　　　　　　　　　　　　

2008年12月Chem i ca l I ndu s try Ti m e s Vo . l 22, No. 12

　　　　

D ec. 12.

2008

小麦种子中α-淀粉酶酶学性质的研究

吴华涛　李　η　王亚丽

(平顶山学院化学化工学院, 河南平顶山467000)

摘　要　测定了α-淀粉酶的活性并对淀粉酶的活性影响因素进行了讨论。对α-淀粉酶活性的测定是通过测定α

-淀粉酶分解淀粉所得产物———麦芽糖的量来表示酶的活性。麦芽糖能将3, 5-二硝基水杨酸还原成棕红色的氨基

化合物(540n m 处有最大吸收峰) , 其颜色深浅与麦芽糖浓度成正比, 利用分光光度法测定棕红色的氨基化合物吸光值, 从而得到产物麦芽糖的量, 来表示酶的活性。定性的分析了温度、pH 值及激活剂和抑制剂对淀粉酶活性的影响。由此可得到酶活性的最适宜的温度和pH 值, 以及抑制剂的种类和用量。关键词　淀粉酶　温度　pH 值　抑制剂　吸光度

　

Study on the Enzy mology Character of α-Amyl ase Fro m W heat Seeds

W u Huatao 　L I Yue 　W ang Yali

(School of Che m istry and Che m ical Engineering, 467000) Abstract 　The a mylase activity is measured based malt ose thr ough starch de 2

compositi on . Malt ose reduces 3, 5-dinitr osalicylic o a m ino compounds . (the max abs orbance

peak at 540n m ) . The col or of a m o malt ose’s consistence . Deter m ining the abs orbancy value of the reddish o by s pectr ophot ometry, t o get quantity of malt ose that shows the activ 2ity of a mylase . pH and activat or and inhibit or on the activity of a mylase is discussed . Not only the op ti m u m and pH value, but als o the kind and dosage of inhibit ors are attained .

α-a mylase 　te mperature 　pH value 　inhibit ors 　abs orbtance Keywords 　

　　本实验以萌发种子为材料, 提取得到了淀粉酶,

利用α-淀粉酶和β-淀粉酶对温度的差异, 分离出了α-淀粉酶, 然后测定了α-淀粉酶的活性并对淀粉酶的活性影响因素进行了讨论。不同的温度、pH 值条件下和抑制剂情况下淀粉酶对淀粉水解的程度不同通过定量的分析温度、pH 值及激活剂和抑制剂对淀粉酶活性的影响。由此得到酶活性的最适宜的温度和pH 值, 以及激活剂的种类和用量。

[1～4]

1. 1. 2　实验药品

柠檬酸、柠檬酸钠、3, 5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、麦芽糖、氯化钠、氯化钙、氯化铜, 试剂均为分析纯。

(1) 0. 1mol/L柠檬酸缓冲溶液(pH 值为5. 6) ; (2) 1%淀粉溶液:称取1. 000g 淀粉溶于100mL 0. 1mol/L柠檬酸缓冲溶液(pH 值为5. 6) 中;

(3) 3, 5-二硝基水杨酸溶液(DNS ) :准确称取3, 5-二硝基水杨酸1. 005g 将其溶于20mL 、2mol/L氢氧化钠溶液中, 加入50mL 蒸馏水后再加

1. 1　实验仪器与药品1. 1. 1　实验仪器

入30. 000g 酒石酸钾钠, 待溶解后, 稀释定容至100mL 容量瓶中, 盖紧瓶塞, 勿使二氧化碳进入;

(4) 1mg/mL的麦芽糖标准溶液;

(5) 激活剂/抑制剂:利用逐级稀释法配置80、

低速离心机、722型分光光度仪。

　

收稿日期:2008-09-09

作者简介:吴华涛(1978～) , 男, 硕士, 讲师, 主要从事有机无机复合材料的制备与性能研究　E -mail:[email protected]

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吴华涛等　小麦种子中α-淀粉酶酶学性质的研究　　　　　　　　　20081Vo l 122, No. 12　化工时刊60、40、20mmol/L的氯化钙溶液、氯化钠溶液、氯化

铜溶液。1. 2　实验步骤1. 2. 1　酶液的提取

验主要研究温度、pH 值和不同金属盐及同种金属盐

不同浓度对α-淀粉酶活性的影响和活性变化的规律, 从而找出α-淀粉酶活性的最适宜条件。

(1) pH 值对α-淀粉酶活性的影响

准备3支具塞试管和3支试管分别编号A 、B 、C 和a 、b 、c, 按照步骤1. 2. 3分别考察了加入2mL pH 值分别为3. 45、5. 6、9. 1的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液时对淀粉酶活性的影响。

(2) 温度对α-淀粉酶活性的影响

准备4支具塞试管和4支试管分别编号A 、B 、C 、D 和a 、b 、c 、d, 按照步骤1. 2. 3分别考察了0℃、室温、40℃、100℃4个不同的温度环境对淀粉酶活性的影响。

(3) 激活剂/抑制剂对α-淀粉酶活性的影响

取萌发的平顶山市焦店镇种植的小麦种子置研钵中, 加入2mL 蒸馏水, 研磨成匀浆后转入离心管中, 用蒸馏水分次将残渣洗入离心管, 在室温下静置5m in, 然后在3000r/min 转速下离心10m in, 将上

清液倒入50mL 容量瓶中加蒸馏水定容至刻度, 摇匀, 即为淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液5mL, 转入50mL 容量瓶中, 用蒸馏水定容至刻度, 摇匀, 即为淀粉酶稀释液。

1. 2. 2　麦芽糖标准曲线制作

取7支干净的具塞刻度试管, 编号, 按表1加入试剂:

表1　麦芽糖标准溶液的配置

试剂

麦芽糖标准溶液/mL麦芽糖含量/mg蒸馏水/mL

3, 5-二硝基水杨酸/mL

1002

2

3

4

5

6

7

0. 20. 40. 81. 21. 62. 00. 20. 40. 81. 21. 6. 02

氯化钙对α-淀粉酶活性的影响

准备5支具塞试管和5A 、B 、C 、D 、E 和a 、c 、d 、e, . 2. 3分别考察了当加

mL 、、80mmol/L氯化钙、氯化铜对α-淀粉酶活。

2. 01. 81. 6

. 2. 0. 4

　　摇匀, in 却, mL 1号管作为空白调零点, 在540n m 。以麦芽糖含量为横坐标, 吸光度值为纵坐标, 绘制标准曲线。

α-淀粉酶活性的测定1. 2. 3　

第一步将1mL α-淀粉酶稀释液置于70℃水浴

中15m in 以钝化β-淀粉酶; 第二步在α-淀粉酶稀释液中加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液2mL (pH 3. 45, pH

5. 6, pH

9. 1) , 再加入抑制剂/激活剂

1mL (CaCl 2、NaCl 、CuCl 2) ; 第三步在另取的试管中加

2. 1　麦芽糖标准曲线

麦芽糖能将3, 5-二硝基水杨酸还原成棕红色

[5]

的氨基化合物(以下简称氨基配合物) , 以麦芽糖的含量为横坐标, 以氨基化合物吸光度为纵坐标做麦芽糖标准溶液吸光度曲线如下图1所示。由图1可知:麦芽糖的含量与氨基化合物的吸光度成正比关系, 随着麦芽糖含量的增加, 吸光度值增大。实验中的麦芽糖由淀粉酶分解得到, 因此用麦芽糖的含量来反映淀粉酶的活性。

入1%的淀粉溶液1mL; 第四步将淀粉和淀粉酶稀释液放置在(0℃、室温、40℃、100℃) 不同的温度环境中5m in; 然后将淀粉酶稀释液倒入淀粉中, 摇匀后使其反应10m in; 第五步分别在试管中加入3, 5-二硝基水杨酸溶液2mL, 摇匀, 置于100℃水浴中煮沸5m in, 取出后流水冷却, 加蒸馏水定容至20mL; 第

六步摇匀, 在540n m 波长下比色, 记录吸光度值。1. 2. 4　影响α-淀粉酶活性的因素

酶的活性受温度、pH 值和金属盐等因素的影响, 在适宜的条件下它的活性会出现一个最大值。本实

图1　麦芽糖标准曲线

—9—

科技进展《Advance s i n Sc i e nce &Te chno l o gy 》化工时刊　20081Vo l 122, No. 12　　　　　　　　　　2. 2　pH 值对淀粉酶活性的影响

分别在pH 值为3. 45、5. 6和9. 1环境下测定淀粉酶的活性, 测得淀粉酶的活性和pH 值的关系如表

2所示。

表2　pH 值对α-淀粉酶活性的影响

pH 值

3. 450. 171

5. 60. 180

9. 10. 156

　　对实验数据进行分析, 横行可以比较3种无机盐在各自不同浓度下对淀粉酶活性的影响, 纵行可以比较3种无机盐在相同浓度下对淀粉酶活性的影响。从实验结果中可以得出:①相对于其它两种无机盐, 氯化钙对α-淀粉酶有明显的促进作用, 氯化铜对α-淀粉酶活性有明显的抑制作用, 而氯化钠对α-淀

吸光度

粉酶活性作用不明显; ②氯化钙和氯化铜对淀粉酶的促进和抑制作用随着加入无机盐的浓度增加而增强, 当浓度达到40mmol/L时促进和抑制作用最为明显, 然后随着加入无机盐浓度的增加而逐渐减弱。

　　由实验的结果可知:淀粉酶在强酸和碱性的条件下活性较低, 而在pH 5. 6的柠檬酸缓冲溶液中的活性达到最大。淀粉酶的活性随着pH 值的升高而增大, 到5. 6时达到最高点, 然后又逐渐下降, 最后可以得出α-淀粉酶最适宜的pH 值范围为5. 6左右。2. 3　温度对淀粉酶活性的影响分别在温度0℃、室温、40℃、100℃条件下, 测定α-淀粉酶的活性, 测得α-淀粉酶的活性和温度的关系如表3:

表3　温度对α-淀粉酶活性的影响

温度/℃吸光度

00. 207

　　本实验通过α-淀粉酶分解淀粉的产物(麦芽

糖) 将3、5-二硝基水杨酸还原成棕红色的氨基化合物, 并测定产物的吸光度, 来表示酶的活性pH 值、温度、5. 6的柠檬酸缓冲溶/激活剂:氯化钙对α-淀粉酶有明显的促进作用; 氯化铜对α-淀粉酶活性有明显的抑制作用; 氯化钠对α-淀粉酶活性作用不明显; 氯化钙和氯化铜对淀粉酶的促进和抑制作用在浓度达到40mmol/L时促进和抑制作用最为明显。

参考文献

[1]　吕凤霞, 陆兆新. α-淀粉酶抑制剂的研究进展[J ].食

室温

0. 219

400. 225

1000. 　　由实验的结果可知:和室温) 活性较低, 增强, , 随后随着温度的上升, , 因此可以得出淀粉酶最适宜的温度是40℃。

2. 4　抑制剂/激活剂对淀粉酶活性的影响

考察激活剂和抑制剂对淀粉酶活性影响的时候, 为排除阴离子对淀粉酶的影响, 保持阴离子相同, 选取了氯化钙、氯化钠和氯化铜3种氯化物, 主要考虑阳离子对淀粉酶活性的影响, 实验结果如表4所示。

表4　激活剂与抑制剂对α-淀粉酶活性的影响抑制剂/激活剂

CaCl 2NaCl CuCl 2

200. 1510. 1210. 100

品科学, 2002, 23(3) :152～155

[2]　贾光峰. α-淀粉酶抑制剂的制备及检测[J ].食品与药

品, 2007, 9(2) :34～36

[3]　熊正英, 王致远, 刘群等. 水、旱稻幼苗β-淀粉酶酶学

浓度/(mmol/L)

4060

吸光度

0. 1910. 1370. 075

0. 1780. 1240. 094

性质的比较研究[J ].陕西师大学报, 1994, 22(4) :67～

800. 1470. 1110. 095

71

[4]　张剑, 王素珍, 张开诚. 无机试剂对β-淀粉酶活力的

影响[J ].酿酒科技, 2008, 1:32～34

[5]　罗志刚, 杨景峰, 罗发兴. α-淀粉酶的性质及应用[J ].

食品研究与开发, 2007, 28(8) :163～166

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