6- 酶磷酸葡萄糖脱氢酶试剂盒
6-磷酸葡萄糖脱氢酶试剂盒
产品简介：
6-磷酸葡萄糖脱氢酶是磷酸戊糖途径的关键酶，催化6-磷酸葡萄糖氧化为6-磷酸葡萄糖酸内酯，同时将NADP 还原为NADPH，以供生物合成及维持细胞内的还原状态，因此6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性的高低可以从一定程度上反映出生物体的生物合成和抗氧化能力。
G6PDH 能使NADP 还原成NADPH，6-磷酸葡萄糖+NADP →6-磷酸葡萄糖酸内脂+NADPH；在一定反应时间内其活性高低与反应前后生成物浓度的变化呈线性关系。本测试盒通过在340nm 下测定NADPH 增加速率来反应G6PDH 活性的大小，NADPH浓度升高越多则G6PDH 活力越大。
试验中所需的仪器和试剂：
紫外可见分光光度计、37℃恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL 石英比色皿、蒸馏水
产品内容：
提取液：60mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：储备液50mL×1瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×2支，-20℃保存；用时每只加275µL双蒸水充分溶解备用；
试剂三：粉剂×2支，-20℃保存；用时每只加275µL双蒸水充分溶解备用。
操作步骤：
一、样品测定的准备：
(1)细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，弃上清，按照每200万细菌或细胞加入400µL提取液的比例充分匀浆以破碎并裂解细胞。8000g离心10分钟，取上清，置冰上待测。
组织：称取100mg 组织，加入1mL 提取液进行冰浴匀浆。8000g4℃离心10分钟，
取上清，置冰上待测。
（2）血清（浆）样品：直接检测。
二、测定操作表：测定管对照管
试剂一（µL）750750
试剂二（µL）1010
试剂三（µL）1010
样本（µL）30
蒸馏水（µL）30
将上述试剂按顺序加入1mL 石英比色皿中，加样本的同时开始计时，在340nm 波长下记录20秒时的初始吸光度A1，比色后迅速将比色皿连同反应液一起放入37℃或25℃水浴中（哺乳动物用37℃，非哺乳动物用25℃），准确反应5分钟。迅速取出比色皿并擦干，340nm 下比色，记录5分20秒时的吸光度A2，计算ΔA=A2-A1。
注意事项：
1、若A2-A1大于0.5，需将酶液用提取液稀释，使A2-A1小于0.5，可提高检测灵敏度。
2、实验时，试剂二、试剂三和样本在冰上放置，以免变性和失活。试剂一37℃或25℃水浴放置。
3、比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
4、最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。G6PDH 活⼒单位的计算：
1、血清（浆）G6PDH活力的计算:
单位定义：每升血清（浆）在反应体系中每分钟生成1µmol/L的NADPH 定义为一个酶活力单位。
G6PDH（U/L）=857×(ΔA测定管－ΔA对照管)
2、组织中G6PDH 活力的计算:
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每mg 组织蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol/L的NADPH 定义为一个酶活力单位。
G6PDH（U/mgprot）=857×(ΔA测定管－ΔA对照管)÷蛋白质浓度（mg/mL）
（2）按样本鲜重计算：
单位定义：每mg 组织蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol/L的NADPH 定义为一个酶活力单位。
G6PDH（U/gmass）＝857×(ΔA测定管－ΔA对照管)÷样品鲜重（g/mL）
3、细菌或细胞中G6PDH 活力的计算:
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每mg 组织蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol/L的NADPH 定义为一个酶活力单位。
G6PDH（U/mgprot）＝857×(ΔA测定管－ΔA对照管)÷蛋白质浓度（mg/mL）
（2）按细菌或细胞密度计算：
单位定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成1nmol/L的NADPH 定义为一个酶活力单位。
G6PDH（U/104cell）＝857×(ΔA测定管－ΔA对照管)÷细菌或细胞密度（104个/mL）