大血藤黑斑病的病原鉴定与生物防治-毕业论文

学科代码： 学 号：070401 2009407054本科毕业论文（设计）题目：大血藤黑斑病的病原鉴定与生物防治学 专 班院： 业： 级：环境与生命科学学院 生物科学＿ 2009 级 ＿＿学生姓名： 指导教师：＿ ＿ ＿＿2013 年 月 日目录 目录.................................................................................................................................I 摘要............................................................................................................................... II Abstract ........................................................................................ 错误！未定义书签。 Keywords ...................................................................................................................... II 0 前言............................................................................................................................ 1 1 材料与方法................................................................................................................ 1 1.1 材料来源................................................................................................................ 1 1.2 菌种来源................................................................................................................. 1 1.3 培养基.................................................................................................................... 1 1.4 试剂........................................................................................................................ 1 1.5 仪器设备................................................................................................................ 2 2 实验方法.................................................................................................................... 2 2.1 病症的观察与描述................................................................................................ 2 2.2 显微镜检查............................................................................................................ 2 2.3 病原菌的分离与培养............................................................................................ 2 2.4 病原菌的鉴定........................................................................................................ 2 3 结果与分析................................................................................................................ 2 3.1 病症的观察与描述................................................................................................ 2 3.2 病原菌的培养性状及形态.................................................................................... 3 3.3 显微镜的镜检及病原鉴定.................................................................................... 3 4 讨论与结论................................................................................................................ 4 参考文献........................................................................................................................ 6 致谢................................................................................................................................ 8I大血藤黑斑病的病原鉴定与生物防治吴胜杰 （凯里学院环境与生命科学学院，556011） 摘要：本文通过对大血藤（Sargentodoxa cuneata）病症的观察，采用组织分离 法分离得到病原菌，通过对病原菌的菌落的形态特征的观察和孢子的大小的测 定， 鉴定出引起凯里市大血藤病害的是黑斑病， 其病原菌为链格抱属(AlternariaNeesex Fr.)，其孢子多数为多隔袍链格袍。本文针对大血藤黑斑病选择了三种枯草芽苞杆菌(Bacillus sp.)制剂进行生物防治实验，比较它们的抑菌效果, 结 果显示：枯草芽孢杆菌 F1 制剂对这种病菌的防治效果最好，其次是 F18，F2 防 治效果最差。 关键词：大血藤；黑斑病；生物防治；链格袍属；枯草芽苞杆菌Disease Research and Pathogen Identification of Black Spot Disease of Sargentodoxa cuneataWu Shengjie (Department of Environment & Biological Science, Kai li College, 556011) Abstract: In this artical Sargentodoxa cuneata disease was observed and thepathogen were isolatied using tissue surface isolation method , Sargentodoxa cuneata disease was determined by the size of the observation of the morphological characteristics of the colonies of pathogens and spores, Kaili City cuneatathe disease is black spot, and its pathogens Chains hold the genus (Alternaria Neesex Fr.) the majority of its spores for the multi-compartment gowns chain grid gowns. In This article three hay buds bacillus (Bacillus sp.) was selected for biological control experiment of Sargentodoxa black spot diease and their antibacterial effect was compared,the reasult showed:the control effect of Bacillus subtilis F1 preparationfor this pathogen was the best, followed F18, and the F2 prevention was the worst . Keywords: cuneata; black spot; biological control; chain grid gowns are; buds subtilis bacteriaII0 前言大血藤（Sargentodoxa cuneata）为大血藤科大血藤属落叶木质藤本，是我国 比较古老、原始的特有植物[1]，是亚热带（西南地区）落叶阔叶林的代表树种， 主要生长在贵州、四川、江西、河南、安徽等地的山坡疏林、溪边，现已有栽培[2]。中药以藤茎为主，有活血通经、清热解毒及祛风除湿等功效，可以治疗经闭痛经、肠痈腹痛、跌打扑痛、风湿痹痛[3]。大血藤中含有多种酚类及酚苷类化合 物，大黄素甲醚(physcion)，大黄素(emodin)，原儿茶酸(protocatechuic acid)，大 黄酚(chrysophanol)，β-谷甾醇(β-sitosterol)，香草酸(vanillicacid)和红藤多糖等活 性成分[4-5]。 黑斑病是危害植物普通病害，对多种植物有严重的危害作用，危害范 围广，遍及世界各地，我国近几年更为严重 [6] ；危害程度重，一旦植株感染 上，就会迅速蔓延至整个植株，甚至传染到相邻的植株 [7] ；黑斑病不仅影响 植物本身的生长发育，严重的降低了农作物和中药的品质，造成巨大的经 济损失 [8] ，还对人体健康产生危害 [9] 。黑斑病多发生于温暖潮湿的多雨季节[10]，贵州黔东南州一年四季都是潮湿多雨 气候 [11] ，随着黔东南州大血藤种植面积的扩大，黑斑病已经成为大血藤病害的主要病害之一。因此，本文 对大血藤进行初步的病害分析，简要提出对大血藤黑斑病的防治措施，以期 为贵州省黔东南州大血藤病害具有一定的参考价值。 1 材料与方法 1.1 材料来源 在贵州省黔东南苗族侗族自治州锦屏县启蒙镇玉泉村采集大血藤病害组织 叶，将其放入保鲜袋内备用。 1.2 菌种来源 将采集来的大血藤病叶通过组织分离法分离实验分离获得 [12] 。 1.3 培养基[2,12,13-14]PSA 培养基：马铃薯 200 g ，洗净、去皮、切碎，加水 1000 ml 煮沸 30 min， 过滤； 在滤液中加入蔗糖 10 ～ 20 g 和琼脂 17～ 20 g， 溶解后趁热过滤； 将溶液分装到试管和三角瓶中； 121 ℃高温灭菌 20 min 冷却备用。 1.4 试剂[2,12,13-14]175%乙醇、0.1%升汞、链霉素、无菌水。 1.5 仪器设备[2,12,13-14] 恒温培养箱、电磁炉、高压蒸汽灭菌锅、微波炉、光学显微镜、目镜测微尺、 冰箱及其他实验仪器。 2 实验方法 2.1 病症的观察与描述 观察病害组织的病斑形态、病斑大小、病斑颜色等特征，并详细记录与进行 拍照。 2.2 显微镜检查[2,12,13-14] 显微镜检查分为真菌病害标本和病原菌的显微镜检查两个方面， 观察菌落的 形态结构、菌落的大小、菌落的颜色等特征，并对菌丝是否分支、是否有隔等特 征进行显微观察。同时，对部分病菌在多媒体教室数码显微镜下拍摄照片，进行 记录。 2.3 病原菌的分离与培养[2,12,13-14] 组织分离法分离大血藤的病叶得到病原菌。切取病健交界处的叶组织 2-4 mm 的小块，置于 70%乙醇中浸 2 s，后移入 0.1%的升汞溶液中浸 2 min，再移 到无菌水中漂洗 3 遍， 最后移到 PSA 培养基上培养，每个培养皿放置 3 块，倒 置培养，在 25-30℃ 的电热恒温箱里培养 3-5 d 后， 挑取组织周围的菌丝放进加 有链霉素的培养基平板上继续培养，5-7 d 后，将获得的纯培养进行菌落性状的 观察、描述和拍照。 2.4 病原菌的鉴定[2,12,13-14] 对大血藤病原菌的鉴定采用传统的光学显微镜观察法。 用灭菌后的接种针挑 取少许菌丝，放在加有浮载剂（水）的载玻片，盖上盖玻片，置于显微镜下观察。 观察菌丝的颜色，是否有隔，是否有分支等特征；并观察分生孢子的颜色，形态 结构。记录和拍照。 3 结果与分析 3.1 病症的观察与描述 大血藤黑斑病发病主要部位是叶片、果实。病斑开始时圆形或椭圆形，初为 紫褐色，渐变黑褐色，病部稍下陷，以后各病斑互相融合，融合后成不规则形，2暗褐色至黑色；嫩叶往往皱缩变形。病斑大小 0.1-0.8 cm× 0.3-1.1 cm，有明显的 病健交界 （图 1） ，发病严重时整片叶子都会烂掉然后脱落[15]。图1 大血藤黑斑病病症叶片3.2 病原菌的培养性状及形态 在 PSA 培养基上，病原菌生长较快，菌落成辐射状生长，边缘整齐。菌丝 白色，后变成黑褐色。菌落初期为乳白色，成絮状或绒状（图 2、图 3） 。3-4 d 后，菌落中央开始出现灰色并逐步变黑。图2 大血藤黑斑病病原菌菌落正面观3.3 显微镜的镜检及病原鉴定图3 大血藤黑斑病病原菌菌落背面观多隔孢链格孢的分生孢子梗单生，不分枝，淡褐色，2～16(5)个隔膜， 23.0～ 165.8(54.8)um× 2.8～8.9(4.7)um；分生孢子呈链状，形状为圆筒形至倒棍棒形， 颜色为淡褐至褐色，孢子表面光滑或具微刺，有 2～7(大部分 3～5)个横隔膜， 偶尔有 1 个纵隔膜或斜隔膜，横隔膜处缢缩，中央的一个横隔膜缢缩特别明显，3隔 膜 亦 较 厚 ， 孢 身 尺 度 15.1 ～ 43.4(31.9)um× 5.9 ～ 12.5(8.7)um ； 喙 2.8 ～ 17.6(7.9)um× 2.6～5.1(3.8)um，喙顶有明显黑色疤痕[16-17]（图 5、图 6） 。 根据以上特征， 鉴定该病原菌为半知菌纲链孢霉目黑霉科链格孢属的链格孢 属真菌（Alternaria alternata） 。图 5 大血藤链格孢属分生孢子（10×40） 图 6 大血藤链格孢属菌丝（10×40） 3.4 生防菌的作用 用三种枯草芽孢杆菌制剂对链格孢霉真菌进行生物防治的结果表明： 枯草芽 孢杆菌 F1 制剂对两种病菌的防治效果最好，其次 F18 相对较好，F2 防治效果较 低（图 7） 。A 图7 生物制剂对链格孢霉的抑制效果 A：正面观 B：背面观B4 讨论与结论4通过对采集到的大血藤黑斑病病株标本样株进行分离、培养和纯得到病原菌，经 形态学鉴定表明， 引发大血藤黑斑病的病原菌为为半知菌纲链孢霉目黑霉科链格 孢属的链格孢属真菌（Alternaria alternata） 。链格孢属真菌能在多种植物上侵染 引起黑斑病，是植物叶部病害的常见病原菌之一 [18]，但大血藤黑斑病还是首次 出现，对大血藤的病害研究的相关文章中仅见关于炭疽病的报道[2]，可以说大血 藤黑斑病是大血藤病害中新型的病害。 三种枯草芽孢杆菌（Bacillus sp.）制剂对链格孢属真菌抑制效果表明： （1）不同 的枯草芽孢杆菌对链格孢属真菌的抑制效果不同； （2）生物制剂能有效的抑制链 格孢属真菌生长； （3）链格孢属真菌生长跟环境有很大的联系，在潮湿温暖的环 境下特别适宜生存和繁殖。 大血藤是贵州有名的中药，黑斑病对其影响在日益加重，为满足市场的需求，培 育出优质品质的大血藤中药，必须对大血藤黑斑病进行预防和防治。 （1）农业防治：实行合理管理制度，推广无病试管苗，及时合理追肥，提高抗 病力，注意清除病害植株和杂草，与其他作物进行轮种，随时防治害虫，减少病 菌传播途径[19-20]。 （2）药剂防治：用种子重量0．3%的50%异菌脲可湿性粉剂，或50%福美双可湿粉 剂等进行拌种。发病初期喷施50%异菌脲可湿性粉剂1000-1500倍，或50%福美双 可湿粉剂800倍。保护地在发病初期采用粉尘法、烟雾法等方法[20]。 （3）生物防治： 应用相关的生物抑制剂进行防治， 如枯草芽孢杆菌 （Bacillus sp.） 制剂。5参考文献 [1] 盛仙永，刘文哲.大血藤属植物研究进展 [J].西北植物学报， 2003, 23(7) : 1116—1120. [2] 张国辉，蔡凌云，张文华，等.大血藤炭疽病的病原鉴定及病害分析[J].中国 农学通报，2012，28(15):207-210. [3] 陈智仙，高文远，刘岱琳，等 . 大血藤的化学成分研究（ Ⅱ ） . 中草药， 2010,40(6):867-890. [4] 邓翀,颜永刚.多指标综合评价优选大血藤酚酸类化合物的提取工艺[J].中国 实验方剂学杂志，2011,17（13）:12-14. [5] 尹泉,李惠芬,周群,等.大血藤药材及不同提取物FTIR的比对分析[J].光谱学 与光谱分析,2010,30(1):54-57. [6] 常有宏，刘永锋，王 宏，等 . 梨黑斑病病菌的致病条件 [J]. 江苏农业学 报,2008,24(3):316-320. [7] 肖长坤，李勇，李健强.十字花科蔬菜种传黑斑病研究进展[J].中国农业大学 学报,2003,8(5):61-68. [8] 王宏 , 常有宏 , 陈志谊 . 梨黑斑病病原菌生物学特性研究 [J]. 果树学报 ,2006, 23( 2) : 247-251. [9] 王兴红,陈国庆,王卫芳,等.柑橘黑斑病发生危害现状及研究进展 [J].果树学 报,2011,28（4）: 674-679. [10] 王勇,刘云芝,陈昱君,等.三七黑斑病的研究[J].人参研究，2005,3:42-45. [11] 王 孜昌 , 王 宏 艳 . 贵 州 省 气 候 特 点 与 植被 分 布 规 律 简 介 [J]. 贵州 林 业 科 技,2002,30(4):46-49. [12] 张国辉，张文华，刘冬莲，等. 八月瓜炭疽病的病原菌鉴定及病害分析[J]. 中国农学通报，2011,27(13):277-288. [13] 许文耀.普通植物病理学实验指导[M].北京:科学出版社,2006:69-73. [14] 方中达.植病研究方法[M].北京:农业出版社,1979. [15] 谢红艳.我国部分区域链格孢属真菌的资源调查与形态和分子鉴定研究[J]. 贵州大学，2006,5. [16] 李多川 ,张天宇,吴竞爽,等 .链格孢属 (丝孢纲) 数值分类研究初探 [J]. 真菌6学报，1993，12(3):232一239. [17] 曹以勤 , 文玲 , 陆家云 , 等 . 链格孢属的 2 个新记录种 [J]. 南京农业大学学 报,1990，13(2):55~57. [18] 蒋妮，黄永才，唐美琼,等.威灵仙黑斑病的病原鉴定及防治药剂的离体活 性筛选[J].中国农学通报，2010,26(24):221-225. [19] 柳吉春.苹果几种真菌性病害防治技术[J].河北果树,2009(1):13. [20] 石明旺.瓜类蔬菜病虫害防治技术[M].北京：化学工业出版社，2011，1： 16-18.7致谢 大学四年学习时光已经接近尾声，在此我想对我的母校，我的老师和同学们表 达我由衷的感谢。 感谢我的母校凯里学院给了我在大学四年深造的机会，让我能 继续学习和提高； 感谢我的老师和同学们四年来的关心和鼓励。这次毕业论文设 计我得到了很多老师和同学的帮助， 其中我的论文指导老师张国辉老师对我的关 心和支持尤为重要。每次遇到难题，张老师不管有多忙，总会抽空来帮我解决。 张老师不仅在学业和论文上给我以精心指导， 同时还在思想给我以无微不至的关 怀，在此谨向张老师致以诚挚的感谢。在此，我再一次真诚地向帮助过我的老师 和同学表示感谢！感谢凯里学院！8