氯化钴对小鼠腹腔巨噬细胞的抑制作用
·论著·
氯化钴对小鼠腹腔巨噬细胞的抑制作用
The inhibition of CoCl 2on mouse peritoneal macrophages 颜勋，蔡洪华，杨雪，端礼荣
YAN Xun ，CAI Hong-hua ，YANG Xue ，DUAN Li-rong
江苏大学临床医学院，江苏省镇江市212001
摘要：目的
观察氯化钴（CoCl 2）对巨噬细胞体外培养的抑制作用。方法
采用小鼠巨噬细胞体外培养法在不同浓度50. 0mg /ml的CoCl 2作用24h ，小鼠腹腔巨
（0. 5、5. 0、50. 0mg /ml）的CoCl 2作用下，应用细胞增殖抑制试验（MTT 法）测定体外巨噬细胞的抑制率、应用吖啶橙染色法测定细胞凋亡情况和应用考马斯亮蓝染色法测定总蛋白含量的变化。结果
噬细胞中蛋白质相对含量为75. 2%，与对照组的100%相比，差异有统计学意义（P ＜0. 01）；5. 0和50. 0mg /mlCoCl 2作用48和72h ，巨噬细胞中蛋白质含量与对照组相比，差异均有统计学意义（P ＜0. 01）。采用吖啶橙染色法测定细胞凋亡发现在CoCl 2的作用下有明显凋亡现象。结论白生成作用。
关键词：氯化钴; 腹腔巨噬细胞; 动物模型; 体外培养中国图书资料分类号：Ｒ114
文献标识码：A
文章编号：1004－1257（2013）22－2934－03
CoCl 2对小鼠体外巨噬细胞增殖有明显的抑制作用，且有促细胞凋亡和抑制蛋
The inhibition of CoCl 2on mouse peritoneal macrophages
YAN Xun ，CAI Hong-hua ，YANG Xue ，DUAN Li-rong
Schooh of Clinical Medicine ，Jiangsu University ，Zhenjiang ，212001，China
Abstract ［Objective ］To observe the inhibition effect of CoCl 2on macrophages cultured in vitro ［Mothods ］Adopt the method of culturing the mouse macrophages in vitro ，which is under the different concentration level （0．5，5．0，50．0mg /ml）of CoCl 2．The the condition of apoptosis was tested by acridine orange staining inhibition ratio of macrophage in vitro was tested by MTT method ，
method and the change of the total protein content was tested by Commassie blue staining method．［Ｒesult］After exposed the CoCl 2of 50．0mg /ml24h ，the relative contents of protein in mouse peritoneal macrophages was 75．2%．Compared to the 100%of the control group ，the difference was statistically significant （P ＜0．01）．After exposed the CoCl 2of 5．0and 50．0mg /ml48and 72h ，compared to the control group ，the difference of the protein content in macrophages were all statistically significant （P ＜0．01）．The obvious phenomenon of apoptosis was found by acridine orange staining method under the effect of CoCl 2．［Conclusion ］The CoCl 2can significantly inhibit the proliferation of the mouse macrophage ，promote apoptosis and inhibit the protein generation．Key words
Cobalt chloride （CoCl 2）；Peritoneal macrophages ；Animal model ；Culture in vitro
钴Co 是正常人体所必需的微量元素，是维生素B 12主要成分。钴具有明显的刺激生血作用，多用于治疗巨细胞性贫血。氯化钴（CoCl 2）是一种化学制剂，由于其特殊的化学性能，常用于体外诱导化学缺氧，并在细胞增殖、迁移、应激反应的研究中得到广泛使用
［1-2］
1．1材料昆明种小鼠（江苏大学动物实验中心实验
动物合格证编号为SYXK2008－0024）；二甲亚砜（上海圣宇化工有限公司专业供应），四甲基偶氮噻唑蓝（上海源叶生物科技有限公司），胎牛血清（浙江天杭CoCl 2（上海紫一试剂厂专业生生物科技有限公司），
250（上海科兴商贸有限公吖啶橙、考马斯亮蓝G-产），
司），牛血清白蛋白（上海江莱生物科技有限公司）。1．2
主要仪器
ＲAD公司），CO 2培酶标仪（美国Bio-USA ），722养箱（NAPCO ，荧光显微镜（Leica ，德国），分光光度计（上海天翔光学仪器有限公司）。1．3
动物模型与巨噬细胞的获取
于实验前3天给
小鼠腹腔注射液体石蜡1ml 。实验前4h 再注射1次液体石蜡，拉颈处死小鼠，用75%乙醇消毒其腹部，剪开小鼠腹部皮肤，向腹腔注射4ml PBS 缓冲液，轻柔其腹部使液体充分流动，将液体吸出收集腹腔液于无菌
。有研究表明CoCl 2化学模拟缺氧，可以抑制人
［3］
急性早幼粒细胞白血病细胞株的增殖。而且能够调
控鼠类神经胶质细胞向神经损伤处的迁移。我们通过实验了解不同浓度CoCl 2的对巨噬细胞的增殖、凋亡和蛋白质含量的影响，为进一步探讨CoCl 2对巨噬细胞影响机制提供实验依据。1
材料与方法
基金项目：江苏大学大学生科研立项资助项目（项目编号：11A302）
作者简介：颜勋，男，在读大学生。
：，Email ：duanlr @ujs．edu．cn 通讯作者端礼荣
1000r /min（离心半径离心管中，再用PBS 清洗2次，5cm ）离心5min 收集细胞，用含10%灭活小牛血清的达尔伯克氏改良伊格尔培养基（DMEM ）培养液悬浮细
6
胞，调整细胞浓度为2ˑ 10个/ml备用。
和时间对小鼠体外培养的巨噬细胞有明显的抑制作用
。
1．4腹腔巨噬细胞增殖抑制试验(MTT 法) 取
100μl 2ˑ 106/ml腹腔巨噬细胞加入96孔板，置于37ħ 、5%CO 2条件下培养，2h 后，分别加入50μl 的50、5．0和0．50mg /ml浓度的CoCl 2作用12、24和36h ，对照组加入DMEM 细胞培养液，每组5个复孔。加入20μl MTT 液体，避光培育4h ，小心吸去培养上清液，每孔加入150μl DMSO 终止反应。在室温下振荡10min ，酶标仪测定490nm 处吸光度（A ）值。1．5
细胞凋亡的测定
同上述实验方法，将无菌盖玻
6
图1氯化钴对小鼠巨噬细胞增殖抑制作用
2．2
片置于24孔板内，每孔接种150μl （2ˑ 10/ml）细胞于载玻片上。经不同浓度CoCl 2处理细胞培养36h 后，用PBS 缓冲液清洗细胞，用10%甲醛固定细胞30min 后，用PBS 缓冲液洗涤2次，取出盖玻片置于载玻片滴加1滴吖啶橙，将载玻片置于荧光显微镜下观察并拍照。计数分析结果。1．6
细胞总蛋白的测定
取150μl （2ˑ 10/ml）的细
6
CoCl 2对小鼠腹腔巨噬细胞凋亡的影响见图2，
通过吖啶橙染色法测定细胞凋亡，在荧光显微镜下观察细胞凋亡，发现凋亡的细胞核呈均匀密度的荧光，染，色质高度浓缩，核外周形成“新月状”在不同浓度的CoCl 2的作用下，与对照组比较，其“新月状”的细胞数说明CoCl 2对小鼠腹腔巨噬细胞有明显量明显增加，的促凋亡作用
。
50、100设3个浓度组，分别为25、胞接种于24孔板内，
mg /ml的CoCl 2处理培养12、24和48h 及对照组，每组3个复孔。然后用0．25%胰蛋白酶将细胞消化至悬浮，离心，加入1ml PBS 缓冲液吹打均匀，加入5ml 考马斯亮蓝，混匀后用分光光度计在595nm 处测定溶液的A 值。进行蛋白定量需要制作标准曲线，标准曲线通常是用牛血清白蛋白（BSA ），以牛血清白蛋白含量A 值为纵坐标，为横坐标，绘制标准曲线。1．7
统计分析
采用SPSS 16．0统计软件进行数据分
ʃ s 表示；用单因素方差分析进行统析，计量资料以x 珋计分析。22．1
结
果
CoCl 2对腹腔巨噬细胞增殖抑制的影响
如图1
A ：对照组细胞
B ：0. 5mg /ml
氯化钴作用组细胞
可见，显示了3种不同浓度的CoCl 2作用不同时间对腹5. 0腔巨噬细胞增殖抑制的影响。当CoCl 2浓度为50、和0. 5mg /ml时，在12h 内对腹腔巨噬细胞增殖有抑制作用，与对照组比较，差异无统计学意义（t =0．548，P =0/69；t =0/278，P =0．603；t =1．23，P =0．284）；分36h 与对照组比较，别作用24、差异有统计学意义（t =3．47，P =0．01；t =11．61，P =0．001；t =9．14，P =0. 001；t =4．23，P =0．001；t =9．144，P =0．001；t =9. 477，P =0．001）。说明CoCl 2在一定的范围浓度
2．3
C ：5. 0mg /ml氯化钴作用组细胞
D ：500mg /ml氯化钴作用组细胞
图2不同浓度氯化钴处理小鼠腹腔巨噬细胞引起的凋亡的变化（吖啶橙ˑ 200）
CoCl 2对小鼠腹腔巨噬细胞胞蛋白质相对含量的影
响由表1显示了3种不同浓度的CoCl 2作用不同时间对腹腔巨噬细胞蛋白质相对含量的影响。当CoCl 2浓度
为50．0mg /ml时，在24h 测得的蛋白质相对含量（75．2%）与对照组比较，P =0．差异有统计学意义（F =4．32，5．0mg /ml时在24h 内蛋白质相021）；CoCl 2浓度为0．5、
对含量与对照组比较，差异无统计学意义（P ＞0．05）；当CoCl 2浓度为5．0和50．0mg /ml时在48、72h 测得的蛋白
表1
氯化钴（mg /ml）
0．55．050．0对照组
A 值1．22ʃ 0．381．14ʃ 0．830．97ʃ 0．541．28ʃ 0．76
24h
蛋白质相对含量（%）
95．3
89．175．2a 100．0
A 值1．09ʃ 0．160．78ʃ 0．540．62ʃ 0．721．31ʃ 0．17
47. 3%或42．6%、33．8%），明显低质相对含量为59．5%、
P =0．000或于对照组，差异有统计学意义（F =32.751，F =79.501，P =0.000）。说明高浓度CoCl 2和时间的延长对腹腔巨噬细胞蛋白质相对含量有明显抑制作用。
ʃ s ，n =5）氯化钴对小鼠腹腔巨噬细胞蛋白质相对含量的影响（x 珋
48h
蛋白质相对含量（%）
83．2
59．547．3100．0
b
72h
A 值1．06ʃ 0．270．58ʃ 0．430．46ʃ 0．581．36ʃ 0．22
蛋白质相对含量（%）
77．9
42．633．8100．0b
a b P ＜0．05；与5．0和50. 0mg /ml组共同比较，P ＜0．01。注：与对照组比较，
3讨论是由于巨噬细胞在CoCl 2的作用下发生凋亡而使得表达量下降。提示CoCl 2可能具有抑制巨噬细胞的作用，但具体抑制机制有待进一步研究。
参考文献
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修回日期：2013－10－31
责任编辑：张军
role of metalloproteinase ［J ］．
ＲespirＲes，2003，
CoCl 2常作为细胞缺氧模型建立的常用化学物质。其机制：Co
2+
是铁螯合酶的底物，可以替代氧感受器血
2+
在高浓度时与氧结合，将分子保持在红素中的Fe ，
脱氧合状态，使细胞在外界不缺氧的条件下，产生缺氧作用
［4］
。巨噬细胞是重要的免疫活性细胞，不仅能吞
细胞碎片、细菌、精子，还是重要的抗原识噬老化细胞、
1（IL-别细胞，并能分泌多种细胞因子，如白细胞介素-［5］
1）、肿瘤坏死因子（TNF ）等以调节免疫效应。迄
今人们对CoCl 2对巨噬细胞的影响作用研究较少。CoCl 2对细胞的作用是多方面的，除了可以通过抑制氧依赖的脯氨酸羟化酶修饰而抑制蛋白酶体对低氧诱导1（HIF-1α）的降解而在体外化学模拟低氧因子-外
［5-6］
，高剂量CoCl 2还表现出一定的细胞毒性。
本实验结果表明，在3种不同剂量CoCl 2的作用下，小鼠巨噬细胞的增殖受到明显的抑制作用，细胞的生长增殖抑制通常与细胞周期的变化有明显关系。细胞周期是细胞生命活动的基本过程，其正常生长依赖于细胞周期中各种生长因子的平衡调控
［7］
。因而巨噬
细胞的凋亡可能与细胞的调控因子有关。同时研究发CoCl 2还具有促进巨噬细胞凋亡现在不同浓度作用下，
的作用。经典的凋亡通路有死亡受体通路和线粒体通最后都激活天冬氨酸特异性caspase 家族导致凋亡路，
的发生，而凋亡抑制蛋白（IAPs ）家族起抑制凋亡的作用
［8］
，凋亡抑制因子survivin 是IAPs 家族的一个新成
员，是目前发现最强的凋亡抑制因子。有研究表明，在CoCl 2处理细胞后的survivin 蛋白表达水平显著下降，因而巨噬细胞的凋亡可能与抑制survivin 表达有关
［9］
。巨噬细胞总蛋白质含量的变化的差异性，可能