T―RFLP分析不同森林类型土壤真菌组成及分布

　　摘要：在长白山森林生态系统定位站，利用T-RFLP技术研究了6种不同森林类型土壤真菌组成及其分布特征。结果表明，6种不同森林类型土壤真菌多样性指数以白桦林中后期最高，过熟阔叶红松林次之，杨桦成熟林最低。不同森林类型的真菌群落相似度也很低，其数量、类型及分布均存在着差异。 　　关键词：土壤；真菌；DNA提取；ITS-PCR；T-RFLP 　　中图分类号：Q938.1+1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）06-1443-04 　　土壤微生物是森林生态系统中最重要的组分，在凋落物分解、腐殖质合成以及养分循环等过程中起着十分重要的作用。其种类和组成不仅直接影响土壤的生物化学循环，而且是土壤生物活性的具体体现，并在森林生态系统的物质循环和能量流动中扮演着重要角色[1-3]。不同土壤分布着不同的土壤微生物，而不同的微生物多样性又影响土壤功能的多样性[4]。土壤微生物的组成和分布可以在深层次上揭示森林生态系统的物质循环和能量流动。目前测定土壤微生物多样性的方法主要有稀释平板法、磷脂脂肪酸分析（PFLA）法、Biolog微平板分析法及分子生物学方法等[5]。随着分子生物学技术在土壤微生物研究中的不断发展，土壤微生物多样性的研究有了新的突破。核糖体ITS区为非编码区，受到的选择压力较小，进化速度快。因此该区段能够提供比较丰富的变异位点和信息位点，目前已经用于种间、亚种和种群水平上的遗传多样性研究[6]。自从Innis等[7]1990年首先设计ITS引物对真菌核内核糖体RNA基因进行扩增以来，ITS序列分析技术在真菌分类、鉴定的研究中应用越来越广泛。 　　该研究利用分子生物学技术对长白山自然保护区不同森林类型的土壤真菌群落组成进行分析，比较不同植被类型与土壤真菌之间的关系及变化趋势，以期加深对土壤真菌变化过程和机制的认识，为长白山区域天然林保护和生态建设提供基础资料。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　土壤样品于2010年10月采自长白山自然保护区（表1）。按不同林型采用对角线型混合取样法采集表层的土壤，采集深度为0～5 cm，用塑料袋封装带回。-80 ℃下密封保存。 　　1.2 试剂与仪器 　　Taq DNA 聚合酶、dNTPs、限制性内切酶Hinf Ⅰ购自宝生物工程（大连）有限公司；土壤真菌基因组提取试剂盒购自MoBio Laboratories公司；DNA纯化试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。Gene-9700型PCR扩增仪、上海卢湘仪台式离心机、BIO-RAD凝胶成像系统等。 　　1.3 方法 　　1.3.1 土壤样品DNA的提取与检测 土壤样品DNA的提取参照MoBio土壤真菌提取试剂盒的方法。 　　1.3.2 ITS-PCR扩增及产物纯化 用于ITS片段扩增的引物采用真菌ITS区通用引物ITS1-F和ITS4，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，具体序列如下：ITS1-F（5′→3′）：CTTGGTCATTTAGAGG 　　AAGTAA；ITS4（5′→3′）：TCCTCCGCTTATTGATAGC。 　　ITS扩增反应体系为：5 μL 10×PCR Buffer（50 mmol/L KCl；10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3；1.5 mmol/L MgCl2）、2 μL DNA模板、ITS1-F和ITS4（10 μmol/L）各2.5 μL、4 μL dNTPs（2.5 mmol/L）、0.5 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL），加ddH2O至50 μL。反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性60 s，52 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，共35个循环；最后72 ℃延伸8 min。取5 μL ITS-PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像处理系统观察拍照。 　　1.3.3 ITS-PCR产物的纯化 采用DNA纯化试剂盒，按照说明书进行PCR产物纯化。 　　1.3.4 ITS-PCR产物的限制性酶切分析 ITS-PCR产物的T-RFLP分析反应体系为30 μL：含10 μL ITS-PCR产物、2 μL Hinf I（10 U/μL）、3 μL 10× Buffer、加ddH2O至30 μL。置于37 ℃水浴中酶切反应4 h，然后65 ℃作用20 min终止反应。将酶切产物送至上海美吉生物医药有限公司测序。 　　1.3.5 数据分析 每个T-RFLP的丰度百分比（Ap，%）按照公式Ap=ni/N×100%计算， 其中ni代表每个可分辨的T-RFLP的峰面积， N代表所有T-RFLP峰面积的总和。种群多样性指数[8]用BIO-DAP软件计算。依据公式Cs=2N（A+B）/（NA+NB）计算样品之间Sorenson[9，10]的相似系数， 其中NA+B指两样品共有的条带数目，NA、NB指两样品各自包含的条带数目。 　　2 结果与分析 　　2.1 不同森林类型土壤真菌T-RFLP分析结果 　　利用限制性内切酶Hinf Ⅰ对6种不同森林类型土壤真菌ITS区进行酶切，T-RFLP分析结果见图1。从图1可以看出，酶切谱带清晰，RFLPs比较明显，酶切片段在100～600 bp之间，不同森林类型真菌群落存在明显差异。 　　2.2 不同森林类型土壤真菌多样性 　　不同森林类型土壤真菌香农多样性指数、均匀度见表2。由表2可知，1号样点的香农多样性指数最高，3号样点的最低；1、2、3、5号样点的均匀度高，4号样点的均匀度最低。一般而言，多样性越高群落稳定性大，稳定性的大小反映了多样性的大小。植物根系可为微生物栖息提供很好的场所，植被覆盖使得土壤湿度更适合于群落的发展，微生物群落的发展反过来又有利于植物群落的发展。 　　2.3 不同森林类型土壤真菌相似性 　　从不同森林类型土壤真菌群落结构相似性系数分析结果见表3。由于森林类型的不同，土壤的真菌群落也有较大差异，群落功能也有较大差异，甚至森林类型接近的土壤，真菌的相似性也比较低，森林土壤真菌的空间差异性很大。 　　3 小结与讨论 　　3.1 土壤样品DNA的提取与纯化 　　如何获得高质量的土壤样品总DNA是分子生物学技术的基础和关键[11]，只有获得高质量的土壤样品总DNA才能保证后续PCR扩增的准确、可靠。土样中主要污染物为多糖、腐殖酸和酚类化合物，其中腐殖酸的理化性质与核酸相似，因此在DNA提取过程中很难完全去除，而腐殖酸等杂质会影响后续的PCR反应[12]。 　　3.2 土壤真菌多样性指数 　　香农多样性指数是一种评价不同土壤的微生物群落多样性十分有效的方法，香农多样性指数越高表明微生物群落多样性越大，它由种类的丰富度及种类的均匀度两部分组成[13，14]。在不同类型的森林土壤中，真菌的群落香农多样性指数呈现出较大的差异性和复杂性，这可能是由于天然森林中的真菌的空间异质性高所致。白桦林中后期和过熟阔叶红松林，光照充足， 干扰少， 土壤结构比较稳定， 枯枝落叶积累多， 水分涵养好， 适合微生物生长， 所以土壤真菌的类群多，土壤相对较肥沃。从整体上来看， 白桦林中后期和阔叶红松林土壤质量高， 微生物种类多，土壤结构稳定，有利于植物的生长。 　　该研究对不同森林类型土壤真菌群落的变化规律进行研究， 探讨了真菌群落的演替规律， 但对于真菌群落的变化规律以及微生物与植物之间如何互作还需进一步研究。同时对于其他样点的森林类型土壤微生物群落的变化规律如何还有待进一步揭示。 　　参考文献： 　　[1] 王锐萍，刘 强，彭少麟，等.尖峰岭不同树种枯落物分解过程中微生物动态[J].浙江林学院学报，2006，23（3）：255-258. 　　[2] 李延茂，胡江春，汪思龙，等.森林生态系统中土壤微生物的作用与应用[J].应用生态学报，2004，15（10）：1943-1946. 　　[3] 赵 萌，方 晰，田大伦.第2代杉木人工林地土壤微生物数量与土壤因子的关系[J].林业科学，2007，43（6）：7-12. 　　[4] 臧 蕾，张宗舟，蔺海明.白水江自然保护区土壤霉菌数量及物种多样性分析[J].甘肃农业大学学报，2006，41（5）：100-104. 　　[5] 娄 鑫，崔晓阳.温带森林次生演替过程中土壤微生物多样性研究[J].土壤通报，2011，42（3）：557-561. 　　[6] 戴 伟，郭永军，王晓梅，等. 3个地理居群泥蚶核糖体DNA ITS区的RFLP分析[J].安徽农业科学，2010，38（10）：4990-4991. 　　[7] INNIS M A， GELFAND D H， SNINSKY J J，et al. PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications[M]. New York： Academic Press，1990.315-322. 　　[8] 姚 斌，钱晓刚，于成志，等.土壤微生物多样性的表征方法[J].贵州农业科学，2005，33（3）：91-92. 　　[9] HORSWELL J， CORDINER S J， MAAS E W， et al. Forensic comparison of soils by bacterial community DNA profiling[J]. Journal of Forensic Science，2002，47（2）：350-353. 　　[10] 葛芸英，陈 松，孙 辉，等.土壤细菌群体多样性的T-RFLP分析应用探讨[J].中国法医学杂志，2008，23（2）：104-106. 　　[11] RICHARD A H， QIU X Y， WU L Y，et al. Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments[J]. Applied and Environmental Microbiology，2001，67（10）：4495-4503. 　　[12] TIMOTHY M S， IAN L P， CHARLES P G. Removal of PCR inhibiting substances in sewage sludge amended soil[J]. Water Science and Technology，1995，31（5）：311-315. 　　[13] HARCH， B D， CORRELL R L， MEECH W， et al. Using the Gini coefficient with BIOLOG substrate utilization data to provide an alternative quantitative measure for comparing bacterial soil communities[J]. Journal of Microbiological Methods，1997，30（1）：91-101. 　　[14] STADDON E J， DUCHESNE L C， TREVORS J T. Microbial diversity and community structure of post disturbance forest soils as determined by sole-carbon source utilization patterns [J]. Microbial Ecology，1997，34（2）：125-130.