动物细胞培养技术小鼠脾脏细胞

姓名：XX 系年级：2013级XX班 学号：201300XXXXXXX 动物细胞培养技术

【实验目的】

1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养；

2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用；

3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；

4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数，计算细胞存活率；

【实验原理】

（一）. 动物细胞培养技术

动物细胞培养技术是指从动物体内取出组织或细胞，在体外模拟动物体内的生理坏境，在无菌，适当温度和一定的营养条件下，使之生存，生长和繁殖，并维持其结构和功能的方法。

细胞培养的意义:⑴.具有其他生物技术无可比拟的优点；⑵.培养条件易改变和控制，便于单因子分析；⑶.便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；⑷.在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用

细胞培养的局限性：（1）.在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；

(2).观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；(3).细胞培养得到的产物少。 培养细胞的生存条件有水的质量、无菌环境，最适温度、渗透压、气体条件、最适PH、营养条件和培养基质等。

细胞培养的方法：1. 原代培养：直接从生物体内获取细胞，组织或器官，进行体外培养直至第一次传代为止。2. 传代培养：当培养的细胞增殖达到一定密度之后，则需要再做培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1:2或其他比例转移到另一个容器中的扩大培养。 原代细胞培养的方法有：单层细胞培养法和组织块培养法

细胞传代培养包括：贴附生长细胞的传代：洗细胞——酶消化——接种——观察 悬浮生长细胞的传代：A.直接传代 B.离心传代

单层培养细胞的生长过程分为：游离期，吸附期，繁殖期，维持期，衰退期 培养细胞的形态分型：A. 贴附型 B.悬浮型

（二）. 细胞死活鉴定

细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。

活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异：

① 细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只

姓名：XX 系年级：2013级XX班 学号：201300XXXXXXX 允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触时不产生质壁分离。

② 代谢上的差异：活细胞中新陈代谢作用强，细胞内的酶具有较强的活性和还原能力。基于此，发展处了以荧光素二乙酸酯（FDA）、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸收进入，活细胞内的酯酶具有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞膜内，荧光显微镜下显示有明亮的绿色或黄绿色荧光；而死亡细胞内的酯酶因失去活性，不能分解酯化的荧光素，荧光显微镜下显示不发光。另外，可用亚甲基蓝为染料鉴定酵母细胞的生死状态。亚甲基蓝是一无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。活细胞因具有较强的还原能力，能使亚甲蓝从蓝色的氧化型变成无色的还原型，故活的酵母细胞在用亚甲基蓝染色后显示无色；死亡酵母细胞或代谢缓慢的衰老酵母细胞，因无还原能力或还原能力极弱，使亚甲蓝仍处于氧化态，故呈现蓝色或淡蓝色。

（三）. 血球计数板的使用

血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网(如图3)。每个方格网共分9大格，其中间的一大格(又称为计数室)常被用作微生物的计数。计数室的刻度有两种：一种是大方格分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即每个大方格都由400个小方格组成(图4)。

每个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm，每个小方格的面积为1／400mm，盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的高度为0.1mm，所以每个计数室(大方格)的体积为0.1mm，每个小方格的体积为l／4000mm。使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格(或中方格)中微生物的数量，再换算成每毫升菌液(或每克样品)中微生物细胞的数量。 3322

姓名：XX 系年级：2013级XX班 学号：201300XXXXXXX

图1 血球计数板的构造（a、平面图；b、侧面图）

图2 血球计数板网格的分区和分格

【实验器材】

1.超净工作台、二氧化碳培养箱、离心机、眼科剪、眼科镊、培养皿、培养瓶、离心管、微量加样器、吸管、酒精灯；小鼠、培养基

2.血球计数板、盖玻片、滴管、显微镜；培养的小鼠脾脏细胞、台盼蓝、伊红

【实验步骤】

（一） 小鼠脾脏细胞的培养

1）. 取材：

取小白鼠一只，采用断头法处死，清水洗净小白鼠并浸于75%酒精中灭菌3min，取出转入超净工作台内的解剖盘内，无菌操作打开腹腔，取出脾脏，去除周围的脂肪组织，镊起脾脏用PBS液自上而下冲洗1-2次，转入无菌玻璃培养皿中，待用。

2）. 分离脾细胞：

用滴管先向上述无菌玻璃培养皿中滴入PBS液30滴，再用L形针头注射器在皿内吸取PBS

姓名：XX 系年级：2013级XX班 学号：201300XXXXXXX 液0.2ml，然后将其沿脾脏长轴方向注射入脾内，用针尖在脾脏上扎眼，并用L形针头轻刮脾脏表面挤出脾细胞，用滴管吸皿中的PBS液冲洗脾脏并吹散挂出的脾细胞，稍微倾斜并静置1-2min，吸取上述静置后的脾细胞悬液上清部分放入Eppendorf管，以3000转/分离心1-2min。

3）.培养脾细胞：

从超净工作台中区塑料培养皿一个，用“枪（1ml）”加入细胞培养液2ml，并在皿上做记号，待用。取上述离心后的Eppendorf管，在超净工作台内打开弃去上清液，用“枪（200μl）”吸取塑料皿中的培养液400ul，加入弃去上清液的Eppendorf管中，用枪头吹匀管底的脾细胞，然后吸取200ul脾细胞悬液接种于上述塑料培养皿中，混匀，然后放入37℃，5%的二氧化碳培养箱中培养。

（二）. 台盼蓝法坚定细胞的死活

1) 试剂配制：

用生理盐水配置0.4%台盼蓝染液，备用。

2) 细胞悬液制备：

将生长有贴壁型细胞的培养瓶（皿）中的培养液倒入干净试管中，向培养瓶（皿）中加入0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合消化液1-2ml，静置3-5min，待见到细胞变圆，彼此不连接为止，弃去混合消化液并将上述试管中的培养液倒回培养瓶中，用滴管轻轻吹打细胞，制成细胞悬液。

3) 染色制片：

取0.5ml细胞悬液放于干净的试管中，加1-2滴（约0.1ml）染液，混合，2min后制成临时装片，镜检。

4) 染色结果：

死细胞染成蓝色，活细胞不着色。

（三）. 血球计数板进行细胞计数

1) 染色计数：

取上述步骤二所制备0.5ml细胞悬液放于干净的试管中，加1-2滴（约0.1ml）染液，混合2-5min，滴加少许染色后的细胞悬液于放有盖片的血球计数板的斜面上，使悬液自然充满计数板小室（注意：不要使小室内有气泡产生，否则要重新滴加；在普通光镜10物镜下计数四个大格内的细胞数，压线者数上不数下，数左不数右）。

2) 根据染色结果计算活细胞率：

依据死细胞染成蓝色、活细胞不着色的原则计数死细胞数和细胞总数，以如下公式计算细胞存活率：

活细胞率（%）细胞总数-死细胞数100%细胞总数

姓名：

XX

系年级：2013级XX班 学号：201300XXXXXXX 每毫升液体中细胞的数=每个大方格中的细胞数量*10000*稀释倍数

【实验结果】

从培养箱拿出的培养基

在倒置显微镜下可以清晰的看到培养的细胞，细胞呈圆形，形状规则，聚集在一起，有立体

姓名：XX 系年级：2013级XX班 学号：201300XXXXXXX 感。

10倍物镜

姓名：XX 系年级：2013级XX班 学号：201300XXXXXXX

40

经过台盼蓝染色后，死细胞的细胞膜因为没有了选择透过性，被染成蓝色

经过活细胞染色后，活细胞的细胞膜具有选择透过性，染料不能进入细胞，所以细胞未被染成蓝色

姓名：XX 系年级：2013级XX班 学号：201300XXXXXXX

活细胞率（%）

100%细胞总数

细胞存活率=（5+3+5+6+6）/(31+29+33+31+35)*100%=15.72%

每毫升液体中细胞的数：（31+29+33+31+35）*5*10000=7950000

【实验结果分析】

1. 培养基刚刚拿出来的时候是无色的，过了一段时间后变成粉红色

2. 对于小鼠脾脏细胞的培养结果（1）.若所得的培养基呈现浑浊状态，则说明有杂菌的侵入。（2）. 若所得培养基没有明显的颜色变化，则很有可能培养基中未接入细胞或接入的细胞很少，细胞未生长繁殖。（3）。 若所得的培养基透明度高，颜色微黄则证明细胞培养成功。

3. 生长状态良好的细胞，细胞膜完整清晰，细胞质透明，颗粒状物质少细胞核区域明显。而死细胞含有空泡，颗粒状物质多，细胞透明度下降，没有立体感，核区域模糊，体积更大

4. 活细胞边缘较明显，由于细胞膜仍然具有选择透过性，染料无法通过细胞膜，所以呈现透明无色

5. 死细胞因为细胞膜已经失去选择透过性，染料进入细胞内，将细胞染色，且死细胞的边缘不明显。

6. 本次实验，我们组所得的细胞存活率较低，分析原因可能是：无菌操作时实验操作不规范，导致细胞被破坏，影响了实验结果，也有可能是因为染色时间过长，细胞膜的通透性遭到破坏，部分细胞死亡。

【实验注意事项反思】

1. 对小鼠进行消毒时，一定要严格进行，防止沾染杂菌，手也必须严格消毒。

2. 严格进行无菌操作，防止杂菌污染，影响实验结果。

3. 动物细胞培养使用的所有器皿、用具、溶液等必须经过严格消毒或除菌处理，才能进超净工作台中使用，整个实验过程都要有无菌操作的概念，操作在酒精灯附近进行，避免细胞被污染。

4. 取小鼠脾脏细胞时要小心谨慎，既不能太用力将脾扎烂，也不能扎的太轻因为得到的脾细胞太少，起初我们组扎的很轻得到的细胞很少，给老师看过之后，重新扎脾脏，得到了较多的细胞。

5. 在超净工作台进行操作时，实验刚开始时自己不留心将手臂伸进很大一部分，在老师训导之后才知道只需将手伸进很小一部分，不能将整个手臂伸进去以免造成污染，带入杂菌.

6. 注意染色的时间，时间太长可能会导致细胞膜的通透性遭到破坏，损坏细胞。

姓名：XX 系年级：2013级XX班 学号：201300XXXXXXX 7. 在用血球计数板技术时，计上不计下，计左不计右。

8. 滴加细胞悬液时，应用滴管将悬液来回吹吸使搅拌均匀，以此避免计数时因为局部浓度太高导致多个细胞连结在一起，影响结果的观察。此外，计数时要十分谨慎，因为是要在计数的结果上乘以10000，即使是很小的偏差也会导致实验结果的大不相同。计数时对于连在一起的细胞要格外注意

9. 做实验必须严格按照实验室的规定，注意无菌操作环境，按照老师的指令操作，这样才能使实验更精确的完成，取得较好的结果。此外，对于实验某些时间的精确把握也非常重要，时间的长短对于实验结果可能有较大的影响，日后一定要注意这一方面。

【作业】

1. 抑制肿瘤细胞增殖药物的筛选方法

（1）. 应用结晶紫染色测定法筛选抗肿瘤药物

结晶紫染色测定法是一种单层细胞培养的体外药物敏感性测定方法，其原理是结晶紫染色可通过细胞的特定摄生法而选择性的被细胞吸收，死亡的细胞几乎不吸收结晶紫染料，而被核吸收的结晶紫染料又可被有机溶媒提取，通过测定提取液的光密度值，就可测定活细胞的数量。近几年经过不断改进，结晶紫染色法已能适用于大量抗肿瘤药物的药敏测定，具有灵敏度高，重现性好的特点。

（2） 应用噬菌体筛选

已确证多种病毒能引起动物肿瘤，噬菌体是细菌的病毒，与肿瘤病毒相似，噬菌体的DNA也可整合到细菌染色体上，随细菌DNA复制分裂并遗传至子代细菌，不引起细菌裂解但可引起细菌部分生物学性状发生改变。有些物质可使前噬菌体DNA从溶原性细菌染色体上脱落，复制合成并释放完整的噬菌体，可使敏感的细菌感染裂解——诱导作用。有些有诱导作用的物质常同时具有抗肿瘤的作用。

（3） 细胞水平筛选抗肿瘤药物

细胞生物学、分子药理学、分子生物学、生物化学等学科的发展为药物筛选提供了新的方向。细胞水平的药物筛选模型具有材料用量少、药物作用机制比较明确和大规模筛选等优点。目前,在细胞水平上对抗肿瘤天然药物的筛选主要是采用选取几种肿瘤细胞系,以培养细胞为实验模型,用结晶紫染色测定法、四甲基噻唑蓝(MTT)法、SRB 法等检测天然药物及其提取物或单体的体外抗肿瘤作用。

温斌等在研究腹腔注射灰树花提取成分对小鼠免疫功能的影响时,采用乳酸脱氢酶法、结晶紫染色法、MTT生物活性测定法等对小鼠脾自然杀伤(NK)细胞和腹腔巨噬细胞进行检 测,结果表明灰树花乙醇沉淀物(ET2Pre)和RNA提取物显著增高了小鼠脾NK细胞杀伤活性、巨噬细胞吞噬功能及肿瘤坏死因子(TNF) 2α、白细胞介素( IL) 21的产生水平。赵春玲等采用 结晶紫染色法和MTT 比色法测定了白眉蝮蛇去整合素(rAdinbitor)对人肝癌细胞系 SMMC27721细胞向纤连蛋白(FN)黏附的影响,以及对已黏附于FN上的SMMC27721细胞的影响。 实验证明, rAdinbitor能够剂量依赖性地抑制SMMC27721细胞在FN上的黏附,促使已黏附的SMMC27721细胞脱落;并且能够剂量依赖性地抑制SMMC27721细胞的增殖并且诱导其调亡。

姓名：XX 系年级：2013级XX班 学号：201300XXXXXXX （4）端粒酶活性为作用靶点筛选抗肿瘤的药物

端粒是染色体特殊结构，起着保护染色体的完整和稳定性的作用，端粒酶是一种核糖核蛋白反转录酶，由RNA和蛋白质组成，可以以自身的RNA为模板合成端粒末端。已发现在正常的体细胞和良性肿瘤组织中端粒酶的活性是阴性，而在人体恶性肿瘤组织和人的肿瘤细胞株中都表达了很高的活性。因此，认为端粒酶与恶性肿瘤的发生发展有密切的关系，有可能成为肿瘤治疗的靶点

（5）以DNA拓扑异构酶为靶点筛选天然抗肿瘤药物

DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerases)通过DNA 链的切割、转移和再连接来改变DNA的拓扑结构。DNA拓扑异构酶在细胞代谢过程中起着极其重要的作用,如DNA复制、基因转录、DNA 重组和有丝分裂等。抗癌药物喜树碱( camp tothecin)及其衍生物的作用靶点是真核生物DNA拓扑异构酶Ⅰ,吖啶类化合物、鬼臼毒素类化合物、异黄酮类化合物、多柔比星( doxorubicin)等则作用于真核生物DNA拓扑异构酶Ⅱ。这些药物可通过DNA拓扑异构酶Ⅰ、Ⅱ引起DNA双螺旋 的一条或两条链的断裂从而导致肿瘤细胞的死亡。

李运曼等通过DNA解螺旋实验评价紫草素对拓扑异构酶Ⅰ催化活性的抑制作用。结果显示,紫草素可显著抑制拓扑异构酶Ⅰ的解螺旋活性,并且能够抑制人白血病K562细胞的增殖。汤涛等通过实验首次揭示了鸦胆子油乳能够特异性地抑制拓扑异构酶Ⅱ的活力,而对拓扑异构酶Ⅰ没有影响,对DNA也没有直接作用。这些现象揭示拓扑异构酶Ⅱ是鸦胆 子油乳细胞内作用靶点之一

(6）作用微管蛋白的天然抗肿瘤药物的筛选方法

微管(microtubule)是由αβ微管蛋白异二聚体聚合而成的管状聚合物,是真核细胞骨架的重要组成部分。微管参与许多细胞功能,包括维持细胞形态、细胞内运输、鞭毛和纤毛的运 动、染色体运动和细胞分裂等。无论是促进微管蛋白聚合、稳定已形成的微管类药物,还是以抑制微管蛋白聚合类药物都通过影响肿瘤细胞的有丝分裂过程,使其生长受到抑制。因 此,微管已成为肿瘤的临床治疗的有效靶点。 KLEIN等用紫杉醇和discodermolide (1990年从海绵动物Discodermia dissoluta中分离得到的多羟基内酯化合物)分别作用A549肺癌细胞,结果显示它们均能迅速导致有丝分裂的异常。 进一步的研究发现discodermolide和紫杉醇联合作用具有明显的协同作用。1999 年MOOBERRY等从海绵Cacospongiamycof ijiensis , Fasciospongia rimosa和Hyat tella sp. 中均发现了新型促进微管稳定化合物laulimalide 和isolaulimalide。Laulimalide可以有效促进微管蛋白的聚合,并且与紫杉醇诱导形成的微管蛋白聚合体相似,但促聚合作用低于紫杉醇。用 laulimatide处理A210细胞可导致剂量依赖性细胞微管网的重组和异常纺锤体的形成,并能诱导染色体的卷绕和多核仁的形成。

（7）应用调节细胞信号传导通路筛选方法

近年来,部分抗肿瘤药物的研发已从传统的细胞毒药物转移到针对肿瘤细胞内信号传导通路的新型抗肿瘤药物。正常细胞和肿瘤细胞在多种信号传导通路的关键组分间存在巨大 差异,因此靶向这些组分的抗肿瘤药物具有高选择性、高效、低毒的特征。目前,药物干预肿瘤细胞信号通路主要是通过环腺嘌呤核苷酸2蛋白激酶A通路、酶联受体信号通路、磷脂酰肌醇 信号通路、钙和钙调蛋白通路等几个通路实现。

SAMEL等报道,芥麦( buckwheat)提取物中一种类似于金丝桃蒽酮的物质能够抑制各种蛋白激酶的活性,抑制内皮生长因子和Ins的受体酪氨酸激酶和苏氨酸激酶的活性。李宝元 等在

姓名：XX 系年级：2013级XX班 学号：201300XXXXXXX 观察中药白龙片对人胃癌MGC8023细胞不同周期时相癌基因c2H2ras、c2myc和抑癌基因Rb、P53、P21表达的影响时,发现PKC2α基因表达抑制与c2H2ras、c2myc的表达抑制相似,表 明两者之间存在因果关系。

（8）应用肿瘤新生血管生成抑制的筛选方法

肿瘤的新生血管是实体瘤生长、浸润和转移的一个重要因素,它为肿瘤的生长提供必需的营养和氧气。在其生成过程中血管内皮生长因子(VEGF)以及酪氨酸激酶受体(VEGFR)具有 极其重要的作用。目前已发现有许多天然药物及其有效成分可以通过多种途径来抑制肿瘤新生血管的生成。

潘子民等发现人参皂苷Rg3经处理后,荷瘤SCD小鼠无腹腔积液形成,腹腔中肿块散播较少。实验组肿瘤组织中VEGFmRNA的表达量、VEGF蛋白表达量和MVD显著低于对照组,从而认为Rg3通过下调肿瘤组织中VEGFmRNA和VEGF蛋白的表达量来阻滞肿瘤血管的生成,抑制肿瘤的转移。姜晓玲等通过比较实验发现, 10μg·mL薏苡仁注射液处理后,极少有新生血管生成,血管生长也很快进入衰退期。因此认为薏苡仁注射液对肿瘤血管生成有显著抑制作用。

（9）天然药物诱导肿瘤细胞调亡的筛选

细胞调亡(apop tosis)是基因调控下的细胞主动死亡,这一过程又称程序化细胞死亡( p rogrammed cell death) 。细胞调亡伴随着细胞质浓缩,细胞核崩裂,微粒消失,细胞膜皱缩,染色质浓缩继而解体,DNA裂成180 bp的倍增片段,最后形成调亡小体。细胞增殖、分化和调亡调节系统的失常将导致细胞恶性生长分裂。研究发现,许多抗肿瘤药物均通过抑制肿瘤细胞 增殖,诱导肿瘤细胞调亡来发挥抗肿瘤作用。

贾彩云等研究表明,蟾酥灵处理过的K562细胞其生长受到明显抑制,形态学呈现出典型的调亡特征性改变,即核染色质凝集、碎裂、延核周边分布,胞膜内陷将变性的细胞内容物包裹成调亡小体,形成DNA电泳的梯状带。因此蟾酥灵能有效诱导白血病K562细胞调亡。陈洁等通过实验证明竹红菌甲素(hypocrellin A, HA)能够诱导人黑色素瘤(A23752S2)细胞产生调亡,并诱导细胞周期停滞在S期。还能使细胞周期蛋白CyclinB1的mRNA表达增加。

（10）天然药物诱导细胞分化的筛选

恶性肿瘤细胞在形态、功能等方面都类似于未分化的胚胎细胞。诱导分化治疗是指通过药物诱导,使肿瘤细胞向正常细胞转化,同时对正常细胞无杀伤作用,并且很少有骨髓抑制等 不良反应。诱导肿瘤细胞分化及逆转是当前肿瘤分子生物学中一个重要的研究领域。 钱军等在研究榄香烯乳对体外培养人肺癌细胞株超微结构的影响时发现,实验组癌细胞给药后出现表面微绒毛减少,细胞核和细胞质比例下降,核周边光滑,切迹浅,核仁常为单个,常染色质减少,异染色质增多等现象;而阳性对照组癌细胞除破碎坏死外,仍显示较高的恶性行为。上述表现提示榄香烯乳在30μg·mL的浓度下对体外肺癌细胞具有一定的诱导作用。CHEN等报道茯苓中的多糖片段可使66. 6%人淋巴瘤U937细胞和49. 4%人早幼粒白血病HL260细胞诱导分化成为成熟的单核细胞和巨噬细胞,使其表现出正常的生理功能并且表达标志性表面抗原CD11b、CD68和CD14 ,同时又检测到IFN2γ和TNF2α水平升高。 （9）结束语 随着分子生物学和分子肿瘤学的发展,人们对肿瘤细胞恶化过程中许多新靶点有了进一步的了解,并且针对这些靶点研究和开发了许多新的天然抗肿瘤药物。近年来,许多天然抗 肿瘤药物已经开始采用较原来更加理想的药物筛选系统,而且针对作用机制的药物筛选和药物设计在一定程度上得到了发展。由于肿瘤本身是一种多基因的疾病,目前肿瘤的治疗仍是 一个难题,因此尚需要科研工作者不断地努力来发现和设计出更加有效低毒、高选择性的抗肿瘤

姓名：XX 系年级：2013级XX班 学号：201300XXXXXXX 药物。

2. 诱导肿瘤细胞发生凋亡的药物筛选方法：

（1） 可以利用流式细胞仪测定细胞光散射可对凋亡细胞进行分析，凋亡早期细胞因体积减小，胞浆及染色质固缩，FSC变小，SSC增大，凋亡晚期细胞FSC，SSC均变小；用流式细胞仪也可以根据DNA含量不同，从细胞群体中鉴别出凋亡细胞；另外，细胞凋亡受基因调控，有赖于某些蛋白质的合成，用流式细胞仪可同时检测出凋亡细胞的FSC/SSC及DNA/蛋白质，进行多参数分析以研究不同的凋亡诱导作用机制。

（2） 化疗是肿瘤治疗的一种重要方法，新的抗肿瘤药物也不断地涌现。国内在上个世纪90年代上市的抗癌药物中化学合成药米托蒽醌、羟基脲和顺铂等少数几种抗癌药物，通过与DNA分子结合抑制核酸合成引起细胞死亡，这类药物称之为细胞周期非特异性药物。本研究选用米托蒽醌、顺铂、羟基喜树碱、 高三尖杉酯碱诱导Jurkat细胞凋亡，并通过Annexin V /PI法检测细胞凋亡及细胞死亡比例，分析不同作用时间以及不同药物浓度对Jurkat细胞凋亡的影响。材料和方法

材料

Jurkat细胞系由本实验室保存。顺铂（CDDP）为齐鲁制药有限公司产品、羟基喜树碱（HCPT）为黄石飞云制药厂产品、 高三尖杉酯碱（HHT）为杭州民生药业公司产品、米托蒽醌（MIT）为浙江瑞新药业公司产品；RPMI 1640为Invitrgen产品；Annexin V FITC/PI试剂盒购自晶美生物公司；贝克曼流式细胞分析仪 Elite EXP。

诱导Jurkat细胞凋亡

Jurkat细胞在5% CO2孵箱培养至对数生长期，镜下计数为1×106/ml，加入24孔板，每孔1 ml细胞悬液。用无血清细胞悬液将顺铂、 羟基喜树碱、高三尖杉酯碱和米托蒽醌药物配制成1 mg/ml溶液；每组药物分别设4个浓度：12.5、25、50、100 μg/ml；分别加入24孔培养板，作3个复孔。置于5％ CO2孵箱培养。

Annexin V/PI流式双参数分析［1-3］

分别于加入药物作用2、4和8小时，吸取培养细胞悬液，用4℃预冷的PBS洗细胞2次，用250 μl结合缓冲液重悬细胞，使其浓度为1×106/ml；取100 μl细胞悬液，加5 μlAnnexin V/FITC和10 μl 的碘化丙锭；混匀后室温避光孵育15分钟；用PBS洗涤2次，进行流式细胞仪（FACS）分析。Annexin V-FITC/PI双参数进行调试，以此条件进行细胞凋亡和细胞坏死率检测。图1-5横坐标表示荧光强度，纵坐标表示细胞数，图中两个峰中的左边峰表示阴性峰，右峰表示凋亡峰，右峰曲线下面积越大凋亡就越多。根据所测数据计算细胞凋亡率和继发性坏死率。

统计学分析

姓名：XX 系年级：2013级XX班 学号：201300XXXXXXX 各组细胞凋亡率均取3个样本的均值，以X±SD表示，多个均数的两两比较采用《中国医学百科全书·医学统计学》统计软件包 PEMS 3.1软件进行检验。 1细胞的冻存

目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤 主要操作步骤为：

（1）选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min，10分钟)。

（2）去上清液，加入含20%小牛血清的完全培养基，于4℃预冷15分钟后，逐滴加入已无菌的DMSO或甘油，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，细胞浓度为3×106～1×107/mL之间。

（3）将上述细胞分装于安瓿或专用冷冻塑料管中，安瓿装1～1.5mL在火焰喷灯上封口，封口处要完全封闭，圆滑无勾。冷冻管要将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记（日期、细胞种类及代次、冻存支数）。

（4）将装好细胞的安瓿或冻存管装入沙布袋内；置于液氮容器颈口处存放过夜，次日转入液氮中。采用控制降温速度的方法也可采用下列步骤：先将安瓿置入4℃冰箱中2～3小时，再移至冰箱冷冻室内3～4小时（此步可省略），再吊入液氮容器颈气态部分存放2小时，最后沉入液氮中。

细胞冻存在液氮中可以长期保存，但为妥善起见，冻存半年后，最好取出一只安瓿细胞复苏培养，观察生长情况，然后再继续冻存。

2细胞的复苏

姓名：XX 系年级：2013级XX班 学号：201300XXXXXXX 主要操作步骤是：

（1）佩戴眼镜和手套，从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。

（2）迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化，然后在无菌下取出细胞。

（3）在1000r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12～24小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。

细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤

3.细胞的运输

当前培养细胞既在国内进行寄赠、交换和购买，也在国际交流，为此要有装运细胞的方法。装运方法有两种，一种是冷冻储存运输法，包括干冰运输和液氮运输，需要用特殊容器，保存效果较好，但较麻烦，且液氮和干冰蒸发都较快，不适于长时间运行，需要空运。另一种为充液法，比较简便易行。具体方法如下：

① 选生长状态良好的细胞，待接近或刚刚连接成片后，去掉培养液，充满新培养液，液量要达到培养瓶颈部，拧紧螺帽或塞以胶塞，保留微量空气。空气留量过多，运输时大气泡来回流动对细胞有干扰作用。

② 妥善包装、运输。一般在4～5天内到达目的地，对细胞活力无多大影响，时间过长，则细胞活力下降。

③ 到达目的地后，倒出大部分培养液，保留维持细胞生长所需的液量，置37℃培养，次日传代