纤维素酶活力测定方法_康纪婷
河北农业科学,2010,14(4):151-153JournalofHebeiAgriculturalSciences
编辑 李布青
纤维素酶活力测定方法
康纪婷,吴 翔,甘炳成,张小平
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(1.四川农业大学资源与环境学院,四川雅安 625014;2.四川省农业科学院土肥所微生物实验室,四川成都 610000)
摘要:关于纤维素酶活力测定方法很多,至今也没有统一。国内许多单位根据各自的实验目的采用了不同的测定方法,并据各自的经验对其做了部分修改,使得测定方法更加多样化。综述了纤维素酶活力的测定方法及其存在的问题,旨为不同目的纤维素酶活力测定方法的选择提供借鉴。关键词:纤维素酶;酶活力;测定方法
中图分类号:TQ920.1 文献标识码:A 文章编号:1008-1631(2010)04-0151-03DeterminationMethodsofCellulaseActivity
KANGJi-ting,WUXiang,GANBing-cheng,ZHANGXiao-ping
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(1.CollegeofResources&Environment,SichuanAgriculturalUniversity,Yaan 625014,China;2.MicrobiologyLaboratoryofSoilandFertilizerInstitute,SichuanAcademyofAgriculturalSciences,Chengdu 610000,China)Abstract:Thereweremanydeterminationmethodsofcellulasactivity,whichwerenounifiednow.DifferentdeterminationmethodswereusedbasedondifferentexperimentpurposesinmanyinstitutionsinChina,andsomeofthemweremodifiedaccordingtoexperience.Thedeterminationmethodsofcelluloseactivityandproblemsweresummarized,whichwouldprovidereferencesfortheselectionofmethodsbasedondifferentexperimentpurposes.Keywords:Cellulase;Activity;Determinationmethod
素酶是起协同作用的多组分酶系,可以促进纤维素的分解。纤维素酶主要来自于真菌和细菌。按照其作用机理,可分为内切葡聚糖苷酶、外切葡聚糖苷酶和β-葡萄糖苷酶3类
[5]
1 纤维素和纤维素酶
1.1 纤维素
纤维素是植物细胞的主要成分,是地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物,也是生物界最重要的碳源之一
[1]
。
1.2.1 内切葡聚糖苷酶 又称Cx酶、CMC酶、endo-1,4-β-D-glucanase(来自真菌的简称EG,来自细菌的简称Cne)。Cx酶作用于纤维素内部的无定型区域,随机水解1,4-β-葡萄糖苷键,将长链纤维素分子切短,产生大量非还原性末端的小分子纤维素。
1.2.2 外切葡聚糖苷酶 又称C1酶、exo-1,4-β-D-glu-canase(来自真菌的简称CBH,来自细菌的简称Cex)。C1酶作用于纤维素线状分子的末端,水解1,4-β-D-葡萄糖苷键,每次切下1个纤维二糖分子,又称纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase)。
1.2.3 β-葡萄糖苷酶 又称纤维二糖酶、β-1,4-gluco-sidase(简称BG)。这类酶将纤维二糖或可溶性纤维糊精水解成葡萄糖分子。
纤维素酶除了将纤维素水解成葡萄糖等有效成分外,还能通过提高植物细胞壁的通透性,来提高植物细胞内含物的提取率,所以,纤维素酶广泛应用于以植物为原料的工农业生产中。
。纤维素分子是由许多吡喃型的D-葡萄糖残
基以1,4-β-葡萄糖苷键相联结而形成的多糖,是1种高分子化合物。
纤维素之间存在着氢键,通过氢键的缔合作用,纤维素链形成了纤维素束。在这个纤维素的连续结构中,分子密度大的地方平行排列,定向良好,形成纤维素的结晶性区域。而随着致密度的减小,结合程度减弱,分子间空隙增大,定向变差,形成了纤维素的无定型区域。在纤维素中除了纤维素链之间存在着氢键,在分子内也存在着氢键。氢键是1种高能键,这种键的存在给纤维素的水解带来了很大困难被利用的根本原因。1.2 纤维素酶
纤维素酶(Cellulase)是使纤维素降解生成葡萄糖的1组酶的总称,包含C1酶、CX酶和β2葡萄糖苷酶,这3种酶协同作用可将纤维素降解为葡萄糖
收稿日期:2010-03-24
基金项目:四川省财政育种工程青年基金项目(2008VJJ-018)作者简介:康纪婷(1984-),女,四川成都人,硕士在读,从事环境
微生物研究。E-mail:[email protected]。
通讯作者:张小平。
[3,4]
[2]
,也是造成纤维素难以
。纤维
2 纤维素酶活力的测定方法
2.1 纤维素酶活力测定的一般方法
[8]
国内外曾报道过的纤维素酶活力测定方法有很多,现将其中具有代表性、应用较为广泛的方法简介如下:
2.1.1 棉线切断法 采用恒温振荡器,将细棉线的一端浸入含有酶液的试管中,在最佳温度和pH值条件下微振荡。测定细棉线切断所需的时间,求得酶活力。2.1.2 滤纸崩溃法 采用恒温振荡器,以一定规则的滤纸片为底物,加入装有酶液的试管中,在最佳温度和pH值条件下微振荡。测定滤纸完全崩溃所需要的时间,求得酶活力。由于滤纸崩溃的时间较难确定,所以误差很大。
在此基础上又发展了滤纸失重法。即在最佳温度和pH值条件下,让滤纸片和酶液反应一段较长的时间(通常需要2周以上),然后将滤纸片水洗烘干,测定滤纸片反应前后的质量变化,计算出滤纸的失重率,从而推算出酶活力。
2.1.3 羧甲基纤维素钠为底物的粘度减少和还原糖增加的测定法
[9]
系
[12]
。可用比色法测定。
2.2.1 内切纤维素酶活(CMCaseactivity) 以无定形纤维素为底物,以还原糖的生成量表征CMC酶活力。如Amano法采用了羧甲基纤维素钠,国际药品联合会提供的测定方法采用了羟乙基纤维素磷酸膨胀纤维素
[15]
[14]
,Merz法采用了
。
2.2.2 外切纤维素酶活(PNPCase) 以对硝基苯纤维二糖苷(pNPC)为底物,以对硝基苯的生成量表示酶活力
[15]
。也可以微晶纤维素(Avicel)为底物水解得
到的还原糖量表示酶活力,称为Avicelase活力。但内切葡聚糖苷酶对Avicel水解程度也高,对原酶液而言,它反映的是纤维素酶各组分协同作用的结果;对单一组分来说,它反映外切葡聚糖苷酶的活力。
2.2.3 纤维二糖酶活 以纤维二糖为底物,测定酶解反应后葡萄糖生成量,表示酶活力。由于葡萄糖和纤维二糖都具有还原性,定糖方法难以区分。常用人工合成的糖苷化合物,如对硝基酚-β-葡萄糖苷(PNPG)、水杨素为底物,测定生成的对硝基酚或葡萄糖。
2.2.4 滤纸酶活 1984年国际理论和应用化学协会的发酵委员会确定滤纸酶活法为标准方法。滤纸为天然结晶类纤维素,以其为底物经纤维素酶水解后生成的还原糖量,表示纤维素酶系总的糖化能力,得到了广泛的应用。然而由于滤纸结构的不均一性,方法繁琐,导致测定结果误差较大,难以精确定量。
2.2.5 差重法 以砂芯坩埚为酶解反应器,避免了水解液转移过程中产生的偏差,同时也不必在酶解液中添加反映终止剂,直接过滤洗涤使反应终止。节约了试剂,避免了试剂干扰。测出的酶水解率比常规的以还原糖量测出的酶水解率要高。试验操作简便易行,重现性好,适合于酶解样品较少的试验研究
[16]
测定CMC粘度降低的方法分为旋转粘
度计法和工研法。旋转粘度计法采用旋转粘度计,测定底物3min和18min的粘度,利用公式推算出酶活力。工研法采用奥氏粘度计,测定底物粘度减至1/2时所需的时间,以l0min使底物粘度降低1/2的酶活作为1个活力单位。
还原糖增加法是通过底物与酶液在特定条件下反应,用葡萄糖含量的增加来计算酶活力。目前普遍采用该方法来测定纤维素酶的酶活。2.1.4 分光光度计法
[10]
酶促反应中生成的糖类物质
与显色剂发生显色反应,用分光光度计在500nm左右的波长处测定吸光度,换算成还原糖量,计算出酶活力。分光光度计法大大缩短了酶活力测定所需要的时间,而且有较高的精确度,是目前应用最广泛的方法。国内许多科研机构根据各自的实验目的,采用了不同的底物和显色剂,因而由此衍生出的方法更加多样化。2.1.5 快速测定纤维素酶CMC液化活力法
[11]
以铬矾。
为交联剂,使羧甲基纤维素交联产生粘度较大的凝胶,通过观测凝胶液化的程度和快慢确定酶活力的大小。此法简单方便,目测即可,用于菌种初筛十分方便。2.1.6 平板法 在菌种选育工作中,都希望在平板上对纤维素酶产生菌进行筛选,这样可以大大提高工作效率。磷酸膨胀纤维素易于制成均匀的双层平板,纤维素酶在其上能够形成清晰的透明圈,此法广泛应用于产纤维素酶的真菌选育中。
2.1.7 巴鲁阿-斯温(Barnchandswain)测定法 以水杨酸为底物,根据被水解出的水杨醇和β-D-葡萄糖量,用比色法测定β-葡萄糖苷酶活力。此法普遍应用于β-葡萄糖苷酶活力的测定。
2.2 纤维素酶活力测定的主要方法
近年来国内通用的和新提出的一些纤维素酶活力测定方法,大多利用DNS法原理,即纤维素经纤维素酶水解后生成的还原糖能将3,5-二硝基水杨酸(DNS)中的硝基还原为氨基,生成棕红色的氨基化合物。在一定的浓度范围内,还原糖的量与棕红色的深浅呈正比关
3 纤维素酶活力测定存在的问题与展望
3.1 纤维素酶活力测定存在的问题
纤维素酶活力的测定方法有很多,至今也没有统一,而且测定中存在着很多困难,给纤维素酶的开发利用带来了很多不利影响。其主要问题有
[6]
:(1)根据
酶反应动力学通则,酶活力的测定是在底物过量存在的条件下,测定酶促反应的初速度来表示酶活力。但纤维素酶是多组分酶系,各组分间有协同作用,形成了多种终产物,涉及多种反馈控制机理。测初速度的原则也就难以反映底物特性,使得确定酶活力测定的标准化方法非常困难。(2)纤维素是不溶于水的高聚糖,纤维素酶与其反应是在固体界面上进行的,其酶解反应速率受底物对酶蛋白的吸附速率和产物扩散速率的影响。不同来源的同一类纤维素酶,其组成和各组成成分的比例也有较大的差异,使得测定结果存在较大的不准确性。(3)由于纤维素酶结构的复杂性,酶组分生化特性和酶学作用的影响,以及异构酶的存在,在不同试验条件下得到
的各组分的纯度不一致,导致人们对纤维素酶系各组分的分类及性质没有完全统一的看法,对酶的理解和命名也不完全一致
[7]
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2002,
。
3.2 纤维素酶活力测定方法的选择
纤维素酶活力测定方法的多样化,使得在选择具体方法时,必须考虑测定的具体目的。例如,在生化研究中,主要测定纤维素酶单一组分的酶活力,所以必须选择特定的底物以及缓冲液。在微生物试验中,主要是筛选产酶菌株和突变菌株,由于测定数量较大,因而可以采用较简单的方法,而不需要很高的准确性。在工业生产实践中,主要是利用纤维素酶将纤维素转化为葡萄糖用于工业发酵生产,此时葡萄糖的产量是最重要的指标,因此,可以选择高纯度的底物如滤纸、脱脂棉等。但同时也需要考虑工业生产的巨大工作量,可采用一些较为简便的方法。3.3 展望
纤维素是我国年产量很大的可再生资源,能成功地开发利用这一资源,对可持续发展有非常重要的意义。在对环境生态问题高度重视的当今社会,如何成功利用纤维素酶将纤维素降解,是研究者研究的主要目标。而对纤维素酶活力的测定方法研究是整个研究的重点。能找到1种简单、快速、准确的酶活力测定方法,将会为整个纤维素酶的研究打开1扇大门,使纤维素酶的研究进入1个新的空间。参考文献:
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