嗜水气单胞菌肠毒素的研究进展
嗜 气 单水 菌胞肠 毒 素的研究 进
浙展 江医 科 大学 华金大 专 部 宁波市 卫 生 防疫
站
野
综胡
程述 华
志海 波罗
浙
医科江 大
内学容提
要究态动道
。
审
校
包括 细 毒胞 肠 毒
、素
, 肠
毒 素 嘴是 水气 单 胞菌( A句 重 要 的 毒 力 因子
。
细 胞兴
性 肠 奋毒素以 及 与 霍 乱 辜肠素有 交叉 反 应 的 细胞 溶 解 性肠 毒素
本, 文 近 年 三 种就肠 毒 素 研的
诸 如 产毒 件
、
制条备 与化纯
、
理
化 性质
、
生 物 学 性
活
、
致
作病 用 与 机 作理 一 扼要报
、一
细 溶胞解性肠 毒紊
1 (9 认 为9粗 提 后 应立即 入 蛋 白 酶 加8 )
抑
(制 )产 一 毒件
剂条[ 2 〕。
。
细 胞溶 解 肠 性毒素 的 合和成产 量 与A h
粗 提后 的纯 化 方 步法层 析法
层
析 ,
,,
C
ho
l
r P a等[
〕
采 用
两
菌株型 有别关
。
以
r
P
1a 等 [〕 发 该
现,
肠
毒
e
即素 提 取物先 经 苯基 脂 糖 琼疏 柱
水
阳性菌 株主 要 来 自 人病 腹 泻标本
R O
s 12等〔
用 ~ 6 2 %硫 按沉 酸 后 的淀 蛋 质白 0再
。0
研
究中 采 用的 高 产 毒株 腹 为泻标 本 分 中离 A 的
h一ss u
过 通与霍乱 抗毒 素 B单 位亚偶 联 的C 4 卜
B菌株
。
。
外
此、
,
毒 量 与产用使的 培 养 ,
凉
脂 糖亲 层 和 析而 纯化
步 化纯 法
,一
Ro
es
叻等 推则 荐
四
一
基种一 类和环 境温 度 亦 有 关素
汤 )、
酸 碱度及振 荡速度 等
一
因即 滤 液 硫 酸 经钱 淀沉 苯基 琼 脂。
C a mp e l 等b[3 〕 比 较 种 三培 养 l基
糖疏
水 柱 层 析阴 子 离交 层换 析效 高液 层 相 析(H P L沁C E S C
)肠 毒
,
素即C Y
肉E汤 ( 酪蛋 白 氨基 酸 酵 母抽 提 物肉
ST
B所 获
的 纯 化 细 胞 溶性
,解
肉
汤 ( 胰 解酶 酪蛋白 大豆 肉 汤
一)
。
过 通 D S孚P A E 和G生 物 学 活 性 检 验而 且 各 种活 性
,
和 B、 H 肉I汤 (心 浸脑 汁 向 汤)
。
、
结 果 明表.
,
表
明
, 不 但份 成度 纯高一 血 活溶
性、
使 用 Y E C 肉汤 时产 毒量 较高 他 与产其 毒 量 有关 最 佳 的 条 是3 件 p℃H 6 3 分每 钟7
、
如肠 性
毒
细 胞性及 霍毒 乱 肠毒
,
素交 叉 反 应 性 均 稳 定
其 溶 血 能活性 单 位还
。lo o r
振 荡 培 养 20~ 4 小 0时。
明显 高 于 他 其纯 化方 法 所 的获 数
(值三 理 ) 性 化 与化质 组 成学
1o m l
。
( 二肠) 素毒 制的 备与 纯 化
i
将产毒 的C株Y E 汤 越过夜 培养
物纯 化
的 细 胞 解 溶 性肠毒 素 作 SD SPA G E5
。
加于内 含 0
5 3 7 ℃气通、
m0 lC菌YE 无
肉
的汤烧 瓶中 ,
,
,
置
,
其
分子量 是5 2
8
0
0 ,。
等电 点
为,
8
振 培荡养 1 ~ 2 小时4
收 培获
分养 钟 清
上,
。1
肠 该毒 素 在p SH
一
的, 围范内 质性
较
物
r ,每 分钟 8 0 0 0 ~1 0 0 0 离心 30 0.
稳
定 热,
且 对胰 蛋白酶 有等 耐受 性
。
不但耐
液
用 0
5
。
4
m
微 孔滤 协膜 过滤
,
液滤即 为 粗
制65 加℃热 1 分钟 失 0活
胞细溶 解性 肠毒
毒肠素
1 21
e 防 为 止 白水蛋 解酶 的 解降
a
soR
es
等 e 素s 经L P S 色染和 We t 吸m 印分 ,析证实 不
9 其c〔 〕 iNo
T l,
:et
a l
E
:
r
u万
l C i
n10〔 〕
Mi
W o
o
-
4 2()
:
16 3 ~
61 9( 1
990 年8 月 2 2日收 稿 ,1 9 9 0年 1 0 月 61 日 修 回)
or bil ,
19 8 4 (25) 1 75 ~ 17
a
9d
s
DE
et
lE ru C1ln i
:ocM i r bo l i 19 8
6一
175
we
含L P
s [
幻
R o s
。
e
2 等
〕[
分析
该 肠 了毒 的素 化结 果
明 表该 肠
.
“
C ’由 r 释 量 放所表 达 的 HCO 胞细 伤 损数量
与学 组 成
成 份及 含量 ( 表 见 , 表)
一,
毒作用素 时间 的关 系
6
。
果结表 明
,,
,
细
胞溶
解
2
毒,素 的 氨基 酸 组分 中 以 半 脸 氨 酸含 量 少
最Ah 胞 细溶 解性肠毒 繁 的 傲徽墓
性肠 毒素具 膜 伤 损作 用
。
当
素 作 用 毒于细 胞
分
钟即 表 现出细胞 膜 损的伤 至 ,
小
时损
组 成与 含
t~
一纸 酸 名基
称 天冬 氨酸
一
~
~ ~,~ ~.~
.
~
~ ~ ~~~~ ‘一 氮 墓 酸残 含量基/ m o 蛋 白质 l .
月”
一
伤 作 达 用高峰作 并指者出 膜 损 伤 作的 用机 理 由 子是 该 肠毒 素能够在 种多生物 细胞膜
上
“钻孔
,
”
‘
’
, 致通导透 性 改变
。
镜 电查检 证亦,
苏
氮酸丝 氮酸谷氮 酸
实
C H
O细胞受到 该 肠毒 素 用 作后,
,
表
现
出细 胞膜 贴紧 胞 于核的 固 缩 作 此用即 肠 毒 素, 引 起 细膜 胞损 伤形 成 孔洞 胞使 内 物容漏 出,
肺氮
酸
甘 酸氮丙
氮
致使酸 细 皱 缩
胞
。外此
,,
细 溶解胞性肠 毒
素亦能,溶 家解 红兔细胞
4〔
〕溶
血活 单 位因性毒
颧
酸
氨半胧氮 酸
甲氨 硫酸i
素 的
纯化 方 法及测 定 手 段不 同 而
异采 用 良 的J改 a
,
oR ,
se
m
e
s法
,
以 5
兔%红 细 胞0
溶 血
毒 素的 高最稀释 度 为作溶 血 价
效1226
15
经
异 氨亮
酸数
据算
换
.4
出 检 该 毒 素肠的 溶 血活 性
为亮
酸氮酷氮 酸
茉 丙 氨
酸1
x
l
沪 溶 血
单位
/m,
o g
1
1
动
物实验 明表
。细胞
溶 解 性 肠毒 素 有具
、’
赖氨酸组
敌舞
致 死用作将 化 的细 纯 胞溶 解性 肠 素毒 活的A h 产 毒 菌株和 声 波 处超理 后 的菌 细 胞碎
61 18、
精氮
酸色 酸
组
片,
,
分别 作小 鼠死 性致试
验
。
结显果
示
,
0 1,加 1 未经 释稀 的 细胞溶 解 性肠 素毒 (浓 度
支 阿
( ) 四生物 学 活性
致
病作用与 机 理
,
m /
)
l 尾经静脉 注 入小鼠 后数 分钟
。
即
细 导胞 溶 解 性肠毒 素 同如霍 乱 肠毒素 一e样 能 引起 家 兔肠 拌 的液 体 蓄积 故 mcp bl a ,
致
小鼠 死亡
与
此 相反
。
, 鼠 小静脉 尾注入 业 挥 致 作死,
经洗涤 的 活 的产 毒 菌株 或 超声 波处 理 的 细
后
等 此 将胞种外产物 称 为霍 乱 毒素交 叉 反应 因 子
C(T C E )
LT
。胞
片
碎用
。
,
约 需 则坦
5
小 时 后才发
Jm
a
es
等
5〔〕
先报道首 大 肠杆菌
。
胞细溶 解肠性 毒素的 致 死 用 机作理 尚未
,和
hA 肠 素如毒预 先 与霍 乱毒杭 素 用作 后
睐
明
人有认 为 类似 于志贺 氏 素毒的 作
,
用均
可明 显 减 少家 兔 肠 的拌 肠 液 分量泌 菌 T 和 L h 肠A 毒素 的 玫 击。
:
并
因证为 两 者 经尾 静脉 入注小 后 表 鼠 现出类 似
实经霍 乱 毒的 素 免疫 的 小 鼠 能 明保显护 大 肠杆
神 经 性 反 应毒
如
肢 麻痹 和 呼 后 衰 竭 等
。吸
。
his
。 :动
幻
等 〔使
此
外
,
对于 细 溶胞 解性肠 毒素与 乱霍肠p
用 反向被动 胶 凝乳 集 试 验 E 结 果发 和
0 1 现分钟 活 性
,
。
9验 耳S A 1对7
。
株。
a毒 素 的 问 磷免联 关 已进 一 阐步明 C m
e
bu
A、 是 否 h生霍 产乱样 肠 毒 素 作了实 验研 究
,
伪
。
p
ar
4 其
中8 份 养滤掖 培(。
。
5
%)
能
产S
和 丑o 先 后用 E L丁 A e
,
s
免疫、 吸印 术 技性霍
以及 肠 素毒中 和 反 应证 实
,
Ah 细 胞 解溶:
生
霍 样 乱肠毒素
若,该将 毒素预 先5 ℃加 热 6
肠 毒素不 仅 有具 乱 霍毒肠 素的 免 交疫叉 反
1 应1 性且该 叉交 反应 有性 以 下特点 〔 4“
上 述则 活 消性
失
( )
1细
胞溶解 性 肠 毒素具 细胞有毒 性 籍 和
班 劝R e 等s闭
细乱 抗毒 仅 素能与A 五 胞 溶解 肠性毒 素 牢 固
采用 CH O 细
胞
‘
ctl ,
释放试
结合
,
但
不 能 和中 肠该毒 素的其他 任何生
物,
测定该 肠 毒 的索细 胞 毒 用 7 作1一
6并
探讨
了学活 性
这可 能是 毒肠素分 子 上 的霍乱 抗毒
一
素 别的识抗 原 点 与其 他 生 位物 学活 位性点 分
居 于分 的不 同子 部位;
细胞 兴 奋性肠毒 素 还能
使C flO
,Y ’
肾上
腺 细 胞 和
2 (
) 胞 济解细 肠性毒
,
细胞
J(
,
形, 态发了变 化1几
1
1 女 起引CH O 细
素 相应 的抗毒 素霍与乱 肠毒素的 反 应 微弱
示 显 此出免 疫交 叉反应的 单 向性多
胞 体伸长 固 醉形
并 伴c 细有胞 内
、
A
MP
的 升 高类和
3 )(
免疫。
成[7
8
〕
,
。
Ch
ka
ra
b
orty
将
A h 肠 产
细胞 试毒验 筛
交叉
反 应 不性耐 热
6,5 ℃1 分 失钟 活
,
0此
,
素 基因予 以 分
离一 大 肠 至 菌K
通杆 过质 粒 载 体成 功地 克
隆,
免疫交 叉 应 反性 物的质 基 础 目 前 仍未 阐
明2 1 上株
用
H O
C将这 两 肠 毒种 作素 氨基 酸 列序分
两 者 析的 化学 结 构有明 显的似相性疫 反应 性 的 两 种 白蛋质 抗 之原间 结 合的
a 一
,。
未
现发
选克
降,
再
经 亚克 隆 的杂后交 株 培 养物上
,清
免
疫 叉交
氨基 因
液 检 酸测 证 明携带 产 生 A 有h细 胞 兴 奋 肠性毒
反
应 性的 现 可出能 是由 于 在 具 免 原性疫 和
免
素 ,的基 因 段 片液,
引能 起 动 物 模型的 肠 腔 积。
c
Ho
细胞变 长和 产 细生胞 兴奋 性 效
词应序 列 有 一 个小 范1 化的 学性 类似 区 而 域然偶
经
隆 后 的 克 毒肠 素完 不全 同 A 于h 细的胞
毒抑
或因 次极结 构的折叠
,
,
如
分子表 而
肠 素
、毒
溶 毒血 素 以 及大肠 杆菌
,
LT
。
螺 旋在
种两 白蛋 质均中 形成 一 种共 同
以的 此作 氨基为 残酸 基 并 所存
年
P近o t o m is k 等i [ 01〕 E用 L SIA
证
实,
原 决定抗 簇
致
。A h 产 生 细 胞的兴 奋 肠 毒性 素与 霍 乱肠
素毒
间亦 存 免在疫 交反 叉 应 二性
、
。
作者 用 羊 抗霍乱
,
胞细 兴奋性 肠毒 素
肠 毒素 疫 免血 清 包 被相载 体
本
固,
加待 检标
,。
(
一) 产条 件毒1
C h o pr 等 〔〕将 创伤 感染 本标 中 离分 a
以
兔 抗霍乱 肠毒 抗体素作 为第 二 体抗
然
后 用羊 兔抗I g 标 记 的 碱 性 磷G酸酶 色
显A 的
h
汤
一
5,
和 A 2卜 9 7 菌9株
。
,
接种 于 C EY肉
r
结果从 腹 泻 或 非 腹泻 儿童 中 分 的离2 0 株 Ah5
37 ℃ 荡振培 养( 每分 钟 1 00 )3 6
时小
,
能
菌
株中
,
1 其
5中株 ( 2占% ) 与霍肠乱毒 素 5,
合
成 细胞兴 奋 性肠 素
(毒 )肠 二 素 毒 制 备
的出 免现 疫交 叉应 纯 反 化 和 化性理
质.
且
些 菌 这 株能 生产细 胞
、
兴奋
性 肠毒 相类 素 三
,似
,
所
致的家 兔 肠拌 积 液的中 电
。细
兴胞奋 性肠毒 的 素 提取仍 常 用 过滤
除
解 成质份 和蛋 白 质含 与量 霍 乱 肠毒素 起 的引
菌
法,
即将 A h 养培 上 清物 液 0 4 协m用 微孔
5
。 不但 损 伤肠 粘 膜细 胞
毒肠 毒素
滤
膜 滤而 获 过提 粗 述物 的 方 法
1 外3
,
纯化除可 采 用类 似上H
、
可将
Ah 培养 物 液 滤浓 缩 后
,用
(
一)产毒 条
C a 件 m p be l等 [l3 发 〕 现 从 腹泻 病 人
标
%甘 酸氨掖 透
~析1
0
, ),
P
在
丙 三醇梯度 密 度
,
(本
中
中作 等
电 聚
,焦
获收p H4
”
。0
~ 5
。7
电
,分 离 A 的 菌 h 株 接种于 B HI肉 培养 基汤中
泳P带 用EPG 浓 缩 在 Se h
d
ex
G
一
5 7或 生物
能 合成
细 胞 毒 毒 素肠
。
N
o
te
r 一 。 a n
s证
等 [ 1 〕1n
胶 “P 上层 析5 1
00,
0
。最
后 经 超滤后 作 倍1浓 缩 即
0
实
。,
临 自 标 床本 和 环 境中 离分的 h A 株 多菌
。
为 细胞 兴奋性 肠 毒素 钟
活
该失 肠毒 的分素子 量 为
,
数 ( 93% )能 够 产生该肠 素毒l
][2
儿d s e hu
n纯 化
的 素 不 耐毒 热、
06 ℃ 加2热分 0
检查了 从 泻 腹儿童粪便 中 分离 4 的 株
,
2
hA
发
现其 中4 株 能 生产 细 胞毒 肠 毒 素
01 8 () 认 为9
,6,
。(
三)生 物 活 学
性致
病作用 与 机
理,
Ba
e rr
细胞 毒 毒 素肠的 产 生
株细 胞 兴
奋 肠性 素毒亦 能引 起 家兔小 肠 肠
有 物 型 生或菌 种 的差别 和
和温 单 气 胞 (A
菌。
产
毒菌 株 中 以 Aho
n s as
oo n s
拌的 a液体蓄
积。
,
但 损不 肠伤粘
.
膜
发生其 机
er
o
m
b
r)ai
i
多
,见
是 该 理 肠 素能毒够激 活 肠 上 皮 细胞 膜 上 普
腺而豚 鼠 气 单 胞 菌A(e r o m
( 二见) 肠 毒 素 制 的备、
e
av ae
) 则罕
酸环 化 酶A() 高
,
,导 致
细胞内 A M P水平 的
升
。。
引起肠
上皮 细 胞 的 泌分亢 进 [ 3]
此外
,纯
化 和 理性 化
质 17一 7一
胞细 毒 肠 毒 的 素制 备纯和 方 化法 参可照 上述步
骤行进。
居 于验 动实 肠 物壁 上腹泻 性
,。
,
所
以 未 诱 发 实 验能性
、
A
a s。〔 3
1
〕验 实 得 测 经该
肠
毒
明
确 肠从毒 的 细素 胞溶解 性
肠
活0
素 的 分子 量 5
为
。0
0
,
并指 出细 胞 毒肠毒 素 ,
素 活 性 以毒及 霍乱 肠毒 的 素疫 交免叉 反 应 将 助 于 阐 明有A h 致 人 类疾病所的 病发
。
化学的组 成 A h 与溶血 素 相 同 可
能 同一 是种 子分5 6
℃ 加 5热
认 故为 两者
,
细 胞 毒
肠 毒不素 热耐。
、
机理
分
失 钟活
(
三)生 物学 性活
致 病 作
用 与 机
理C 1〔〕 h o ,
考参文 献
pra A
K
提 ,纯的 细 胞 毒 毒肠 素能引 乳 鼠起 和 兔家肠
拌液 体 积蓄
,
e
t
aol 了 l n M i e r obi l C
:
对iy 细r胞 有 细胞毒 作 用 e
o198 6 2 4 ,66 1 一 664
, 2
R 〔 〕o s eJ
e
M之
:al 力 Ie f t
c 且溶 血具活性
B
, 在 兔 细红 溶胞血试 验中 ,
,每。
m Im
nu
・19
8 95 7
a:
:1 1
6 一 5 11 96 〔 〕a p m ebll C3
微 克
毒素 的溶 血 活 性 高 达 3 溶 1血单 位
J4
D
,
et
9
l Cur r Mi er ob o i l 8 5一
o se
12
,
01~
1 n
ao
n
u
i
nn
g
证 等 〔41 〕
实
细
胞毒 毒 素肠 的溶 血 活已
经 克隆 并 制 绘了A h编
, ( 1 957 ) 证 实
1
6
04
〕 〔 5R
x
,7
I
M
e,
t
a
l I
n
f:ee
,t
Im
m
et
性 和 肠毒 素活 性均能 被 抗A h 溶 血 素 体抗所
1
899
1 170 一 1176
5〔 〕丁 es C
娜卜
抑制
。
hC ka a r b
o
t
r y
lCnE
i Sh m
i73
a
Im m
,p
u
n
ao
: l1928 7434 ~24
6
〔
〕
的 A 码s a溶血 素 ( 即 现 称 细胞为毒 肠毒 )素o 的 因基 段片 和
。
。
ad
Te
:tl J p Jn Me d S e i iB lo2 98魂
K
d si e uh nn
细
1
41 ~ 4 41:
7
〕L j
〔un
h gA
,
et a: l
T
,
o xe
t
ei on
a
胞毒 肠 毒 素 不 能 被志 贺 氏 毒素的 抗 清血 所中
迄
,
今19
82 02 87
7 .8~ 7 49 〔 Li
〕n
,
i
gnhA
l
:该 毒肠素 与 乱霍 肠毒 素 间之抗的幻
。
J T
02
ox
ieo Tlu
o x
neR
v
1 98
3
a
1
:
2 7~ 30, i5
l 原 联 关仍然 不明
[
9〔〕 j
L,
gh
A
e
l
t
T:
o 二
e
i
的,
189
2e
胞 毒细 肠 素在毒 人 类疾病 中的作 已 渐
用379
~
074
1
0〔 〕
Pot
om
始i Jk
23:
t a
l
:
受注关
关,
。
,
e s ‘1 M i l rlh 等 p〔 5 指 i
出 气单 胞 菌引
J
M e
o t
:
d Mo ei r obi l l9 8
17 79~ 1 8
6 n Me i ro ib ol
n
起的 胃肠 炎 与 其细胞 毒 肠毒 素的 产 生密 切
产 毒 性相A h 菌株在 未知 他其 原 因引起
。胃
1
〔 〕 1N198
6t a
2e
3m
r e
a
s
n
S
,et
alJ C i
:
1l1 0 4~ 11 4 2 〔 〕2 Kin d es hu 1
,
肠 道M症 状病 人 中 的 为甚 多
见:: l 丁 C l n Mi eo b ir oll 9 87 2 591 6 ~ 92 1i
迄 ,今 A h 对产肠 毒素 菌 株在 家兔 或小
1 鼠 3〔 A〕 as To
e
t a
:
l In fe e t
Im
m
on
,1 984
e
等
动 物实验性 腹 泻 模型中 未 能 引腹起 泻的
原尚 因 未明潦
。
“
:222~12 7
〔1 〕 4o
Bn
n
9加 VK
t
a
l
:
j L
u
ng
h
认 为可 能 该 与 株对 实
,菌
a
C
Jn M e ri obio l1 9 8
,6
1:32 8 14~8 1 9〔5 〕
1动验 物 模 型缺 乏 侵袭能 力 有关 〔9
即
hA 菌c
AF
e s ilMl h r ipS E
t a
e: l
J M e dM ei r ob o li1 98
6株 因
缺 乏 似类于 大 肠 菌K
I杆和 Fc l
A。
。 、
K
, 。
2 2 、 :3 1 ~1 314
等 定
居 因子
,
由
子这 些 对 物动(
9 91 0年8 2月3 日摘收
肠) 缺壁乏 亲 和有 力 的 附素粘使 A得h 难 以 定
( 上接 封 四)
清 血球隐 菌抗原 和C F S检 表 测
,明
受检
人
,
C S F其检 查 和 三次培 养 均为 阴性
。
的
28
8
名 ( 其6 9
17
中名
具有性 脑假 炎膜 )患 者
,可
以 认 为血 清球 隐菌抗原 存在 的 价 值 是
中
,
名
患 者 现 血 出隐 清球菌 抗原 ,
6。其 中1
受试
病中 隐球人菌 感 染的 项一准 确 敏 和感 的
指标
。例
者患有假 性 脑炎膜
且从 其 SC 中F 检 测出另
一 例清血
抗
原或 从 培 养中离 分到隐 球
菌(
安谊摘
何
民长校)
球 隐菌抗 原 阳 性 但 无 脑 炎膜 体 征和症状 病的
一1
87
一