嘌呤衍生物的合成及其对CD38的抑制作用研究_李娜
药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2015, 50 (8): 1013−1020 · 1013 ·
嘌呤衍生物的合成及其对CD38的抑制作用研究
李 娜1, 朱文杰2, 薛喜文1, 赵永娟2, 李汉璋2, 张亮仁1*, 张礼和1
(1. 北京大学药学院, 天然药物及仿生药物国家重点实验室, 北京 100191; 2. 北京大学深圳研究生院化学生物学与生物技术学院, 广东 深圳 518055)
摘要: CD38是一种多功能的跨膜糖蛋白, 其酶催化活性与哺乳动物体内多种疾病的发生和发展密切相关。本文以CD38抑制剂H2为先导结构, 将其吲哚母环替换为嘌呤环, 设计合成了33个嘌呤衍生物, 活性评价结果显示化合物20、38表现出与先导结构相当的抗CD38 NADase活性。研究结果揭示嘌呤6位小取代基对化合物活性的影响不大, 嘌呤2-位是否有苯丙酰基取代对化合物与CD38的结合模式有重要影响。
关键词: CD38; 嘌呤类衍生物; 合成; 抑制剂
中图分类号: R916 文献标识码: A 文章编号: 0513-4870 (2015) 08-1013-08
The synthesis of purine derivatives and its inhibitory activity on CD38 NADase
LI Na1, ZHU Wen-jie2, XUE Xi-wen1, ZHAO Yong-juan2, LEE Hon-cheung2,
ZHANG Liang-ren1*, ZHANG Li-he1
(1. State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, School of Pharmaceutical Sciences, Peking University, Beijing 100191, China; 2. School of Chemical Biology and Biotechnology, Shenzhen Graduate School, Peking
University, Shenzhen 518055, China)
Abstract : CD38 is a multifunctional enzyme expressed in a variety of mammalian tissues, its catalytic activity was involved in a wide range of physiological processes. Based on the reported inhibitor of human CD38 NADase, 33 purine derivatives were designed and synthesized. The biological activity assay showed that compounds 20 and 38 exhibited almost the same extent of inhibitory activities on human CD38 NADase as the
lead compound H2. The results also revealed that small substituents at C-6 of purine ring gave no obvious effect on inhibitory activity, but phenylpropionyl moiety at N-2 could affect the binding mode of the compound with CD38. This study provides a reliable basis for future rational design of inhibitors for CD38.
Key words: CD38; purine derivatives; synthesis; inhibitor
CD38最早是由Reinherz 等[1]在20世纪80年代很多重要功能也陆续被发现, 如酶催化功能[3]、受体功能[4]、活化细胞及细胞因子[5]、参与细胞间黏附作用[6]等, CD38的酶催化功能与其他功能之间相互影响, 协同作用。CD38酶催化底物环腺苷二磷酸核糖 (cADPR)、腺苷二磷酸核糖 (ADPR) 以及烟酸腺苷
早期用单克隆抗体的方法鉴定出来, 起初被认为是一种活化抗原, 主要用于白细胞分类及表型鉴定。随着对CD38研究的深入, 人们发现CD38是一种Ⅱ型或Ⅲ型跨膜糖蛋白[2], 并且分布十分广泛。CD38的
可以与不同的受体或通道结 二核苷磷酸 (NAADP)
收稿日期: 2015-04-15; 修回日期: 2015-05-11. 合, 从而参与调控细胞中的钙信号[7], 因此CD38与很
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(91213302,81172917, 31301156). *通讯作者 Tel: 86-10-82802567, Fax: 86-10-82802724,
E-mail: [email protected]
多疾病的发生、发展有着重要关联[8]。例如, 在慢性淋巴细胞白血病中, 通过抑制CD38的酶催化活性可
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以显著抑制癌细胞的迁移和扩散; CD38可通过其induced Ca2+-release), 增加细胞内钙浓度, 促使催产素的分泌[10]。CD38作为一个潜在的药物靶点, 发展高效特异的CD38抑制剂对于研究CD38的生理功能具有重要意义。
目前CD38酶抑制剂主要包括共价结合型和非好, 但是化学稳定性、细胞膜透性和耐酶水解能力较差, 而非共价结合型抑制剂具有稳定性高, 细胞膜通抑制剂主要有黄酮类化合物 (1) [11]、喹啉酮类衍生物 (2) [12]等结构类型 (图1) 。
吲哚衍生物H2 (3) 是本课题组曾报道的活性较好的CD38抑制剂
[13]
[9]
更换可能对化合物与CD38的作用模式会有影响, 本效关系并期望得到活性好的化合物 (图2) 。
化合物4~34的合成见合成路线1。化合物4~31的合成参照文献[16], 通过对嘌呤环6位改造得到化合物32 (6-F) 和化合物33、34 (6-OH)。
化合物35~40路线有所不同, 其合成路线参照
酶催化活性诱导钙内流和释放, 激活CICR (Ca2+- 文还设计了一些嘌呤2-位无取代的化合物, 以考察构
共价结合型抑制剂。共价结合型抑制剂一般活性较 文献[17], 见合成路线2。
结果与讨论
从6-氯鸟嘌呤出发, 参照文献[16, 17]报道方法, 合成了各种嘌呤衍生物。6位催化氢化时不同的压力条件对于嘌呤母环6位取代基影响不同, 压力较低时, 嘌呤母环保持6-氯取代不变, 而增加压力则会使嘌呤环6位被氢化还原。9位羧甲基成酰胺反应的条件与氨基的活性有关, 在氨基活性较高的情况下, 采用酸和胺在EDCI 缩合下直接酰胺化的方法, 易纯化; 而在氨基活性较低的情况下, 采用将羧酸制成酰氯后和芳胺衍生物再酰胺化的方法。总体来说, 合成路线步骤较短, 操作便利。目标化合物的结构、理化参数及波谱数据见表1、2。
2 CD38酶抑制活性与构效关系研究
目标化合物对CD38 NADase抑制活性测试结果见表3。所合成的化合物大多数没有表现出显著的活
透性好的特点。现已报道活性较好的非共价结合型 1 合成部分
, 但其溶解性较差, 导致生物活
性测试结果较难重复。H2与CD38的计算机对接分析显示, 其结构中的吲哚环位于CD38催化口袋Glu226、Ser126、Ser193 形成的负电空腔内, 增加其正电性有可能提高化合物的抑制活性, 并且吲哚环的3、5位取代可以较好的满足结合口袋的伸展方向。对H2改造得到的构效关系说明, 苯丙酰基是维持化合物活性的重要基团[14]。因此, 为改善化合物的溶解性和提高化合物的活性, 本文将H2中间的吲哚环改为水溶性和正电性都相对更强的嘌呤环[15], 化合物整体保持与吲哚环的3, 5位取代类似的构型, 考虑到母环的
Figure 1 The structures of representative noncovalent CD38 inhibitors
Figure 2 The design of purine derivatives
李 娜等: 嘌呤衍生物的合成及其对CD38的抑制作用研究
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Reagents and conditions: (a) 1. K2CO 3, DMF, 85 ℃, 30 min; 2. Benzyl bromoacetate, 0 ℃→ rt, 18 h. (b) POCl3, pyridine, −15 ℃→ rt, 4 h. (c) H2, Pd/C, 0.15 MPa (6−20) or 0.4 MPa (21−31), EtOAc/MeOH, rt, 8 h. (d) R-NH2, EDCI, THF or DMF, 0 ℃→ rt, 24 h. (e) 1. TMA, THF/DMF, 0 ℃→ rt, 24 h; 2. KF, DMF, 60 ℃, 24 h. (f) CF3COOH, rt, 24 h. Scheme 1 Synthetic route of compound 4−34
Reagents and conditions: (a) NaH, benzyl bromoacetate, rt, 24 h. (b) CDI, 105 ℃, 2 h, BuOH, 85 ℃, 24 h. (c) H2, Pd/C, 0.2 MPa, EtOH, rt, 8 h. (d) R-NH2, EDCI, DMF, 0 ℃→ rt, 24 h. Scheme 2 Synthetic route of compound 35−40
性, 但化合物20 (IC50: 33.5 μmol·L−1) 、38 (IC50: 31.5 μmol·L−1) 与先导化合物H2 (IC50: 30.3 μmol·L−1) 的活性水平相当。
在维持嘌呤母环2位苯丙酰基取代的前提下, 为了研究嘌呤母环6-位取代基的影响, 化合物A 部分改造设计了-Cl/-H/-F/-OH四种取代类型。通过对比化
的方法将化合物20/31/34分别与CD38对接 (图3a), 发现化合物20 (淡青色) 可以与CD38催化口袋关键氨基酸残基Glu226发生氢键相互作用; 而化合物31 (蓝色) 和化合物34 (白色) 均偏离关键氨基酸残基Glu226, 化合物活性明显下降, 说明-R 2中含有合适
的芳香性基团对于维持化合物在CD38活性口袋中的
合物5/33、8/27、15/30、17/32的活性可以发现, 6位-Cl/-H/-F/-OH取代对活性影响不明显。在维持嘌呤母环2位苯丙酰基取代的化合物 (5~34) 中, 仅化合物20表现出与先导结构相当的活性水平, 化合物20与
有效构像有利。
C 部分没有苯丙酰基取代的化合物的活性与含有苯丙酰基取代的化合物相当。在此类化合物中, 嘌呤母环6位含有-Boc 取代的化合物38 (31.5 μmol·L−1) 活性最好, 与先导化合物H2及化合物20相当。通 过分子对接的方法对化合物20和38进行分析可知 (图3b), 二者与CD38具体的结合模式有些差异。化
其他化合物的主要区别在于-R 2中含有苯并噻唑环,
因此推测有可能是这一大的芳香性基团在化合物20与CD38的结合过程中起着重要作用。利用分子对接
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药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2015, 50 (8): 1013−1020
1
Table 1 Structures and H NMR data of the synthesized compounds
Compd. R1 5
6
7
-Cl
-Cl
-Cl
8
-Cl
R 2
1
H NMR ( DMSO-d 6, 400 MHz)
10.91 (s, 1H), 8.52 (s, 1H), 7.37 (s, 5H), 7.31−7.22 (m, 4H), 7.18 (dd, J = 10.8, 4.2 Hz, 1H), 5.22 (s,
2H), 5.20 (s, 2H), 2.93−2.85 (m, 2H), 2.84−2.75 (m, 2H)
13.58 (s, 1H), 10.90 (s, 1H), 8.50 (s, 1H), 7.31−7.23 (m, 4H), 7.21−7.16 (m, 1H), 5.01 (s, 2H), 2.90 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.79 (t, J = 7.4 Hz, 2H)
10.86 (s, 1H), 10.37 (s, 1H), 8.51 (s, 1H), 7.50 (s, 1H), 7.47 (s, 1H), 7.29−7.19 (m, 4H), 7.16 (dd, J = 11.0, 4.3 Hz, 1H), 6.91 (s, 1H), 6.89 (s, 1H), 5.11 (s, 2H), 3.72 (s, 3H), 2.91−2.83 (m, 2H), 2.81−2.74 (m, 2H)
10.86 (s, 1H), 10.76 (s, 1H), 8.52 (s, 1H), 8.25 (s, 1H), 7.82 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.68 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.49 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.29−7.18 (m, 4H), 7.14 (ddd, J = 8.5, 4.1, 1.9 Hz, 1H), 5.17 (s, 2H), 4.30 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.86 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 1.30 (t, J = 7.1 Hz, 3H) 10.86 (s, 1H), 10.75 (s, 1H), 8.74 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.52 (s, 1H), 8.31 (dd, J = 4.7, 1.3 Hz, 1H), 8.05−7.95 (m, 1H), 7.37 (dd, J = 8.3, 4.7 Hz, 1H), 7.29−7.18 (m, 4H), 7.15 (ddd, J = 8.5, 5.0, 2.0 Hz, 1H), 5.19 (s, 2H), 2.91−2.83 (m, 2H), 2.82−2.72 (m, 2H)
11.00 (s, 1H), 10.87 (s, 1H), 8.91 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 8.81 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 8.59 (t, J = 2.2 Hz, 1H), 8.53 (s, 1H), 7.33−7.18 (m, 4H), 7.17−7.10 (m, 1H), 5.21 (s, 2H), 3.88 (s, 3H), 2.86 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.78 (t, J = 7.4 Hz, 2H)
10.86 (s, 1H), 9.94 (s, 1H), 9.82 (s, 1H), 8.51 (s, 1H), 7.82 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.32−7.20 (m, 4H), 7.16 (dd, J = 10.9, 4.3 Hz, 1H), 6.99−6.86 (m, 2H), 6.74 (dd, J = 11.7, 4.8 Hz, 1H), 5.22 (s, 2H), 2.97−2.83 (m, 2H), 2.82−2.68 (m, 2H)
10.87 (s, 1H), 10.20 (s, 1H), 8.50 (s, 1H), 7.24 (d, J = 7.5 Hz, 4H), 7.17−7.15 (m, 1H), 6.93 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 6.87 (s, 1H), 6.69 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 6.28 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 5.11 (d, J = 4.1 Hz, 4H), 2.97−2.82 (m, 2H), 2.79−2.75 (m, 2H)
10.88 (s, 1H), 10.76 (s, 1H), 8.53 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.87 (dd, J = 8.8, 2.2 Hz, 3H), 7.69−7.56 (m, 2H), 7.33−7.19 (m, 5H), 7.18−7.13 (m, 1H), 5.19 (s, 2H), 2.87 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.78 (t, J = 6.6 Hz, 2H)
10.88 (s, 1H), 10.66 (s, 1H), 8.52 (s, 1H), 8.04 (s, 1H), 7.96 (s, 1H), 7.74 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.58 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.45−7.32 (m, 2H), 7.23 (q, J = 7.9 Hz, 4H), 7.15 (d, J = 6.6 Hz, 1H), 5.17 (s, 2H), 2.91−2.82 (m, 2H), 2.81−2.68 (m, 2H)
10.87 (s, 1H), 10.83 (s, 1H), 8.53 (s, 1H), 8.16 (s, 1H), 7.76−7.68 (m, 1H), 7.60−7.51 (m, 2H), 7.39 (s, 2H), 7.28−7.20 (m, 4H), 7.19−7.12 (m, 1H), 5.19 (s, 2H), 2.90−2.84 (m, 2H), 2.81−2.74 (m, 2H)
10.91 (s, 1H), 9.70 (s, 1H), 8.50 (s, 1H), 7.99 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.66 (s, 2H), 7.60 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 7.36 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.25 (m, 4H), 7.17 (m, 1H), 5.26 (s, 2H), 2.94−2.84 (m, 2H), 2.84−2.74 (m, 2H)
12.73 (s, 1H), 10.88 (s, 1H), 8.51 (s, 1H), 7.52 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 7.32−7.18 (m, 5H), 7.15 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 5.27 (s, 2H), 2.86 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 7.1 Hz, 2H)
9
-Cl
10
-Cl
11 -Cl
12
-Cl
13
-Cl
14 -Cl
15 -Cl
16 -Cl
17 -Cl
18 -Cl
19 -Cl
20 -Cl
13.22 (s, 1H), 10.89 (s, 1H), 8.52 (s, 1H), 8.20 (s, 1H), 7.29−7.18 (m, 4H), 7.18−7.10 (m, 1H), 5.32 (s, 2H), 4.27 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.86 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.27 (t, J = 7.1 Hz, 3H)
13.15 (s, 1H), 10.86 (s, 1H), 8.51 (s, 1H), 8.10 (s, 1H), 7.33−7.18 (m, 4H), 7.18−7.08 (m, 1H), 5.27 (s, 2H), 4.28 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.86 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 1.30 (t, J = 7.1 Hz, 3H)
13.39 (s, 1H), 10.89 (s, 1H), 9.09 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.55 (s, 1H), 8.31 (dd, J = 9.0, 2.4 Hz, 1H), 7.97 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.27−7.17 (m, 4H), 7.16−7.07 (m, 1H), 5.38 (s, 2H), 2.88 (t, J = 7.9 Hz, 2H), 2.80 (t, J = 7.9 Hz, 2H)
21
-H
13.36 (s, 1H), 10.61 (s, 1H), 8.98 (s, 1H), 8.42 (s, 1H), 7.32−7.23 (m, 4H), 7.18−7.15 (m, 1H), 4.99 (s, 2H), 2.88 (t, J = 7.9 Hz, 2H), 2.80 (t, J = 7.9 Hz, 2H)
李 娜等: 嘌呤衍生物的合成及其对CD38的抑制作用研究
R 2
1
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Continued
H NMR ( DMSO-d 6, 400 MHz)
Compd. R1 22
-H
23
-H
24
-H
25
-H
10.59 (s, 1H), 10.36 (s, 1H), 8.99 (s, 1H), 8.44 (s, 1H), 7.49 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.27−7.20 (m, 4H), 7.18−7.12 (m, 1H), 6.90 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 5.10 (s, 2H), 3.72 (s, 3H), 2.88 (t, J = 7.9 Hz, 2H), 2.80 (t, J = 7.9 Hz, 2H)
10.63 (s, 1H), 10.39 (s, 1H), 9.00 (s, 1H), 8.44 (s, 1H), 7.32−7.19 (m, 4H), 7.19−7.05 (m, 3H), 6.97 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.48 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 5.11 (s, 2H), 3.17 (s, 1H), 2.96−2.83 (m, 2H), 2.82−2.73 (m, 2H)
10.60 (s, 1H), 10.20 (s, 1H), 8.99 (s, 1H), 8.43 (s, 1H), 7.31−7.19 (m, 4H), 7.19−7.10 (m, 1H), 6.93 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 6.87 (s, 1H), 6.70 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 6.28 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 5.10 (d, J = 5.0 Hz, 4H), 2.88 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.79 (t, J = 7.0 Hz, 2H)
10.76 (s, 1H), 10.63 (s, 1H), 9.01 (s, 1H), 8.46 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 7.82 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.50 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.27−7.17 (m, 4H), 7.17−7.10 (m, 1H), 5.17 (s, 2H), 2.90−2.83 (m, 2H), 2.83−2.74 (m, 2H), 2.55 (s, 3H)
10.88 (s, 1H), 10.61 (s, 1H), 9.01 (s, 1H), 8.46 (s, 1H), 7.95 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.73 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.31−7.19 (m, 4H), 7.15−7.12 (m, 1H), 5.19 (s, 2H), 4.29 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 2.90−2.85 (m, 2H), 2.82−2.76 (m, 2H), 1.31 (t, J = 7.0 Hz, 3H)
10.76 (s, 1H), 10.59 (s, 1H), 9.01 (s, 1H), 8.46 (s, 1H), 8.25 (s, 1H), 7.83 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.68 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.49 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.26−7.18 (m, 4H), 7.16−7.10 (m, 1H), 5.16 (s, 2H), 4.31 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.90−2.83 (m, 2H), 2.83−2.75 (m, 2H), 1.31 (t, J = 7.1 Hz, 3H).
11.04 (s, 1H), 10.64 (s, 1H), 9.02 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.92 (s, 1H), 8.81 (s, 1H), 8.60 (s, 1H), 8.47 (s, 1H), 7.22−7.15 (m, 4H), 7.14−7.11 (m, 1H), 5.22 (s, 2H), 3.87 (s, 3H), 2.86 (d, J = 6.2 Hz, 2H), 2.81 (d, J = 6.2 Hz, 2H)
10.92 (s, 1H), 10.63 (s, 1H), 9.02 (s, 1H), 8.46 (s, 1H), 8.34 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.73 (dd, J = 8.5, 2.1 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.27−7.20 (m, 4H), 7.17−7.11 (m, 1H), 5.18 (s, 2H), 2.90−2.83 (m, 2H), 2.83−2.73 (m, 2H), 2.48 (s, 3H)
10.83 (s, 1H), 10.59 (s, 1H), 9.00 (s, 1H), 8.45 (s, 1H), 8.16 (s, 1H), 7.77−7.67 (m, 1H), 7.53 (dd, J = 3.4, 1.8 Hz, 2H), 7.38 (s, 2H), 7.30−7.19 (m, 4H), 7.17−7.06 (m, 1H), 5.17 (s, 2H), 2.87 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.78 (t, J = 7.1 Hz, 2H)
13.17 (s, 1H), 10.61 (s, 1H), 9.02 (s, 1H), 8.45 (s, 1H), 8.11 (s, 1H), 7.27−7.19 (m, 4H), 7.15 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 5.27 (s, 2H), 4.29 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.90−2.83 (m, 2H), 2.83−2.75 (m, 2H), 1.31 (t, J = 7.1 Hz, 3H)
12.73 (s, 1H), 10.84 (s, 1H), 8.49 (s, 1H), 7.53 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 7.30−7.19 (m, 5H), 7.15 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 5.29 (s, 2H), 2.87 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 2.78 (t, J = 6.9 Hz, 2H)
12.06 (s, 1H), 11.75 (s, 1H), 7.99 (s, 1H), 7.37 (p, J = 3.9 Hz, 5H), 7.33−7.28 (m, 2H), 7.25 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 7.20 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 5.20 (s, 2H), 5.09 (s, 2H), 2.92 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.79 (t, J = 7.5 Hz, 2H)
13.09 (s, 1H), 12.06 (s, 1H), 11.71 (s, 1H), 8.10 (s, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.34−7.11 (m, 5H), 5.15 (s, 2H), 4.28 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.90 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.76 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.30 (t, J = 7.1 Hz, 3H)
13.16 (s, 1H), 10.15 (s, 1H), 8.57 (s, 1H), 8.44 (s, 1H), 8.10 (s, 1H), 5.32 (s, 2H), 4.29 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 1.50 (s, 9H), 1.31 (t, J = 7.1 Hz, 3H).
10.85 (s, 1H), 10.11 (s, 1H), 8.58 (s, 1H), 8.45 (s, 1H), 8.16 (d, J = 0.9 Hz, 1H), 7.76−7.70 (m, 1H), 7.57−7.52 (m, 2H), 7.38 (s, 2H), 5.22 (s, 2H), 1.50 (s, 9H)
10.77 (s, 1H), 10.12 (s, 1H), 8.77 (d, J = 16.9 Hz, 1H), 8.58 (s, 1H), 8.45 (s, 1H), 8.31 (dd, J = 4.7, 1.4 Hz, 1H), 8.02 (ddd, J = 8.4, 2.5, 1.5 Hz, 1H), 7.38 (dd, J = 8.3, 4.7 Hz, 1H), 5.23 (s, 2H), 1.50 (s, 9H)
26
-H
27
-H
28
-H
29
-H
30
-H
31
-H
32
-F
33
-OH
34
-OH
38 −
39 −
40 −
合物20可以与CD38口袋的关键氨基酸残基Glu226、Glu146、Trp125、Ser126、Arg127等发生氢键相互作用; 而化合物38能与Glu226、Trp125、Trp189、Asp156、Phe222、Lys129、Leu157等发生氢键相互作用, 同时与Trp189有π-π相互作用。二者都能与CD38的最关键氨基酸残基Glu226发生氢键相互作用, 这可能是导致二者活性相近的关键原因, 这一现
象也为设计高活性抑制剂提供了另一结合模式。
本文通过将H2的吲哚环更换为水溶性和正电性都相对更强的嘌呤环, 得到两个溶解性相对较好的化合物20、38, 二者活性相近, 均达到了先导化合物H2的水平。活性评价结果显示, 嘌呤6位小取代基对化合物的活性影响不大, 嘌呤2-位是否有苯丙酰基取代对化合物与CD38的结合模式有重要影响。研
· 1018 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2015, 50 (8): 1013−1020
Table 2 Physical constants and HR-MS of synthesized Table 3 NADase inhibitory activity of synthesized purine compounds derivatives
Compd. Yield/% 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 38 39 40
mp/℃
HR-MS (ESI-TOF+) m /z
Calcd. Found.
450.133 3 358.070 7 465.144 2 507.154 8 436.128 9 494.134 4 451.128 5 450.144 5 478.139 4 478.139 4
514.106 4 514.106 4 442.085 3 514.106 4 514.106 4 535.070 4 324.109 7 431.183 2 417.167 5 416.183 5 443.183 2 473.193 7 473.193 7 460.173 3 460.173 3 480.145 4 480.145 4 424.099 2 432.167 2 494.124 7 448.140 3 448.140 3 370.162 8
Compd. IC50/μmol·L−150/μmol·L−1 H2 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
30.3 none 140.6 >1 000 586.8 227.9 >1 000 464.5 196.6 >1 000 >1 000 310.0 815.6 236.8 140.8 792.3 33.5
21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 38 39 40
124.6 >1 000 >1 000 513.5 >1 000 >1 000 >1 000 538.8 >1 000 871.4 >1 000 >1 000 912.9 158.8 31.5 398.6 639.1
48.1 148−149 [M+H]+: 450.132 5 73.2 179−180 [M−H]−: 358.070 7 44.9 217−218 [M+H]+: 465.143 2 56.7 185−186 [M+H]+: 507.154 0 31.4 159 (dec.) [M+H]+: 436.128 7 43.7 163−164 [M+H]+: 494.134 6 56.7 110−111 [M+H]+: 451.127 3 53.6 221−222 [M+H]+: 450.143 5 47.4 238−239 [M+H]+: 478.140 0 60.2 202−203 [M+H]+: 478.139 3
61.6 186
−187 [M+H]+: 514.106 9 54.6 199−200 [M+H]+: 514.106 0 53.7 221−222 [M+H]+: 442.084 2 37.8 115−116 [M+H]+: 514.107 9 39.8 119−120 [M+H]+: 514.105 3 46.2 152−153 [M−H]−: 535.071 4 77.5 167−168 [M−H]−: 324.109 7 38.6 253−254 [M+H]+: 431.182 1 44.5 220−221 [M+H]: 417.166 2 50.9 233−234 [M+H]+: 416.183 0 54.4 233−234 [M+H]+: 443.182 5 50.3 253−254 [M+H]: 473.193 4 46.1 236−237 [M+H]+: 473.192 6 36.8 111−112 [M+H]: 460.172 8 40.4 235−236 [M+H]+: 460.173 9 46.1 248−249 [M+H]+: 480.145 0 41.4 246−247 [M+H]+: 480.145 2 53.7 181−182 [M+H]+: 424.098 2 52.1 234−235 [M+H]: 432.166 6 56.3 230−231 [M-H]: 494.124 2 52.4 178−179 [M+H]+: 448.140 3 55.7 150 (dec.) [M+H]+: 448.139 2 61.3 136−137 [M+H]+: 370.162 3
−++++
究结果为开发高活性CD38抑制剂提供了新的思路。
实验部分
核磁共振波谱数据由Bruker Avance Ⅲ 400型核磁共振仪测定, 内标为TMS, 数据由MestReNova 软件处理; 质谱数据 (ESI-TOF) 由QSTAR 液质联用仪测定; 高分辨质谱数据 (ESI-TOF) 由Bruker Apex IV FTMS型傅立叶离子回旋变换质谱仪测定; 熔点由X-4精密显微熔点测定仪测定 (北京赛百奥科技有限公司, 温度未校正); 柱色谱硅胶 (200~300目, 300~400目, 上海上邦实业有限公司) 。
所有溶剂、原料和试剂如无说明均为市售分析纯。无水无胺DMF 用氢化钙干燥后减压蒸馏制得, 无
Figure 3 The predicted binding modes of 20 (nattierblue) / 31 (blue) / 34 (white) / 38 (green)-CD38. a. Superimposition of binding
modes of compounds 20/31/34 docked into the binding site of CD38. Compound 20 can form hydrogen bonds with key residue Glu226,
Glu146 and Trp125, while compounds 31/34 can not. b. Superimposition of binding modes of compounds 20/38 docked into the binding site of CD38. Compound 38 can form hydrogen bonds with key residue Glu226, Trp189, Asp156, the two compounds both can form hydrogen bonds with Glu226 with two different binding mode
李 娜等: 嘌呤衍生物的合成及其对CD38的抑制作用研究
· 1019 ·
水THF 用钠丝回流除水, 二苯甲酮为指示剂; 无水二氯甲烷加氢化钙回流干燥。 1 化学合成
合成。取5.07 g (30 mmol, 1.0 eq.) 2-氨基6-氯嘌呤、水DMF 中, 升温至85 ℃后搅拌30 min, 随后降温至0 ℃, 搅拌下缓慢滴加5.2 mL (33 mmol, 1.1 eq.) 溴乙酸卞酯, 缓慢升至室温, 继续搅拌18 h。过滤除去K 2CO 3, 将滤液倒入正在搅拌的60 mL (1 mol·L−1) 的盐酸中, 搅拌2 h, 析出粉红色固体, 过滤, 300 mL水洗, 滤饼干燥后用60 mL乙腈重结晶, 过滤, 依次用100 mL甲醇和100 mL乙醚洗, 干燥得6.7 g白色固体化合物, 即为化合物4, 产率70.4%。
1.2 中间体35~37的合成 化合物35~37参照文献[17]方法合成。
30 mL DMF, 加入288 mg (12 mmol, 1.2 eq.) NaH, 氩气保护下室温反应3 h, 降至0 ℃, 缓慢滴加1.73 mL (11 mmol, 1.1 eq.) 溴乙酸卞酯, 逐渐升至室温反应过夜。反应完成后, 将DMF 悬干, 加入少量水, 超声, 过滤, 除去水溶性杂质。滤饼干燥后加入75 mL无水乙醇, 加热回流30 min, 过滤得白色固体2.36 g, 即为化合物35, 产率83.4%。
取980 mg (3.5 mmol, 1.0 eq.) 35溶于15 mL DMF, 加入845 mg (5.2 mmol, 1.5 eq.) CDI, 加热至105 ℃, 氩气保护下反应2 h, 2 h后降至85 ℃, 滴加0.5 mL正丁醇, 混合物反应过夜。降至室温, 加入25 mL水, 反应2 h。过滤, 少量CH 2Cl 2/CH3OH 溶解后拌样过柱, 减压柱梯度洗脱 (PE/EtOAc = 20∶1→1∶2) 得白色固体860 mg, 即为化合物36, 产率64.8%。
取500 mg (1.7 mmol, 1.0 eq.) 36溶于60 mL EtOH 中, 加入50 mg 10% Pd/C, 在压力0.2 MPa下催化氢化8 h, 在硅藻土上过滤, 蒸出溶剂后常压柱分离纯化 (CH2Cl 2/CH3OH = 100∶1→20∶1), 得到白色固体357 mg, 即为化合物37, 产率: 93.3%。 1.3 化合物5的合成 取3.17 g (10 mmol, 1.0 eq.) 4、1.65 g (11 mmol, 1.1 eq.) 3-苯丙酸溶于60 mL无水吡啶中, −15 ℃下缓慢滴加0.9 mL (10 mmol, 1.1 eq) POCl 3, 滴加完毕后继续搅拌30 min, 将温度缓慢升至室温搅拌6 h。反应完成后用冰水淬灭。减压蒸除溶剂, 加入400 mL乙酸乙酯和200 mL水, 震荡至固体基本溶解后萃取分离有机相, 饱和食盐水洗涤, 无水Na 2SO 4干燥。减压蒸除溶剂, 用少量甲醇/二氯甲烷
混合液溶解, 拌样过柱, 减压柱梯度洗脱 (石油醚/乙酸乙酯= 20∶1→1∶2) 得淡黄色固体2.16 g, 即为
化合物5, 产率48.1%。
化合物5溶于60 mL EtOAc/MeOH (1∶1) 中, 加入硅藻土上过滤, 蒸除溶剂后常压柱分离纯化 (CH2Cl 2/ CH 3OH = 100∶1→20∶1), 得到白色固体467 mg, 即为化合物6, 产率73.2%。
通过改变该路线中的氢气压力 (增大至0.4 MPa) 同法合成了化合物21。
1.5 嘌呤6位氯取代化合物7的合成 取100 mg (0.278 mmol, 1.0 eq.) 化合物6、37.7 mg (0.306 mmol, 1.1 eq.) 对甲氧基苯胺, 溶于15 mL无水DMF 中, 冰浴冷却后加入80 mg (0.417 mmol, 1.5 eq.) EDCI, 室温搅拌24 h。减压蒸除溶剂, 少量CH 2Cl 2/CH3OH 溶200∶1→80∶1), 得58 mg白色固体, 即为化合物7, 产率44.9%。用其他芳胺代替对甲氧基苯胺, 按同法合成可以得到化合物8~20。
将底物化合物6更换为化合物21, 用以上相同的方法可合成化合物22~31。
将底物化合物6更换为化合物37, 用以上相同的方法可合成化合物38~40。
1.6 嘌呤6位氟取代化合物32的合成 取70 mg (0.159 mmol, 1.0 eq.) 化合物17, 溶于10 mL无水THF/DMF (3∶1) 中, 冰浴冷却后缓慢滴加33%的三
化合物6的合成 取800 mg (1.8 mmol, 1.0 eq.) 1.1 中间体4的合成 化合物4参照文献[16]方法 1.4
6.17 g (45 mmol, 1.5 eq.) K2CO 3, 悬浮于100 mL无 80 mg 10% Pd/C, 在压力0.15 MPa下催化氢化8 h, 在
取1.35 g (10 mmol, 1.0 eq.) 6-氨基嘌呤悬浮于 解后拌样过柱, 常压柱梯度洗脱 (CH2Cl 2/CH3OH =
甲胺乙醇溶液1 mL, 逐渐升至室温搅拌24 h, 减压蒸除溶剂得白色固体。将此白色固体溶于5 mL无水DMF 中, 同时加入46 mg (0.793 mmol, 5.0 eq) KF, 在60 ℃下反应24 h, 减压蒸除溶剂, 用少量CH 2Cl 2/ CH 3OH 溶解后拌样过柱, 常压柱分离纯化 (CH2Cl 2/ CH 3OH = 200∶1→50∶1), 得36 mg白色固体, 即为化合物32, 产率53.7%。
1.7 嘌呤6位羟基取代化合物33的合成 取60 mg (0.134 mmol, 1.0 eq.) 化合物5, 溶于3 mL CF3COOH/ H 2O (2∶1), 室温下反应24 h。减压蒸除溶剂后用少量CH 2Cl 2/CH3OH 溶解, 拌样过柱, 常压柱分离纯化 (CH2Cl 2/CH3OH = 200∶1→40∶1), 得30 mg白色固体, 即为化合物33, 产率52.1%。
将底物化合物5更换为化合物19, 用以上相同方法合成化合物34。
2 嘌呤衍生物对CD38的抑制活性评价
生物活性测试参照文献[11]的方法完成。将重组
· 1020 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2015, 50 (8): 1013−1020
CD38 (仅含C 端催化结构域的水溶性蛋白) 和牛血清白蛋白混合均匀, 向其中加入不同浓度梯度的化合物溶液使CD38的终浓度为1.0 μg·mL−1, 室温共 孵育1 h后, 加入100 μL 50 μmol·L−1 εNAD (1, N 6-etheno-NAD +) 作为反应底物, 测试CD38 NAD水 解 (NAD+-glycohydrolase) 和ADP 核糖环化 (ADP- ribosyl cyclyase) 的总活性。εNAD 的水解或环化会导致荧光强度增强10倍以上, 利用M200-Pro 多功能酶标仪测试荧光 (激发波长为300 nm, 发射波长为410 nm) 增长率, 反应时间为30 min。由荧光增长的斜率即可推出CD38 NADase/cyclase催化活性, 通过与不加抑制剂的空白组对照可以得出抑制剂的NADase/ cyclase 活性抑制率, 根据化合物不同浓度测量点的 NADase/cyclase活性抑制率绘图得到抑制剂的IC 50值。3 分子对接
对接过程参照文献[13]。使用最新解析的CD38晶体结构 (PDB code: 4F45) 为受体, 通过Discovery Studio2.5 (Accelrys, San Diego, CA) 中的Prepare Protein 模块进行预处理。使用Discovery Studio2.5中的Prepare Ligands模块进行小分子结构的预处理。对接软件使用AutoDock 4.2。利用晶体结构中的配体定义口袋盒子, 对接盒子边长设置为22.5 Å, 使用半经验自由能进行评价, 拉马克遗传算法循环100次, 其余参数保持默认。
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