分离纯化中蛋白质的不稳定性及其对策

5生物工程进展62000, Vol. 20, No. 3

分离纯化中蛋白质的不稳定性及其对策

冯小黎 金业涛 苏志国

*

(中科院遗传所人类基因组中心, 北京 100101)

(*中科院化工冶金研究所生化工程国家重点实验室, 北京 100080)

摘要 分离纯化出高纯度有生物活性的蛋白质一直是一项艰巨的工作。在基因工程药物蛋白质的生产中, 收率低和纯度低是亟待解决的关键问题。这里除了生物组份复杂、难以分离外, 许多目标蛋白质自身活性的丧失也是一个重要原因。由于药物蛋白质昂贵的市场价格, 回收率稍有提高就有可能带来巨大的经济效益, 所以, 有关蛋白质在分离纯化中的失活及其对策在近年来受到了极大的关注。1997年第十届欧洲生物技术大会上, 蛋白质的稳定被单独列为一个专题。1999年在加拿大召开的第九届生物产品回收技术会议也对蛋白质的稳定性进行讨论。目前重点探索的是蛋白质失活的机制, 采取相应的对策以保护活性, 并在分离纯化中采用高效的分离纯化技术缩短操作周期, 提高产物的活性回收率。关键词 蛋白质 稳定性 分离纯化

可能导致失活, 主要的机制有:

1) 1聚集(有时伴随分子和分子间二硫键的形成)

2) 1酶失去辅酶

3) 1寡聚蛋白质解离成单体4) 1吸附于容器表面

5) 1不正确的折叠形式或形成错配的二硫键从动力学上讲, 蛋白质在提纯过程中活性的丧失可能是由天然状态N 经过一系列相对稳定的中间态U 1, U 2... 而最终达到变性状态D [3]:

N

1

2

,

一些蛋白质处于中间状态时仍具有部分活性, 是一个可逆过程, 而成为变性态则有的是可逆的, 有的是不可逆的。

111 蛋白质结构中影响稳定性的重要因素

疏水相互作用对维持蛋白质的天然结构起重要

1) 1肽键的酸水解和酶水解(在Asp 的羧基侧链上最迅速)

2) 1Cys 、Trp 、Met 的氧化

3) 1二硫键被还原, 伴随B ) 消失和) SH 形成4) 1巯基与金属离子作用, 形成硫醇盐5) 1Asn 和Gln 脱酰胺作用6) 1氨基酸的消旋作用7) 1Pro 的异构化

21如果一级结构没有变化, 三级或四级结构变化也

的乃至决定性的作用[4]。Yatani 等人证实蛋白质的稳定性与疏水性之间在一定的关系。而疏水性取决于蛋白质分子内部疏水性氨基酸的个数[5]。Mozhave 等分析了嗜热酶的稳定性为什么比中温酶稳定性高的原因, 结果表明[6], 嗜热酶分子内部疏水性氨基酸含量高, 具有更紧密的疏水核。

氢键和离子键对稳定性也有作用。Pace 等人发现[7], 氢键对小分子蛋白质具有与疏水作用相同的甚至更高的稳定作用[8]。许多研究者证实[9]嗜

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1 蛋白质失活的机制

蛋白质的三维结构是由疏水相互作用、静电相互作用、氢键、范德华力这些弱相互作用力及二硫键所维持的。它们的稳定自由能$Gstab 一般低于60KJ/mol,构象稳定性很低[1]。在分离提纯过程中, 搅拌、升温、pH 变化、盐浓度变化、添加表面活性剂或有机溶剂等是分离提纯难以避免的结果和所必需的操作, 但这些结果和操作对大部分蛋白质都有造成结构变化的可能。甚至目标蛋白质自身浓度的变化也有可能造成三维结构的变化, 导致失活。失活的蛋白质就成为杂质, 不仅无用, 还可能有毒。在分离提纯中蛋白质发生失活的机制有多种, 概括起来有:

11一级结构被破坏, 导致三维结构的变化, 造成失活:

热酶复杂结构中具有更多的盐桥。但是对一个球蛋白来说, 平均150个氨基酸残基中只有一个盐桥处于内部, 其它都在分子表面。因此, 参与稳定蛋白质的可能是处于分子表面的那些离子键[10]。

蛋白质分子内二硫键数量的增加将提高蛋白质的稳定性[8, 9]。此外, Ca 2+、Mg 2+、Zn 2+和其他一些离子对某些蛋白质尤其是嗜热酶能起稳定作用。这种稳定作用是通过阳离子与蛋白球体中不稳定部分的结构而获得的, 特别是与多肽链弯曲处的结合使蛋白质的总体结构更紧密、结实[11]。Hinz 等人认为短距离范德华力对形成紧密堆积的核有很大贡易发生消旋, 因此Asn 的消旋作用也不容忽视。

pH 的变化对蛋白质的活性有很大的影响, 即使很小的变化(1-2pH 单位) 也可能造成以前不带电的基团离子化或使原来带电的基团去离子化, 从而使已折叠的构象不稳定。剧烈的pH 变化则使易被酸或碱破坏的键断裂。11212 蛋白质的物理不稳定性

温度是影响蛋白质稳定性最重要的因素。细胞机械破碎、错流式膜过滤等操作必然有升温的问题, 有可能造成蛋白质的热变性。一般而言, 大多数蛋白质在0-4e 之间较稳定。大多数的热变性都是献

[8]

。

112环境因素对蛋白质稳定性的影响

通常, 蛋白质在其天然细胞或体液环境中是最

稳定的。但是在分离纯化过程中, 原来所存在的稳定环境如氧化还原势、结合蛋白、折叠酶、分子伴侣、稳定因子和膜等在纯化过程中不复存在。失活的可能性大增加。此外, 蛋白质在提纯过程中其浓度与体内天然的不同。因此, 环境因素是造成蛋白质在分离纯化中不稳定的一个重要因素。

11211 蛋白质的化学不稳定性

在一定溶液条件下蛋白质的一些基团会发生化学反应。脱氨基[12]和氧化[13]是两个最常观察到的现象。Met 、Cys 、His 、Trp 及Tyr 由于与各种活泼氧具有很高的反应性易受到氧化。这些氧化过程受过渡金属离子的催化和光的诱发, 还受到pH 、温度及缓冲液组成的影响。此外, 蛋白质分子还可与空气在无催化剂的情况下发生自动氧化, 只不过此种氧化反应进行得十分缓慢。

造成蛋白质不稳定的Asn 和Gln 的脱酰胺是发生在分子内的非酶催化过程。在生理条件下, Asn 和Gln 即会脱酰胺形成琥珀酰亚胺五元环中间产物, 又会进一步水解、异构和消旋, 这三种作用常同时发生, 其结果导致蛋白质功能改变、亚基解离、蛋白酶水解性改变等[14]。

Pro 是一种亚氨基酸, 有一个刚性的五元环。位于Pro 的肽键易发生顺-反异构化。这种转变在0e 的半转变时间为20min, 但以每10e 增加313倍速率加速。因此, 当升温时Pro 异构化将会破坏多肽链的构象并阻止正确的折叠

[15]

。

氨基酸消旋在酶热失活中是一个原因[14]

。但一

般来说, 如果易消旋氨基酸如Asp 含量很低, 其对蛋白质热稳定性的影响可不加以考虑。Geiger 等人发现[14], Asn 脱酰胺形成的五元琥珀酰亚胺中间产物更68

不可逆的[3]。一些蛋白质对溶液的冻融很敏感[16]。

在对溶解度的研究中发现, 随着温度的降低, 疏水相互作用及静电相互作用减弱, 氢键增强。高的电解质浓度将强化疏水相互作用。在pH 过高或过低的情况下, 静电排斥作用和具异常pK 值基团的暴露将控制分子之间弱相互作用的变化[17]

。

蛋白质对泡沫的敏感性也是分离纯化中一个值

得注意的问题

[18]

, 当然泡沫分离法已是一种生化分

离技术。泡沫所具有的表面张力对一些蛋白质的构象具有破坏作用, 泡沫所提供的非常大的表面将使得空气氧化作用扩大。从这个意义上讲, 任何表面活性剂对蛋白质都有不同程度的破坏作用。较强的机械搅拌不仅能使蛋白质溶液形成泡沫, 而且搅拌所形成的剪切对蛋白质构象也会产生严重的破坏作用。

蛋白质的器壁吸附现象是其分离纯化及保存过程中经常遇到的问题, 稀蛋白质溶液更易发生吸附, 这个现象几乎在蛋白质与固相表面接触的同时即会发生, 最大量的吸附往往发生在蛋白质的等电点附近[19]。吸附受到器壁表面性质、蛋白质性质及溶液条件的影响, 其中最主要的影响因素是表面能量。因此, 疏水表面往往较亲水表面吸附更多的蛋白质。吸附过程中蛋白质分子会发生结构重排, 即会有变性现象发生, 这种变性分可逆与不可逆两种, 大多数蛋白质与聚苯乙烯的吸附即是不可逆的[19]。11213 蛋白质的生物不稳定性

在蛋白质失活的众多原因中, 肽键自身的断裂也是十分重要的。由蛋白水解酶所造成的肽键断裂是分离纯化过程中蛋白质失活的一个主要原因

[3]

。

在许多情况下, 天然蛋白质仅受到蛋白酶的缓慢水解, 而部分变性的解折叠蛋白质则增大了蛋白水解酶水解的可能性。微生物的污染极有可能给分离纯化系统带入蛋白酶。蛋白酶除了造成对肽键的破坏

外, 在高温水溶液条件下还会造成Asp 的肽水解、Gln 和Asn 侧链的脱氨基、Cys 侧链的B 2去除及二硫键交换, 从而对肽链再折叠产生极其严重的影响[20]。

2 分离纯化过程中蛋白质不稳定性的对策

文献上已有很多用蛋白质工程、化学修饰、交联、固定化等稳定蛋白质的方法[6,21, 22], 本文侧重在蛋白质分离提纯过程中如何保持其稳定性进行综述。

211 添加蛋白质稳定剂

21112 蛋白质

除了共溶剂作为蛋白质的稳定剂外, 血清白蛋白由于稳定性和溶解性好, 常常被用作蛋白质的稳定剂, 即作为保护蛋白。此外, 研究者还发现白蛋白具有阻止蛋白质吸附于容器表面的功能[27]。但是, 由于白蛋白能与一些分子相结合, 使用时也需谨慎。事实上添加蛋白质作为保护剂已降低了蛋白质的纯度。

21113 抗氧化保护剂和还原剂

抗氧化的保护剂包括抗氧化剂、金属螯合剂和其他一些试剂[13]。抗氧化剂的选择需根据所涉及21111 共溶剂

糖类、多元醇、氨基酸及其衍生物、无机盐、甘油、多聚物如聚乙二醇(PEG) 等一般被称为蛋白质的共溶剂。生化学家常常使用高浓度(1-4mol) 共溶剂来稳定蛋白质或细胞器。过去, 其稳定机理一直被认为是在蛋白质分子表面形成一个保护壳。近几年来的研究表明, 共溶剂对蛋白质的保护作用机制实际上是共溶剂的加入改变了溶液的热力学性质, 使得天然蛋白质的稳定性得到增强, 理论上称优先排阻作用[23]。

共溶剂从蛋白质表面的优先排阻并不是说共溶剂分子绝对不能渗透到蛋白质表面并与之结合, 而是在蛋白质表面完全水化和共溶剂完全结合之间建立起一种平衡[23]。

在这些共溶剂的应用中, 应根据共溶剂与蛋白质的相互作用的不同来加以选择。糖类是蛋白质在溶液中的和在干燥状态下的最好的稳定剂

[24]

。甘

油和多元醇则除了对蛋白质的非极性表面有很好的稳定作用外, 还能诱导蛋白亚基的自我聚合并具有减轻器壁吸附和防冻的作用[25]。氨基酸和盐由于它们的离子化特性与蛋白质的静电相互作用, 它们的使用需慎重。氨基酸由于具有两性性质, 在使用中需注意其pH 局限性。此外, 具有稳定作用的氨基酸仅有几种, 疏水性较强的氨基酸则不具稳定功能[26]。聚乙二醇(PEG) 由于具有疏水性及亲水性双重性质, 较适于稳定单分散状态的非均质蛋白质。只不过当温度升高时, 有可能促进蛋白质的解折叠

[23]

。

近年来, 一些研究者发现混合使用共溶剂可大大提高稳定效果。Carpenter 等人

[26]

发现低浓度葡

萄糖及海藻糖与1%PEG 合用可大大增强蛋白质的稳定性, 其效果远大于它们各自稳定能力之和。另一个发展方向是寻找新的或改进已有的稳定剂。

的氧化机制, 一些氧化剂如亚硫酸氢盐由于能与蛋白质发生反应不宜选用。当蛋白质溶液中存在痕量的金属离子时, 抗氧化剂的添加不仅不能阻止蛋白质的氧化, 反而加速了氧化反应。医学上常用的螯合剂EDTA 、柠檬酸、许多氨基酸、弱磷酸和酒石酸等, 都能有效地除去氧化的催化剂) ) ) 金属离子。特殊情况下, 如EDTA 2Fe (Ó) 则会加速氧化反应[28]。此外, 高浓度的糖类及多元醇都能有效的防止氧化; 溶液脱气也是防氧化的一个有效措施[3]。在分离纯化过程中, 加入一定的光吸收物质可有效防止光氧化的发生。

一些蛋白质尤其是表面含半胱氨酸, Cys 易被空气中的氧缓慢氧化为次磺酸或二硫化物, 使蛋白质的电荷或形状改变而失活, 加入半胱氨酸、2-巯基乙醇、还原谷胱甘肽、二巯基苏糖醇和二巯基赤糖醇等巯基试剂于缓冲溶液中可防止这种破坏。但这些试剂破坏二硫键并导致蛋白质的聚集, 使用时需十分小心[21]。此外, 巯基酶除易氧化外还常与重金属(如Fe, Mn, Cu 等) 结合而失活, 加入微量的EDTA 、Na 2S 等可以防止巯基酶的失活。21114 底物、辅酶和活化离子

某些酶可被底物、辅酶、竞争性抑制剂、反应产物等所稳定, 在分离纯化中对不稳定的酶加入这些物质可增加稳定性。添加活化离子如Ca 2+也能增加某些酶的稳定性

[29]

, 这种结合很强且具有特异

性, 所需的浓度也很低(5mM) 。Ca 2+

与这些蛋白质

的结合相似于与底物结合, 涉及蛋白质链中许多不同位置上的氨基酸, 这种多位点交联使得蛋白质分子成为更紧密的活性形式。与Ca 2+螯合的基团通常是Asp 及Glu 的羧基侧链, Ca 2+离子的移去将会形成局部高浓度负电区, 从而使蛋白质不稳定。21115 磷脂和脂肪酸

早在1946年Boyer 等人[30]就检测到脂肪酸可

69

增加血清白蛋白的热稳定性, 直链长为7到8个碳时具最大的稳定效果。80年代, 许多研究者又进一步证实了这一点, 但不是任何磷脂都具有这种保护性。

21116 蛋白酶抑制剂

在提取纯化蛋白质时, 其纯化效果常受本身存在的水解酶的影响, 一旦条件适宜, 就会发生水解反应。为了防止这个问题的发生, 必须小心地采用加入抑制剂或调节抽提液的pH 、离子强度或极性等。前面提到的一些共溶剂如甘油、糖、PEG 等也可有效降低蛋白酶的水解作用[21]

气以避免巯基的氧化和减少光的氧化。21213 避免蛋白酶水解和微生物污染

低温操作是减少蛋白酶水解的有效措施, 也可以加入一些蛋白酶抑制剂。溶酶体是蛋白酶的主要来源, 在有这类细胞器存在时, 加入蔗糖或甘露糖能稳定溶酶体膜并减少蛋白酶的释放。

在防止蛋白酶水解的同时, 应注意防止微生物的污染, 因为许多蛋白酶是由微生物产生的[3]。微生物的污染还会带进一些杂质甚至是毒素。目前层析所用的介质还多为多糖类物质, 是微生物的良好营养物质。在提纯过程中如不注意防菌, 将有可能。

212 优化操作条件

胞内蛋白质一旦从它的天然环境中释放出来就会受到许多失活条件的影响, 在提纯过程中存在大量的因素使蛋白质失活。在细胞内, pH 值大约保持在pH615-pH 715; 蛋白质的浓度很高(大约

100mg/ml) ; 还原势也很高。而当细胞破碎后, 蛋白质浓度会大大降低, 并且蛋白质处于一个氧化环境中。对于组织中的蛋白质而言, 破碎还会造成细胞器的破裂, 尤其是溶酶体的破裂将会释放大量的蛋白酶并使溶液酸化。提纯过程中选择合适的缓冲溶液或采取适当的措施将有可能降低目标蛋白质的变性、失活和/或蛋白酶的水解。21211 提供温和的操作条件

极端pH 、温度和有机溶剂是蛋白质变性的主要原因。由于蛋白质在胞内处于中性环境中, pH 6-pH 8的缓冲溶液可有效防止pH 变性。大多数蛋白质在很宽的pH 范围内(pH5-9或更大) 保持稳定。但在实验中仍需对目标蛋白的pH 稳定性进行研究。虽然室温下仅少数蛋白质发生变性, 如有条件最好在低温(4e ) 下操作, 高于40e 的操作温度一般应避免使用, 除非该蛋白质属于热稳定蛋白质。其它应避免的还有有机溶剂和变性剂(如盐酸胍和脲) 。当目标蛋白质抗这些变性剂时, 也可以利用这点把其它杂质除去。有机溶剂作为沉淀剂时必须在低温下操作。蛋白质对剪切力并不是十分敏感, 但当空气存在时在气-液接触面剪切力将具有变性效应。因此, 纯化用溶液最好进行脱气或纯化中应避免使用过大的剪切力。21212 避免氧化失活

应注意提纯过程的避光尤其是避免日光的直接照射。光氧化会造成蛋白质的变性或失活。强烈的紫外光和离子辐射都会导致键的断裂和蛋白质活性的丧失。对于有的蛋白质, 在提纯过程中则需要脱70

减少介质的使用寿命。定期用015-1M 的NaOH 进行层析柱的消毒有可能基本杜绝微生物和热源的污染。此外, 在提纯过程中还可通过过滤来除菌或在低温下操作以抑制微生物尤其是细菌的生长。添加抑菌剂也是可行的, 但在使用时需十分谨慎, 因为某些抑菌剂修饰蛋白质而使其失活。

213 减少纯化步骤或进行纯化的过程集成

减少纯化步骤或进行纯化的过程集成是减少成本并减少环境因素所造成的不利影响的有效措施。利用已有的和新近开发的生化分离技术将下游过程的有关单元进行有效组合, 使分离工艺简单、快速, 各步骤之间紧密联系, 不需要对物料加以处理或调整; 或把两种以上的分离技术合为一种更快、更有效的分离技术, 如亲和双水相萃取、扩张床层析、亲和膜等, 都是减少目标产品失活、提高产率的有效途径。

最后要指出的是, 虽然对蛋白质的结构和失活机制已有了许多了解, 但必须具体问题具体分析。每一种蛋白质应有自己独特的保护方法。利用目标蛋白质的某一稳定性, 也可以发展快速、有效的分离工艺。例如, 利用目标产物热稳定性好这一特性, 可以用加热除去大量杂质。此外, 蛋白质稳定性是千差万变的, 自由能几千卡/mol 的变化就会造成蛋白质稳定或不稳定的差别。有时甚至在氨基酸组成或顺序上极微小的变化也会大大影响蛋白质的差别。在分离提纯中, 不仅要关注产品的高均一性和纯度, 也要关注目标蛋白不稳定形式的存在。如果能用某种技术, 使得失活的目标产物复性, 也是对蛋白质分离纯化的重要贡献。

注:本工作得到国家自然科学基金的资助(项目编号:29525609, 29736180)

参考文献

[1]Pace, C. N. , T rends B iochem. Sci. 1990, 15:14-17,

[2]Mozhave, V. V. , Trends B iotech. , 1993, 11:88-95 [3]Gray, C. J. , 1993, in Recovery Proces ses B iol. Mater.

(Kennedy, J. F. eds. ) , Chichester, UK, Wiley, 11-45

[4]Shulz, G. E. and Schirmer, R. H. , 1979, Principles of Protein

Structure, New York 2Heidel berg 2Berlin

[5]Yatani, K. et al. , J. Biochem. (Tokyo) , 1980, 87:117-121 [6]Mozhaev, V. V. and Martinek, K. , Enzyme Microb. Tech 2

nol. , 1984, 6:50-59

[7]Pace, C. N. et al. , Angew Chem. Int. Ed. Engl. , 1991, 30:

343-360

[8]H i nz, H. 2J. et al. , Pure &Appl. Chem. , 1993, 65:947-952

[9]Sundaram, T. K. et al. Arch. Biochim. Bi ophys. , 1980, 199:

515-525

[10]B arlow, D. J. T homton, J. M. , J. Mol. B iol. , 1983, 168:867

-885

[11]Dahlquist, F. W. et al. Biochem. , 1976, 15:1103-1111 [12]Kossiakoff, A. A. , Science, 1988, 240:191-194

[13]Wetzel, R. et al. in /Protei n Design and the Development of

New Therapeutics and Vaccines (Hook, J. B. and Poste, G. eds. ) 0, New York, Plenum, 1990, PP. 79-83

[14]Geiger, T, Clarke, S. , J. Biol. Chem. , 1987, 262:785-794

[15]Creighton, T. E. , Proteins:Structures an d Molecular Proper 2

ties, New York, W. H. Freeman, 1993, 311-318

[16]Choth i a, M. , J. Mol. B iol. , 1973, 75:295-299

[17]Creighton, T. E. , Curr. Opi n. Struct. Biol. , 1991, 1:5-11 [18]Vallee, B . L. , Riordan, J. F. , Ann. Rev. Biochem. , 1969,

38:733-783

[19]Wahlgren, M, Arnebrant, T. , Trends in Biotech. , 1991, 9:

201-208

[20]Zale, E. , Klibanov, A. M. , Bi ochem. , 1986, 25:5432-5438

[21]Fagain, C. , O . Kennedy, R. , Biotechnol. Adv. , 1991, 9:

351-409

[22]Fagain, C. O. , B iochem. Bi ophys. Acta. , 1995, 1252:1-14 [23]Timasheff, S. N. , in, /Stability of Protein Pharmaceuticals

Part B(Ah ern, T. J. and Manning, M. C. eds. ) 0, New York, Plenum Press, 1992, 265-285

[24]Crowe, J. H. et al. , Cryobiology, 1990, 27:219-231 [25]Lee, J. C. , Timasheff, S. N. , B iochem. , 1977, 16:1754-1764

[26]Carpenter, J. F. , Studies, C. , Arch. B iochem. Biophys. ,

1993, 303:456-464

[27]Wang, Y. J. , Chien, Y. :Sterile Pharmaceutical Packaging:

Compati bility and Stability, Ph i ladelphia, Parenteral Drug As 2sociati on, Inc. , 1984

[28]Li, S. et al. Pharm. Res. , 1993, 10:1572-1579 [29]Gray, C. J. , Bi ocatalysis, 1988, 1:187-196

[30]Boyer, P. D. et al. , J. B iol. Chem. , 1946, 162:181-191

Instability of Proteins During Bioseparation and The

Strategy For Anti 2denaturation Feng Xiaoli Jin Yetao Su Zhiguo

*

(Human Genom e Research Center, Institute of Genetics, Chinese Academ y of Sciences, B eiji ng 100101)

(*State Key Laboratory of B iochem i cal Engineering, Insti tute of Chemical Metallurgy, Chinese Academy of Sci ences, B eiji ng 100080, China)

Abstr act Denaturation of proteins during bioseparation is a serious problem in biotechnology industry. The understanding of denaturation mechanism receives more and more research attention. Several factors influence the stability of proteins, including the internal structure and the environmental factors. Approaches to stabilize proteins against denaturation were discussed. Additions of stabilization reagents, utilization of mild separation conditions and inhibitions of protease activities are the current methods that proved to be useful. In addition, re 2ducing the number of steps and integration of the process are also important.

Key words Proteins, Stability, Separation and purification

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