土壤放线菌的培养与观察
土壤放线菌的培养与观察
一、实验目的
1. 学会选择放线菌采样点并合理取样；
2. 掌握高氏一号培养基的配制方法；
3. 学习分离纯化放线菌的基本操作技术，掌握微生物培养方法以及接种技术，学会放线菌纯培养的确定；
4. 学会使用高压蒸汽灭菌锅、显微成像系统等实验仪器设备；
5. 培养并学习微生物实验的一般思维及方法。
二、 实验原理
放线菌是指能形成分枝或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌，主要的分布源是土壤，链霉菌是其优势菌群。
土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性分布的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。本实验将采用高氏1号培养基从土壤中分离放线菌。
三、实验器材
1.高氏1号培养基的配制：
试剂：可溶性淀粉：20g，KNO3：1g，NaCl：0.5g，K2HPO4•3H2O： 0.5g，MgSO4•7H2O：0.5g，FeSO4•7H2O：0.01g，琼脂：20g，水：1000mL，pH试纸（调节至7.2—7.4）。 方法：先用少量水将淀粉溶入烧杯中，搅拌至完全溶解，再依次加入其他成分进行溶解，最后加水至1000mL。调节pH 7.2～7.4，加入琼脂，搅拌至完全溶解。待用。
2. 仪器及其它用品
小铲，25.mL三角锥形瓶，250mL烧杯，药勺，无菌培养皿，剩9mL无菌水试管5支，盛45mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，无菌玻璃珠，接种环，酒精灯，称量纸，高压蒸汽灭菌器，超净工作台，培养皿，移液器，分析天平，恒温震荡仪，微波炉显微成像系统，。
四、实验步骤与方法
1. 土壤取样
放线菌主要分布在土壤中，研究表明，原生林等原生环境中放线菌的多样性很丰富，另外，在极端环境如高盐、要酸碱、高低温、高辐射等地方也存在许多未知的放线菌。由于条件的限制，本实验取学校体育馆附近原生林土壤（树木下）作为土样。
2.仪器灭菌
将培养基溶液的三角瓶用报纸包扎好、试管、三角锥瓶，玻璃珠放到高压灭菌锅进行高温蒸汽灭菌。
3. 制备土壤稀释液
称取土样5g，放入盛45ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，用震荡仪恒温振摇约20分钟，使土样与水充分混合，将细胞分散，即配制成10-1土壤溶液。用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液注入盛有9ml无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀。然后再用一支1ml无菌吸管从此试管中吸取1ml注入另一盛有9ml无菌水的试管中，以此类推制成10-3、10-4各种稀释度的土壤溶液。
4．培养基的制备
（1）倒平板
将配制好的高氏1号琼脂培养基于高压蒸汽灭菌锅中高温消毒灭菌，待冷却至55—60℃时，往高氏1号培养基中加入1ml的0.5%重铬酸钾, 然后分别倒平板。方法是在超净工作台，右手持盛培养基的三角烧瓶，置火焰旁边，左手拿平皿并松动瓶塞，用手掌边缘和小指、无
名指夹住拔出。令三角瓶瓶口在火焰上灭菌，左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养液约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待冷凝后即成平板。共制备6个平板（一个稀释度做3个平行样品）。
（2）取样
在6个平板底面分别用记号笔写上10-3和10-4两种稀释度，然后用3支1ml无菌吸管分别由稀释度为10-3和10-4土壤稀释液中吸取0.2ml对号放入已写好稀释度的平板中，各加入几个已灭菌的玻璃珠，轻轻晃动，涂布均匀，然后将玻璃珠取出。将平板倒置于28℃恒温室中培养7日。
不要用1mL吸管每次吸取0.2mL稀释菌液到平板中，这样容易加大同一稀释度几个平行平板间的误差；
（3）平板画线分离法分离放线菌
目的是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。
将蘸有菌种的接种环在平板培养基上做以Z字行划线，每划完一次要充分燃烧接种环烧掉残余微生物，再从上一次划线处末点开始下一次划线。
划线完毕后盖上培养皿盖，倒置与恒温箱中培养。
（4）用结晶紫对菌体涂片染色完成后，在显微成像系统下观察放线菌个体形态