硫酸酯多糖结构中硫酸基位置的判断
第20卷第5期Vol.20 No.5分析科学学报
JOURNALOFANALYTICALSCIENCE2004年10月Oct.2004
文章编号:100626144(2004)0520498203
硫酸酯多糖结构中硫酸基位置的判断
李 波1,顾小红2,许时婴1
(1.江南大学食品学院,江苏无锡214036;2.江南大学分析测试中心,江苏无锡214036)
摘 要:采用红外光谱、脱硫酸酯、硫酸基对碱稳定性和甲基化分析等方法研究了羊栖菜褐藻糖胶中硫酸基的位置,结果表明,红外光谱在820～850cm-1除了动外,还有糖端基的S振
H弯曲振动,二者相互干扰,影响了对硫酸基位置的判断。因
此,在硫酸酯多糖的结构研究中,仅凭红外光谱来判断硫酸基的位置有可能得出错误的结论,而要结合硫酸基对碱稳定性和甲基化分析等手段进行综合的判断才能得到正确的结论。
关键词:红外光谱;硫酸酯多糖;甲基化分析;结构中图分类号:O655.4;O657.33 文献标识码:A
硫酸酯多糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、调节免疫等多种生理功能,因而成为多糖研究领域的热点。众多研究表明,硫酸基的含量和位置对硫酸酯多糖的生物活性有重要影响。在硫酸酯多糖的结构研究中,根据红外光谱来判断硫酸基的位置是比较常用的方法。Lloyd研究发现,1240cm-1是O伸缩振动的特征频率,820～850cm-1是OS振动的特征频率,其中820cm-1表示硫酸基位于单糖残基的平
伏位置(EquatorialPosition),850cm-1表示硫酸基位于垂直位置(AxialPosition)[1]。这一理论至今为很多人所采用,用来确定硫酸基在单糖残基中的位置。
褐藻糖胶(Fucoidan)是褐藻细胞产生的粘性物质,通常指含有岩藻糖的硫酸酯多糖。作者在对羊栖菜褐藻糖胶的结构进行研究时发现,根据红外光谱来判断硫酸基的位置并不可靠,而且可能得出错误的结论。
1 实验部分
1.1 材料
羊栖菜的水提液经乙醇沉淀得粗多糖,后者经CaCl2纯化得褐藻糖胶(用F表示)。F经DEAESepharoseCL26B柱层析和SepharoseCL26B柱层析,得到3个级分F31、F32和F33。1.2 仪器和试剂
Nicolet5DXBFT2IR红外光谱仪(美国,Nicolet公司);FINNIGANTRACEGC/MS分析仪(美国,FINNIGAN公司)。试剂均为国产分析纯。1.3 方法
1.3.1 红外光谱分析 采用KBr压片法,在4000～400cm-1区间分析。
1.3.2 脱硫酸酯 采用Nagasawa法[2]。F脱硫后的产物命名为DSF,收率49%,F32脱硫后的产物命名
为DSF32,收率65%。硫酸基含量的测定采用浊度法(以SO4计)[3]。
1.3.3 硫酸基对碱稳定性[4] 糖溶液与NaBH4反应20h,再与NaOH80℃反应2h。
1.3.4 甲基化分析 F32和DSF32采用Needs法进行甲基化[5]。红外光谱显示,3400cm-1处的羟基峰
基本消失,说明甲基化比较完全。此外,F32在1264cm-1处的O伸缩振动峰没有明显减弱,表明在甲基化反应中硫酸基没有被脱除。GC/MS分析采用OV1701毛细管柱(30m×0.25mm),程序升温:起
收稿日期:2003207208 通讯联系人:李 波
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第5期分析科学学报第20卷
始温度150℃,以3℃/min升温至250℃,保持10min。
结果与讨论2
2.1 红外光谱分析
化学组成分析表明,羊栖菜褐藻糖胶主要含有岩藻糖、甘露糖和半乳糖,还含有一定量的糖醛酸和硫酸基。F、F32和F33的硫酸基含量分别为23.5%、23.4%和3.3%,三者的红外光谱见图1。F在1258cm-1,F32在1264cm-1有O的伸缩振动的特征吸收。F在836cm-1,F32在833cm-1有一吸收峰,尽管二者的硫酸基含量相近,但F32在此处的吸收明显强于F。F33在1250cm-1的吸收较弱,这是因为它的硫酸基含量较低,但F33在833cm-1的吸收却较强。由此可以得出这样的结论:820～850cm-1区间
的峰并不能反映硫酸基含量的高低。
Fig.1 IRspectrumofF,F32andF33
Fig.2 IRspectrumofFandF32beforeand
afterdesulfation
2.2 脱硫酸酯
F和F32经Nagasawa法处理后,硫酸基含量均小于0.5%,说明脱硫比较彻底。红外光谱显示(图2),F在1258cm-1,F32在1264cm-1的吸收峰均消失,说明这一区间的红外吸收的确能反映硫酸基含
量的高低。但是,F在836cm-1,F32在833cm-1的吸收峰却没有消失,而是发生了不同的变化。F在836cm-1由脱硫前宽而弱的吸收变成了脱硫后尖而较强的吸收,而F32在833cm-1的吸收变弱,且偏移
至829cm-1。脱硫后820～850cm-1的峰发生了变化,但并没有消失,说明在此区间除了OS振动外,还有其他类型的吸收。通常认为,糖端基的H弯曲振动出现在这一区域,如α2D2半乳吡喃糖在810～839cm-1有特征吸收。因此,尽管没有了O
S振动的吸收,但糖端基的O
H弯曲振动依然
存在,所以此处的峰没有消失,只是形状和强度发生了改变。
Lloyd指出,如果糖的平伏羟基结合有硫酸酯,则S的振动出现在820cm-1,如果糖的垂直
羟基结合有硫酸酯,则置[1]。但是由于糖端基的2.3 硫酸基对碱的稳定性
S的振动出现在850cm-1,由此就可以从红外光谱来判断硫酸基的位H弯曲振动也出现在这一区域,对前者会产生干扰,因而仅凭红外光谱来
判断硫酸基的位置就不太可靠。
Rees指出,硫酸基对碱的稳定性能反映它在糖中所处的位置。若硫酸基位于糖的垂直羟基位置,则
对碱的稳定性好,若位于平伏羟基,则对碱的稳定性差[4]。F32经碱处理后,硫酸基含量基本未变(23.4%降至22.6%),表明硫酸基对碱稳定,绝大部分的硫酸基位于垂直羟基位置。但如果根据红外光谱判断硫酸基的位置,由于833cm-1更接近820cm-1,所以大部分的硫酸基应位于平伏羟基位置。二者得出的结论截然相反。因此,由红外光谱得出的结论有可能是错误的。2.4 甲基化分析
通过比较脱硫前后硫酸酯多糖的甲基化产物,可以推知硫酸基在单糖残基中所处的位置。F32脱硫前后的甲基化分析结果见表1。
根据表1的结果可以推知,fucose(甲基戊糖)的2、3、4位羟基均接合有硫酸基,并且有些fucose同时接合了2个硫酸基。己糖(mannose和galactose)的硫酸基大部分位于6位,少数位于3和4位,并有少量
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第5期李 波等:硫酸酯多糖结构中硫酸基位置的判断第20卷
的己糖同时接合了2个硫酸基。甲基化分析表明,F32中硫酸基位置的分布比较复杂,己糖的硫酸基大部
分位于垂直位置(6位),而fucose的硫酸基在垂直位置(4位)和平伏位置(2位和3位)均有存在。
Table1 MethylationanalysesofF32andDSF32
SugarFucose
Positionofmethylation2,3,42,32,43,423-Mannose
3,4,62,3,43,42,4632
Galactose
Linkagetype11,41,31,21,3,41,2,41,2,3,41,21,61,2,61,3,61,2,3,41,2,4,61,3,4,61,2,3,4,611,2,31,3,41,2,3,6F32(mol%)4.436.161.455.065.248.8111.621.222.67
DSF32(mol%)19.924.554.361.340.720.820.7110.907.382.480.442.47
22
2,3,4,64,62,64228.191.284.011.463.811.454.731.6210.5822222.213.1720.32220.81参考文献:
[1] LloydAGetal.Biochim.Biophys.Acta[J],1961,46:108.[2] KariyaYetal.Carbo.Res.[J],1997,297:273.
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[5] NeedsPWandSelvendranRR.Carbo.Res.[J],1993,245:1.
DeterminationofthePositionofSulphateGroupin
SulphatedPolysaccharides
LIBo13,GUXiao2hong2,XUShi2ying1
(1.SchoolofFoodScienceandTechnology,SouthernYangtzeUniversity,Wuxi,Jiangsu214036;
2.AnalysisCenterofSouthernYangtzeUniversity,Wuxi,Jiangsu214036)
Abstract:ThepositionofsulphategroupinfucoidanfromthebrownseaweedSargassumfusiformewasstudiedbyinfrared,desulphation,stabilityofsulphateesterstoalkali,andmethylationanalysis.TheresultsshowedbesidestheO
Svibrationin820～850cm-1region,therewasalsoHbendingvibration
ofsugarreducingend,whichaffectedthejudgmentonthepositionofsulphategroup.Sointhestructuralstudiesofsulphatedpolysaccharides,errorconclusionwouldbeobtainedifthepositionofsulphategroupisdeterminedonlybytheinfraredanalysis.Itisnecessarytosynthesizetheresultsofinfrared,stabilityofsulphateesterstoalkali,andmethylationanalysisifthecorrectconclusionwanttobeacquired.Keywords:Infraredspectrum;Sulphatedpolysaccharides;Methylationanalysis;Structure500