尖吻蝮蛇血凝酶药效评价及其作用机制_石光
ChineseJournalofNewDrugs2010,19(
18)
#实验研究#
尖吻蝮蛇血凝酶药效评价及其作用机制
石 光,庞建新,孔焕育,罗 超,刘霭明,金 宏,曹 莹
(南方医科大学药学院,广州510515)
[摘要] 目的:研究注射用尖吻蝮蛇血凝酶(HaemocoagulaseAgkistrodon,HCA,商品名苏灵)的止血效果及其作用机制。方法:通过体内外形成血栓实验,了解药物的凝血效果及其是否激活凝血因子ÚÓ;通过HCA对纤维蛋白原的裂解作用探讨其凝血机制。结果:HCA作用下体内外形成血栓的大小与立止血相差不大,差异无统计学意义;蛋白凝胶电泳图显示HCA作用12h后纤维蛋白原A亚基带消失;高效液相色谱图显示在8.8min处有明显的峰出现。结论:HCA具有良好的止血效果,且不激活凝血因子ÚÓ;HCA能水解纤维蛋白原的A亚基,裂解出A肽片段(FpA),形成纤维蛋白单体(ABBC)2,并聚合成纤维蛋白多聚体,发挥止血作用。
[关键词] 尖吻蝮蛇血凝酶;止血机制;药效评价;纤维蛋白原;凝血因子ÚÓ
[中图分类号]R973.2 [文献标志码]A [文章编号]1003-3734(2010)18-1706-04
EvaluationofhemostaticeffectsofHaemocoagulase
Agkistrodonandthemechanisms
SHIGuang,PANGJian-xin,KONGHuan-yu,LUOChao,LIUA-iming,JINHong,CAOYing(SchoolofPharmaceuticalSciences,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)
[Abstract] Objective:ToevaluatethehemostaticeffectofHaemocoagulaseAgkistrodon(HCA,trade
name:Suling)forinjectionandthemechanisms.Methods:Intheinvivoandinvitroexperimentsofthrombosis,thehemostaticeffectsofHCAandactivationofcoagulationfactorÚÓinbloodcoagulationwereevaluated.ThemechanismswereinvestigatedbydeterminingtheabilityofHCAtodegradefibrinogen.Results:HCAhadtheeffectsimilartothepositivecontrolreptilase,butthedifferencewasnotstatisticallysignifican.tSDS-polyacrylamidegelelectrophoresisshowedthattheA-chaindisappearedafter12hincubationwithHCA,andhighperformanceliq-uidchromatographyshowedanobviouspeakat8.8min.Conclusion:HCAhasagoodhemostaticeffectwithoutactivatingcoagulationfactorÚÓ.ItexertshemostaticeffectbyhydrolyzingA-chainoffibrinogen,releasingApep-tidefragment(FpA)togeneratethefibrinmonomers(ABBC)2andpolymerizingthemforhemostasis.
[Keywords] HaemocoagulaseAgkistrodon(HCA);hemostaticmechanism;drugevaluation;fibrinogen;coagulationfactorÚÓ
蛇毒类凝血酶作为一种动物来源的蛋白酶类止血药,由于其毒性低、起效快、药效持久且不引起血管内栓塞等优点,近年来已经引起了人们的极大关注
[1]
和Konig首次从巴西矛头腹蛇(Bothropsatrox)毒液
中获得部分纯化的巴曲酶(Batroxobin,商品名立止血)以来,迄今已发现30余种蛇毒类凝血酶
[2]
。
。自1936年奥地利著名毒蛇学家Klobusitzky尖吻蝮蛇血凝酶(HaemocoagulaseAgkistrodon,HCA,商品名苏灵)是一种从尖吻蝮蛇毒液中提取
[3]
分离出的蛇毒类凝血酶,该类凝血酶具有良好的止血作用
[4]
[作者简介] 石光,男,硕士,研究方向:新药评价及糖尿病药理。联系电话:(020)61648673,E-mai:[email protected]。
[通讯作者] 曹莹,女,硕士,研究方向:新药评价及肿瘤药理。联系电话:(020)61648672,E-mai:[email protected]。
金宏,男,博士,研究方向:抗炎免疫药理。联系电话:(020)62789416,E-mai:[email protected]。
,而且不良反应轻,耐受性好,作为一个
止血药物,它已经完成临床前和临床试验。2009年
3月,康辰医药股份有限公司将HCA作为国家一类创新药物申报上市销售,商品名/苏灵0。本文通过
年第
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一系列的体内外实验研究,进一步确证HCA的药效
并初步研究其作用机制。机分成3组:HCA组、立止血组和溶媒对照组。各
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组按3U#kg剂量水平尾静脉注射相应药物,溶媒对照组给予等量溶媒。给药后腹腔注射戊巴比妥钠麻醉大鼠,仰卧固定于手术台,于腹中线纵向切开皮肤约3cm,从腹白线处打开腹腔,钝性分离下腔静脉,于左肾静脉下方用4号缝合线结扎下腔静脉,同时结扎下方两条主要分支静脉,缝合腹壁
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材 料
1 药物与试剂
受试药物:注射用尖吻蝮蛇血凝酶(HCA,商品名苏灵,康辰医药股份有限公司,批号:20090611,规格:1U#瓶);注射用血凝酶(商品名立止血,瑞
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士素高药厂,规格:1.0KU#瓶,批号:810309)。其他试剂:人凝血酶(Sigma公司,批号:087K7570,规格:200U#瓶);标准人血浆(来源于南方医院);人纤维蛋白原(Sigma公司,批号:108K7535,规格:250mg#瓶
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。3h后,重
新打开腹腔,在结扎处下方约2cm处用4号缝合线
结扎,将该段管腔内血液吸尽,纵行剪开,观察有无血栓形成,如有则取出血栓称湿重,然后将血栓置于5mL5mo#lL尿素溶液中,静置18h。观察并记录血栓的溶解情况,称量溶解后的血栓湿重,计算溶解率。3 HCA释放纤维蛋白肽作用的研究
用0.05mo#lL
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);脲(广东光华化学厂有限公司,批号:
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20090223,规格:500g#瓶
2 试验动物
)。Tris-HCl(pH7.4)缓冲液分别
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SPF级SD大鼠30只(6周龄),雌雄各半,体重220~260g,由南方医科大学实验动物中心提供,合格证号:SCXK粤2006-0015。
3 主要仪器
Agilent1200系列高效液相色谱系统、AgilentC18色谱柱([email protected],5Lm)均购自安捷伦科技有限公司;AlphaHP3400荧光/可见数字图像分析系统(美国AlphaHP3400公司);BIO
RAD电泳
仪(北京赛百奥科技有限公司);Eppendorf5415小型高速离心机(上海肯强仪器有限公司);THZC1型冷冻恒温摇床(太仓市实验设备厂);BS124S型分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。
配制10mg#mL人纤维蛋白原溶液、4U#mLHCA
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溶液和8U#mL人凝血酶溶液。每次取纤维蛋白原溶液和HCA溶液各0.5mL加入4支1.5mLEP管中,于37e水浴锅分别孵育10,30,60和120min。另取纤维蛋白原溶液、凝血酶溶液各0.5mL加入1.5mLEP管中,37e孵育120min。水浴结束后沸水煮3~5min,以终止反应,产物经13000r#min离心10min,取上清液,进行高效液相色谱分析。HPLC条件如下
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:实验仪器:安捷伦科技1200系列高效液相
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色谱系统;流动相:A相为含0.05mol#L三乙胺的0.1mo#lL磷酸(pH3.0),B相为色谱甲醇,用前以0.2Lm微孔滤膜过滤并脱气,用时两相比例为61B39;其他:AgilentC18色谱柱([email protected],5Lm),流速为1mL#min,压力为155~159bar,室温为20~22e,检测波长210nm,上样量为100LL。4 HCA对纤维蛋白原肽链降解作用的研究
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方 法
1 HCA体外形成血栓的研究
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分别取0.05mo#lLTris-HCl(pH7.4)缓冲
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液、1U#mLHCA、1KU#mL立止血、2U#mL凝血酶各0.5mL,与0.5mL标准人血浆混合,于37e水浴锅中孵育。待血凝块形成30min后,用滤纸吸干水分,称量血凝块重量,然后将凝块置于5mL5mo#lL尿素中,静置18h。观察并记录血凝块的溶解情况,称量血凝块溶解后重量,计算溶解率:溶解率/%=(溶前血栓湿重-溶后血栓湿重)/溶前血
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栓湿重@100%。另用0.05mol#LTris-HCl(pH7.4)缓冲液配制10mg#mL人纤维蛋白原溶液(Fib溶液)代替标准人血浆,重复上述试验。2 HCA体内形成血栓的研究
SD大鼠30只,体重220~260g,雌雄各半,随
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用0.05mo#lLTris-HCl(pH7.4)缓冲液分别
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配制10mg#mL人纤维蛋白原溶液和4U#mLHCA溶液。每次取纤维蛋白原溶液、HCA溶液各0.25mL,加入6支1.5mLEP管中,于37e水浴锅分别孵育10min,30min,1h,2h,4h和12h。水浴结束后每个反应体系中加入5mol#L尿素0.5mL。待纤维蛋白凝块溶解后,将样品与SDS-PAGE上样缓冲液4B1混合,沸水煮3~5min,取15LL小心上样。接通电泳仪电源,在积层胶阶段用低电压(40V)使样品浓缩成一条线,然后加大电压(80V),约2.5h后待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时切断电源,小心取出凝胶,切角标记,新鲜配制考马斯亮蓝染色10min,脱色液洗净凝胶背景,然后用AlphaHP3400荧光/可
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见数字图像分析系统观察记录电泳结果。5 统计学处理
采用SPSS13.0统计分析软件处理数据,结果以x