鹿鞭及伪品的免疫凝集试验鉴别
中国药事2000年第14卷第2期·103·
鹿鞭及伪品的免疫凝集试验鉴别
郭月秋 陈代贤 刘 辉1 杨 光1
(大连市药品检验所 116021; 大连医科大学检验系)
1
摘要 本文对鹿鞭及其伪品牛、羊鞭进行了免疫凝集试验鉴别, 获得了快速、准确鉴别鹿鞭真伪的试验结果, 为鹿鞭真伪鉴别提供了一种新的手段。关键词 鹿鞭 牛鞭 羊鞭 免疫凝集试验 鉴别
Identification of Deer Testes and Penis and its Counterfeiting Products by Immuno -agglutination Testing Guo Yueqiu , Chen Daixian , Liu Hui and Yang Guang (Institute for Drug Control of Dalian City , 116021; Dalian Medical University )
ABSTRAC T This paper established an immuno -agglutination testing method for the identification of Deer Testes and Penis and its counterfeiting products . The new method is rapid and accurate . KEY W ORDS deer testes and penis ; penis and testis of a ox bull ; penis and testis of a sheep ; immuno -agglutination testing ; identification
鹿鞭的真伪鉴别, 虽有鹿、牛鞭的形态解剖及商品特征比较鉴别[1], 鹿鞭的电泳鉴别[2]和鹿鞭微量DNA 提取及序列分析鉴别的报道[3], 但由于方法操作繁杂, 需要一定的仪器设备, 使其推广应用受到一定限制。因而我们建立了用于鹿鞭真伪鉴别的免疫凝集试验, 为鹿鞭真伪鉴别提供了一种新的、简易、快速、准确的鉴别方法。现将试验结果报道如下。1 材料及来源
商品梅花鹿(Cer vus nippon ) 、新西兰鹿(Cervus sp . ) 鞭由吉林通化鹿场提供, 马鹿(C . elaphus ) 、驼鹿(Alces alces ) 鞭购于辽宁省西丰鹿场; 驯鹿(Rangifer tarandus ) 鞭购于黑龙江妥芬河进出口贸易公司(由苏联进口) ; 白唇鹿(Cervus albirostris ) 鞭购自大连市动物园; 新西兰进口冷冻鞭(西丰加工品) 来自辽宁省西丰鹿场; 变质鞭为新西兰进口鞭西丰加工品, 来自大连医药市场; 牛(B os taurus domesticus ) 鞭来自大连市医药市场没收品; 羊(Ovis aries ) 鞭购于屠宰户; 梅花鹿血采自辽宁西丰鹿场; 牛血、羊血采自屠宰户; 鸡(Gallus gallus domesticus ) 由大连医科大学动物室提供。22. 1 抗血清的制备
2. 1. 1 抗原的制备 取鹿、牛、羊新鲜全血于试管中自然凝固, 用L 玻棒拨离后, 4000r /min 离心15min , 取上清液即为血清, 分装备用。此为制备抗血清用的抗原。
2. 1. 2 免疫动物 用上述抗原免疫健康家鸡, 免疫程序及方法见表1。
表1 抗鹿(牛、羊) 血免疫血清的免疫程序
日 期第1天第14天第21天
抗 原
弗氏完全佐剂乳化抗原
全血清全血清
剂量/ml 3. 02. 03. 0
途 径背部皮下多点翅下静脉翅下静脉
1
1
1
2. 1. 3 效价测定 采用免疫双扩实验, 参照文献
[4]
进行, 双扩效价大于1∶8者为有效, 收集鸡血
清分装备用。此即特异抗血清(抗体) 。2. 2 免疫凝集实验
2. 2. 1 待检样品的制备 取各种鹿鞭、牛鞭、羊鞭过六号筛的粉末0. 03g 于试管中, 加生理盐水2ml , 混匀制成混悬液。
2. 2. 2 抗血清特异性凝集效价的测定 将抗梅花鹿血清用生理盐水作倍比稀释成1∶2、1∶4、1∶8,
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1滴(约25μl ) 于载玻片上与1滴(约25μl ) 不同稀释度的抗鹿血清分别充分混合, 同时以生理盐水作对照(抗原+生理盐水) , 不时摇动玻片, 5min 观察结果。以稀释度最大而且凝集者为抗梅花鹿抗体凝集效价, 用相同的方法分别测出抗牛血清及抗羊血清抗体的凝集效价。
2. 2. 3 抗血清非特异性交叉反应观察 将制备好的3种抗血清分别与本文所述的不同鹿鞭、羊鞭及牛鞭标本作用, 并按2. 2. 2中所述方法测定效价, 对反应强度进行定量分析。2. 2. 4 抗原抗体反应(正试验) 取待测抗原颗粒混悬液1滴, 置载玻片上, 再加等体积的、按效价滴度稀释的抗血清, 同时设立生理盐水对照, 不时摇动玻片。参照血球凝集反应结果判定标准判定结果:强凝集者(有75%以上的颗粒凝集) 判为阳性, 弱凝集或不凝集者(只有25%以下的颗粒发生凝集) 判为阴性, 对于两者之间的中等程度凝集者为可疑阳性反应, 需重试。3 结果
3. 1 抗梅花鹿、羊、牛抗体与不同动物鞭标本反应情况详见表2及附图。
表2 抗梅花鹿、羊、牛抗体
与不同动物鞭标本反应情况(按效价滴度倍比稀释)
动物鞭标本
马鹿马鹿抗血清
梅花鹿白唇鹿驯鹿驼鹿羊
(家养) (野生)
抗梅花鹿1∶41∶11∶11∶11∶11∶11∶1抗 羊抗 牛
1∶11∶0
1∶11∶0
1∶11∶0
1∶11∶0
1∶11∶0
1∶11∶0
1∶41∶0
[5]
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3所示。
表3 鹿鞭及其伪充品的免疫凝集试验鉴定结果
抗 原
梅花鹿鞭 马鹿鞭(家养) 马鹿鞭(野生) 白唇鹿鞭 驯鹿鞭 驼鹿鞭 进口鹿鞭(国外加工) 进口鹿鞭(国内加工) 羊鞭 牛鞭
抗血清
梅花鹿
+---------羊--------+-牛---------+
生理盐水
----------
4 讨论
4. 1 本研究采用免疫学方法, 即以大分子抗原物质免疫动物而获得抗血清, 后者与免疫动物的抗原物质可发生免疫血清学反应, 这种反应具有高效、专一性的特点, 从而达到用已知抗体鉴定未知抗原的目的[6]。本法是采用不同动物的血清作为抗原物质免疫动物而获得抗血清的, 考虑到血清的成份复杂, 有对于鹿鞭鉴定有用的指征性物质。也可能存在着影响鹿鞭鉴定的非指征性物质。因此, 我们分别测定了抗血清的特异性反应效价和抗血清的非特异性反应效价。结果表明:我们所制备的三种抗血清的特异性反应效价均远高于非特异反应效价(如表2、及附图所示) , 说明我们制备的抗血清具有较好的特异性。经过适当的稀释可以完全排除非特异性反应, 达到准确鉴定样品的目的(如表3所示) 。4. 2 免疫凝集反应是颗粒性抗原(如红细胞或细菌等) 与相应抗体发生的特有的反应, 通常认为这种实验较免疫沉淀类实验的灵敏度要高1000倍以上[7]。试验中发现干燥的鹿鞭经适当粉碎过筛后很容易制备成适当大小的适于做免疫凝集试验的颗粒性抗原, 故可直接采用免疫凝集试验用已知抗体对未知的抗原进行鉴定, 本实验结果证实上述方法是有效的(详见表3) 。利用免疫学的方法鉴别中药, 一般是提取样品中可溶性抗原, 用免疫沉淀法进行鉴定
[8]
牛1∶41∶11∶
1
。我们的实验结果提示在颗粒性抗原较易制
图 抗梅花鹿、羊、牛抗体的特异及非特异性反应比较图
A . 抗梅花鹿组; B . 抗羊组; C . 抗牛组(除牛外, 各种鞭均不发生反应) 1. 梅花鹿鞭 2. 马鹿鞭(家养) 3. 马鹿鞭(野生) 4. 白唇鹿鞭
5. 驯鹿鞭 6. 驼鹿鞭 7. 羊鞭 8. 牛鞭
备的情况下, 试用免疫凝集试验的方法进行鉴定可能是一个简易有效的途径。4. 3 本文实验结果表明, 抗梅花鹿血清与梅花鹿鞭抗原凝集反应阳性, 而与其它鞭抗原凝集反应则3
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血清与上述其它种鹿鞭进行凝集反应, 结果仍呈阴性反应, 因而需分别制备抗马鹿、抗驯鹿等血清, 才有可能鉴别出不同种的鹿鞭。这也说明我们制备的抗血清种属特异性较强。
4. 4 对于阴性反应者, 为了证明是否为伪品, 我们制备了常见伪品抗羊、牛血清, 其与几种鹿鞭抗原凝集反应均呈阴性, 而与羊、牛鞭抗原凝集反应分别呈阳性。在对抗梅花鹿血清呈阴性反应的样品中, 再与抗羊、牛血清反应, 呈阳性者就可确证其为何种伪品。因此, 只要制备正品(梅花鹿、马鹿) 、类似品(驯鹿、白唇鹿、驼鹿) 及伪品(羊、牛) 的抗血清, 建立储备有多种抗体的血清库, 采用免疫凝集试验方法, 就能随时准确鉴别各种鹿鞭及伪品。
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参考文献
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龙振洲主编. 医学免疫学. 第2版. 北京:人民出版社, 1996:211
丁培贤, 贺天笙. 生物免疫化学法检定虎、豹骨的研究. 中国药学杂志, 1989, 24(8) :457
HPLC 法测定陈皮中橙皮甙的含量
崔丽华 管玉民 王 健
(山东省药品检验所 济南 250012)
摘要 采用HPLC 法测定陈皮中橙皮甙的含量。色谱柱为C 18, 流动相为乙腈-0. 4%磷酸溶液(20∶80) , 检测波长286nm , 方法简便, 准确, 重现性好, 平均回收率分别为:98. 91%,R SD 为1. 31%(n =6) 。关键词 陈皮 橙皮甙 高效液相色谱法
Determination of Hesperidin in Pericarpium Citri Reticulatae by HPLC
Cui Lihua , Guan Yumin and Wang Jiang (Shandong Provincial Institute for Drug Control , Jinan , 250012) ABSTRAC T The HPLC method is established for the determination of hesperidin in pericarpium citri reticulatae . The separation is c onducted on column C 18with a mobile phase of acetonitril -phasphoric acid solution and detected at 286nm . The average recovery is 98. 91%.This method is simple , rapid , accurate and repr oducibility . KEY WOR DS pericarpium citri reticulatae ; hesperidin ; HPLC 陈皮为常用中药, 具理气健脾, 燥湿化痰等功效, 临床上用于胸脘胀满, 食少吐泻, 咳嗽痰多等症。本文采用高效液相色谱法测定了几批不同产地的陈皮中橙皮甙的含量, 该法简便, 快速, 准确, 重现性好。
1 仪器与试药
美国产SP —8800高效液相色谱仪, SP —200紫外检测器; ChomJet 积分仪。乙腈为色谱纯, 其他试剂均为分析纯。橙皮甙对照品购自中国药品生物
289%,见
图1 橙皮甙纯度图
图1) 。陈皮药材系全省各地抽验样品。